WWW.LIT.I-DOCX.RU
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - различные публикации
 

«Влияние газовых сред на субстратную специфичность и физико-химические свойства хроматографически очищенной адсорбированной -глюкозидазы растений гороха Ершова А.Н., Фатуллаева А.С. ФГБОУ ВПО ...»

958

УДК 577.151.4

Влияние газовых сред на субстратную

специфичность и физико-химические свойства

хроматографически очищенной адсорбированной

-глюкозидазы растений гороха

Ершова А.Н., Фатуллаева А.С .

ФГБОУ ВПО «Воронежский государственный педагогический университет», Воронеж

Поступила в редакцию 16.04.2012 г .

Аннотация

Получены высокоочищенные препараты адсорбированной на клеточной стенке -глюкозидазы

растений гороха, подвергнутых кратковременному воздействию гипоксии и СО2-среды. Путем высаливания сульфатом аммония и гель-хроматографии на G-25 достигнута степень очистки фермента 22,3 из растений, находящихся в условиях гипоксии и 47,6 - в условиях СО2-среды. Показано, что действие на проростки гипоксии и высоких концентраций диоксида углерода не изменяло скорости элюции фермента при хроматографической очистке на колонке. При нормальной аэрации растений фермент с наибольшей скоростью расщеплял специфический изосукцинимид–-гликозид и р-НФГ и не расщеплял галвактопиранозиды с - и -связями. СО2-среда увеличивала сродство фермента ко всем субстратам, включая и УДФ-глюкозу. В условиях дефицита кислорода и СО2-среды увеличивалась стабильность фермента проростков по отношению к пероксиду водорода и отмечался сдвиг оптимума рН с 4,8 до 4,6 .

Установлено наличие существенных различий адсорбированной на клеточной стенке -глюкозидазы от цитоплазматической растений гороха по физико-химическим свойствам .

Ключевые слова:

-глюкозидаза, адсорбированная, клеточная стенка, горох, хроматографическая очистка, свойства, гипоксия Highly purified preparation of cell wall adsorbed -glucosidase of pea plants exposed to short term hypoxia and CO2-media received. By salting with ammonia sulfate and gel chromatography on G-25 the achieved purification rate for enzyme was 22.3 for plants under hypoxia and 47.6 for under CO2 –media. It was shown that seedlings under hypoxia and high concentrations of carbon dioxide had no changes in elution rate of enzyme under chromatographical purification on the column. Under normal plant aeration the enzyme resolved specific isosuccinimide -glycoside (IS-glycoside), p-nithrophenyl--D-glucopyranoside (pNPG) and did not resolve galactopyranosides with - and -bounds. In contrast CO2-media increased affinity of enzyme to all substrates including uridine diphosphate glucose (UDPG). It was noted that under oxygen deficit and CO2-media the enzyme stability of seedlings increased towards hydrogen peroxide and shift of pH optima from 4.8 to 4.6 was observed .

Presence of significant differences in variety of physicochemical properties for cell wall adsorbed and cytoplasmic glucosidase of pea seedlings was shown .

Keywords:

-glucosidase, cell wall, pea, chromatographical purification, properties, hypoxia Введение

-Глюкозидазы – относятся к классу гидролаз (КФ 3.2.1. 21), катализирующих гидролиз -глюкозидной связи между двумя остатками гликона или связи между глюкозой и алкил- или арилагликоном [1]. Ферменты широко распространены среди микроорганизмов, животных и растений [2,3]. У высших растений –глюкозидазы

Ершова и др. / Сорбционные и хроматографические процессы. 2012. Т. 12. Вып. 6

разделены на несколько групп, которые определяют на основе различий в расщепляемых ими субстратах. При этом встречаются как высокоспецифические ферменты, расщепляющие только определенные субстраты, так и расщепляющие широкий спектр данного типа соединений [4] .





–Глюкозидазы могут локализоваться в различных компонентах растительной клетки, включая цитоплазму, вакуоли и фракции клеточных стенок [5]. Показано, что связанные с клеточной стенкой глюкозидазы участвуют в разрушении олигосахаридов, образующихся при действии эндо--глюканаз, а также в защите растений от фитопатогенных микроорганизмов [6]. Обнаружено, что -глюкозидазы увеличивают свою активность в период роста растений, индуцированного ауксинами [7]. Указывают также на связь между активностью этих ферментов и растяжимостью клеточной стенки растений[8] .

