«СПЕРМА ВЫ КОВ НЕРАЗБАВЛЕННАЯ гост Методы биологических исследований 20909.4-75 Non-diluted sperm of bulls Methods of biological tests Постановлением Государственного комитета ...»

УДК 619:611-013.11:620.193.8(063.74) Группа Р39

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ СОЮЗА ССР

СПЕРМА ВЫ КОВ НЕРАЗБАВЛЕННАЯ

гост

Методы биологических исследований

20909.4-75

Non-diluted sperm of bulls

Methods of biological tests

Постановлением Государственного комитета стандартов Совета Министров СССР

от 19 сентября 1975 г. № 2440 срок действия установлен с 01.07,76 до 01.07.81 Несоблюдение стандарта преследуется по закону Настоящий стандарт распространяется на неразбавленную свежеполученную сперму быков и устанавливает методы испытаний биологических свойств спермы — подвижности спермиев, абсо­ лютной выживаемости и выживаемости спермиев в часах, осмоти­ ческой (физиологической) резистентности, активности дегидроге­ наз и резистентности спермиев к холодовому шоку .

1. МЕТОД ОТБОРА ПРОБ

1.1. Отбор проб — по ГОСТ 20909.1—75 .

1.2. Для проведения испытаний используют сперму, хранившу­ юся