В проростках гороха [5] была обнаружена –глюкозидаза, которая представлена не только цитоплазматической, но и связанными с клеточными стенками молекулярными формами фермента, различающихся по ряду физикохимических свойств. Показано, что их активность менялась в ходе онтогенеза растений гороха [5] и при действии гипоксии [1]. Исследовали физико-химические свойства, включая субстратную специфичность, влияние рН и пероксида водорода на хроматографически очищенный препарат адсорбированной на клеточных стенках

-глюкозидазы растений гороха, находящихся в условиях разных газовых сред .

Эксперимент

Ферментные препараты выделяли из листьев 10-дневных проростков гороха (Рамонский 77), выращенных гидропонным методом на свету. Проростки без корней и семядолей помещали в различные газовые среды: воздух, азот и СО2 (коммерческий из баллонов), которые пропускали через затемненные вакуумэксикаторы в течение 24 часов [1]. Адсорбированную на клеточных стенках

–глюкозидазы выделяли с помощью разработанной схемы [5], которая включала двух кратную обработку 0,1 М фосфатно-цитратным буфером рН 6,0, высаливание белковой фракции сульфатом аммония и дальнейшую очистку фермента гельхроматографией на колонке с G-25 (1,025 см). Все операции по выделению и очистке фермента проводили при 4оC .

В качестве субстратов для фермента использовали различные природные и синтетические арилглюкопиранозиды и дисахариды (0,5-10 мМ). Активность

-глюкозидазы определяли по количеству отщепившейся глюкозы, содержание которой рассчитывали глюкооксидазным методом [10], в случае р-НФГ - по р-нитрофенолу [11]. Оптическую плотность растворов измеряли на СФ-56 (Россия) .

Удельную активность фермента выражали в Е на мг белка, который определяли по Лоури или по поглощению =260 нм. Кинетические параметры (Кm, Vmax) рассчитывали по Лайнуиверу-Берку [9]. Все опыты проводили в 2-кратной биологической и аналитических повторностях. В работе приведены данные типичных опытов .

В работе использовали p-НФГ, салицин, -гентиобиоза, УДФ-глюкоза, р-НФD- и -D- галактопиранозиды, фирмы “Sigma” (США), сефадекс G-25 фирмы “Pharmacia” (Швеция),остальные реактивы марок ч.д.а. – отечественные .

Ершова и др. / Сорбционные и хроматографические процессы. 2012. Т. 12. Вып. 6

–  –  –

Однако удалось достигнуть более высокую степень очистки (47,6) и получить препарат с удельной активностью более чем в два раза выше из растений, если они находились в условиях СО2-среды. Известно [12], что диоксид углерода в высоких концентрациях существенно влияет как на активность, так и на свойства различных ферментов .

–  –  –

Полученные хроматографически очищенные ферментные препараты использовали для определения субстратной специфичности -глюкозидазы в присутствии природных и синтетических субстратов. В качестве природных субстратов выступали: изосукцинимид--гликозид (ИС-гликозид), УДФ-глюкоза, целлобиоза, -гентиобиоза, салицин. К синтетическим отнесли соединения с - или

-глюкозидной связью, типа р-нитрофенил--D-глюкопиранозид (р-НФГ; связь 16), а также р-нитрофенил--D- галактопиранозид или р-нитрофенил--Dгалактопиранозид (связь 16). В табл. 2 приведена активность адсорбированной

-глюкозидазы растений гороха в присутствии различных субстратов. С наибольшей скоростью как показали опыты -глюкозидаза расщепляла специфический для растения гороха ИС-гликозид, агликоном которого служит циклическое производное гамма-аминомасляной кислоты [12]. Подобная высокая скорость расщепления ИСгликозида была ранее показана [10] и для цитоплазматической -глюкозидазы гороха. Фермент расщеплял с достаточно высокой скоростью также и дисахариды, такие как целлобиоза и -гентиобиоза, в которых остатки моносахаридов были связаны 14, 16 -связью. Скорость расщепления салицина, р-НФ--Dгалактопиранозида и р-НФ--D-галактопиранозида была самой низкой из этого типа соединений. Это указывает на то, что исследуемый фермент способен расщеплять широкий спектр арилглюкопиранозидов и дисахаридов, но только с -гликозидной связью, что совпадает с данными для -глюкозидазы из растений риса [13] .

–  –  –

Ершова и др. / Сорбционные и хроматографические процессы. 2012. Т. 12. Вып. 6 При действии газовых сред на растения менялись не только активность фермента по отношению к разным субстратам, но и физико-кинетические характеристики ферментных препаратов, включая Km и Vmax. Как видно из полученных результатов (табл. 3), при действии на растения СО2-среды отмечалось снижение величины Km для -глюкозидазы по отношению ко всем проанализированным природным и синтетическим субстратам .

–  –  –

В тоже время при действии гипоксического стресса на растения снижение величины Km для фермента было наиболее существенным по отношению к салицину и -гентиобиозе. В отношении других субстратов оно было менее выраженным. Это позволяет предположить, что в условиях дефицита кислорода как арилглюкозиды, так и дисахариды могут стать источником глюкозы для процессов дыхательного метаболизма растений, скорость и направление которых значительно меняются у них при гипоксии [12] .

Известно, что в условиях дефицита кислорода в клетках растений меняется содержание разных типов АФК, включая и пероксид водорода [14]. Предполагается, что пероксид водорода, как один из самых стабильных продуктов АФК влияет не только на активность ферментов, но может выступать наряду, с Са2+ в качестве вторичного мессенджера в восприятии сигналов о быстро меняющейся концентрации кислорода в окружающей среде [8]. В связи с этим исследовали влияние различных концентраций пероксида водорода на активность фермента, который выделяли из растений, подвергшихся воздействию гипоксии и СО2-среды .

Как показали наши исследования (рис. 2), присутствие в среде пероксида водорода даже в низкой концентрации, снижало активность -глюкозидазы почти в двое .

При увеличении концентрации пероксида водорода до 1 мМ активность фермента падала на 70%. Дальнейшее возрастание его содержания в среде инкубации уже вызывало почти полную инактивацию фермента. В условиях гипоксического стресса и действии СО2-среды происходили значительные изменения не только кинетических характеристик -глюкозидазы, но и ее стабильности в присутствии высоких концентраций пероксида водорода. Активность фермента падала после действия гипоксии на растения в присутствии 1 мМ пероксида водорода только на 60%, а в СО2-среде - на 55% .

Известно [12], что в условиях гипоксии у растений происходит снижение внутриклеточного рН за счет накопления различных недоокисленных продуктов. В связи с этим изучили активность фермента при разных значениях рН у растений,

Ершова и др. / Сорбционные и хроматографические процессы. 2012. Т. 12. Вып. 6

подвергшихся действию дефицита кислорода и СО2-среды. Ранее было показано [1], что при действии гипоксии у растений гороха для цитоплазматической формы глюкозидазы происходил сдвиг оптимума рН с 5,6 до 5,3. Как показали наши опыты (рис.3) подобный сдвиг оптимума рН наблюдался и для адсорбированной глюкозидазы растений гороха. При действии гипоксии оптимум рН фермента растений составил 4,6, а для СО2-среды – 4,7 .

–  –  –

В результате проведенных исследований впервые было изучено влияние разных газовых сред на физико-химические свойства высокоочищенной адсорбированной на клеточной стенке -глюкозидазы растений гороха. Показано, что действие на растения условий кратковременной гипоксии и СО2-среды не изменяло скорости элюции фермента при хроматографической очистке на G-25, что свидетельствовало о сохранении размеров и молекулярной массы фермента растений в этих условиях. В тоже время отмечалось изменение скорости расщепления выделенными препаратами -глюкозидазы дисахаридов и арилгликозидов. При действии гипоксии на растения обнаружено повышение активности фермента по отношению к -гентиобиозе, целлобиозе и, особенно салицину. В этих условиях изменялись и кинетические параметры фермента, такие как Km и Vmax. Величина Km фермента имела более низкие значения в условиях аэрации для ИС-гликозида и рНФГ, что свидетельствовало о высокой специфичности адсорбированной

-глюкозидазы к данным субстратам. Эта же закономерность наблюдалась и для цитоплазматической формы фермента [1]. Однако, адсорбированная -глюкозидаза с меньшей скоростью расщепляла салицин. Анализ изменения величины Km фермента по отношению к разным субстратам позволяет заключить, что для адсорбированной

-глюкозидазы в стрессовых условиях происходят определенные конформационные

Ершова и др. / Сорбционные и хроматографические процессы. 2012. Т. 12. Вып. 6

изменения, затрагивающие активный центр данного фермента, как предполагалось ранее [5]. Обнаружено, что в условиях СО2-среды оптимум рН фермента оставался на уровне аэрируемых растений в отличие от условий гипоксии, где он снижался с 4,8 до 4,6. СО2-среда в большей степени, чем гипоксический стресс, увеличивала стабильность фермента к высоким концентрациям пероксида водорода, который накапливался при этих условиях в клетках растений. Полученные данные подтверждают высказанное ранее предположение [5] о специфичности воздействия диоксида углерода на метаболические процессы растений, которое не связано со сдвигом рН, а является следствием воздействия его на ферментные системы клеток .

В тоже время вызванные СО2-средой изменения в субстратной специфичности фермента, его кинетических параметров (Km, Vmax), степени влияния пероксида водорода на активность, в том числе трансгликозидазную активность [9], показали существенные отличия адсорбированной -глюкозидазы растений гороха от ее цитоплазматической молекулярной формы. Это позволяет предположить выполнение разных функций этими молекулярными формами фермента, которые и проявляются в стрессовых условиях .

Список литературы

1. Ершова А.Н., Баркалова О.Н. Выделение, хроматографическая очистка и свойства -глюкозидазы растений гороха, подвергнутых воздействию гипоксии и СО2-среды // Сорбционные и хроматографические процессы. 2009. Т.9. Вып.5. С .

714-721 .

2. Gerardi C., Blando F., Santino A., Zacheo G. Purification and characterisation of a glucosidase abundantly expressed in ripe sweet cherry (Prunus avium L.) fruit // Plant Science. 2001. Vol. 160. P. 795-805 .

3. Kazuhiro I., Kouichi T., Hitoshi K., Hitoshi S., Kiyoshi I. Purification and characterization of extracellular and cell wall bound -glucosidases from Aspergillus kawachii // Biosci., Biotechnol. and Biochem. 1998. Vol. 62. P. 1938-1946 .

4. Labavitch J.M. and Ray P.M. Turnover of cell wall poliysaccharides in elongating pea stem segments // Plant Physiоl. 1974. Vol.53. P. 669-673 .

5. Ершова А.Н., Гущина Н.А. Выделение клеточносвязанных форм –глюкозидазы проростков гороха, их очистка и изменение в онтогенезе // Сорбционные и хроматографические процессы. 2003. Т.3. Вып.6. С. 758-766 .

6. Туран Ю., Женг М. Очистка и характеристика внутриклеточной –глюкозидазы метилотрофных дрожжей Pichia pastoris // Биохимия. 2005. Т.16. Вып.2. С. 322-325 .

7. Verdoucq L., Moriniere J., Bevan D.R., Esen A., Vasella A.Structural determinants of substrate specificity in family 1 бета- glucosidases. Novel insights from the crystal structure of sorghum dhurrinase-1, a plant бета-glucosidase with strict specificity, in complex with its natural substrate // J. Biol. Chem. 2004. V. 279. №30. P. 31796-31803 .

8. Горшкова Т.А. Растительная клеточная стенка как динамическая система, М:

Наука, 2007, 429 с .

9. Ершова А.Н., Баркалова О.Н., Фатуллаева А.С. Влияние гипоксии и СО2-среды на трансгликозидазную активность цитоплазматической и связанных с клеточной стенкой молекулярных форм –глюкозидазы растений гороха // Вестник ВГУ, Серия: Химия. Биология. Фармация. 2011, №2. C. 88-91 .

10. Винокурова Н.В., Ершова А.Н. Очистка, физико-химические свойства

–глюкозидазы растений гороха // Теория и практика сорбционных процессов. 2000 .

С. 251-257 .

Ершова и др. / Сорбционные и хроматографические процессы. 2012. Т. 12. Вып. 6

11. Захарова Н.С., Петрова Т.А. –глюкозидазы листьев и корнеплодов столовой свеклы Beta vulgaris // Прикладная биохимия и микробиология. 2000. Т.36, №4. С .

458-461 .

12. Ершова А.Н. Метаболическая адаптация растений к гипоксии и повышенному содержанию диоксида углерода. – Воронеж: ВГУ. 2007. 264 с .

13. Takashi A., Hanae K., Naoto S. A cell wall-bound –glucosidase from germinated rice: purification and properties // Phytochemistry. 1997. Vol. 48. P. 49-54 .

14. Ершова А.Н., Попова Н.В., Бердникова О.С. Продукция активных форм кислорода и антиоксидантные ферменты растений гороха и сои при гипоксии и высоком содержании СО2 в среде // Физиология растений., 2011, Т.58, № 5, С. 1–10 .

– Ershova Antonina N. – Head of Plant and Ершова Антонина Николаевна заведующая кафедрой биологии растений и Animal Biology Department, Doctor of Biology, животных, доктор биологических наук, Professor, Voronezh State Pedagogical University, профессор, Воронежский государственный email: aershova@vspu.ac.ru педагогический университет, Воронеж Фатуллаева Айнур Садулла кызы – Fatullaeva Aynur S. – 2nd year post-graduate аспирант 2 года обучения кафедры биологии student, Department of Plant and Animal Biology, растений и животных Воронежский Voronezh State Pedagogical University, Voronezh государственный педагогический университет, Воронеж Ершова и др. / Сорбционные и хроматографические процессы. 2012. Т. 12. Вып. 6






Похожие работы:

«Министерство образования Российской Федерации УТВЕРЖДАЮ Заместитель Министра Л.С. Гребнев _ 2002 г. Регистрационный номер 17.00.00 ВТ ППО-2002 Временные требования к основной образовательной программе послеву...»

«МИССИОНЕРСТВО КУЛЬТУРОЛОГИЯ А. Л. Доброхотов (д.ф.н., проф. МГУ, ПСТГУ) ИДЕЯ КУЛЬТУРЫ У ВЯЧЕСЛАВА ИВАНОВА (В СВЕТЕ ОНТОЛОГИИ МЕЛОПЕИ "ЧЕЛОВЕК") Чтобы оценить вклад Вячеслава Иванова в культурфилософскую традицию, полезно будет вкратце рассмотреть его творческий путь, в котором поучительно отразились искания его эпо...»

«Министерство образования и науки Российской Федерации Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Владимирский государственный университет имени Александра Григорьевича и Николая Григорьевича Столетовых" Т.И. Матяр О. Е.Ефимова Е.В. Князькова Моя специальность – таможе...»

«Химический факультет СПбГУ Академическая гимназия СПбГУ Петербургское отделение Российского химического общества им. Д. И. Менделеева Санкт-Петербургская Академия постдипломного педагогического образования Центр одаренных...»

«Подписной индекс в каталоге "Пресса России" 39898 ISSN 1680-1709 ББК 95.4 Ч-823 ВЕСТНИК ЧУВАШСКОГО ГОСУДАРСТВЕННОГО ПЕДАГОГИЧЕСКОГО УНИВЕРСИТЕТА ИМЕНИ И. Я. ЯКОВЛЕВА 2011. № 2 (70). Ч. 2 Серия "Гуманитарные и педагогические науки" Учредитель ФГБОУ ВПО "Чувашский государственный педагогический университе...»

«022691 B1 Евразийское (19) (11) (13) патентное ведомство ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ (12) (51) Int. Cl. A61K 36/76 (2006.01) (45) Дата публикации и выдачи патента B01D 11/02 (2006.01) 2016.02....»

«Москва АСТ УДК 821.161.1 ББК 84 (2Poc=Pyc)6 А13 Дизайн обложки: Юлия Межова В книге и на обложке использованы иллюстрации Елены Станиковой Макет подготовлен редакцией Абгарян Наринэ Юрьевна А13 Всё о Манюне / Наринэ Абгарян. — Москва: АСТ, 2015.— 861, [1] с. ISBN 978-5-17-082423-6 У меня была заветная мечта...»







 
2018 www.lit.i-docx.ru - «Бесплатная электронная библиотека - различные публикации»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.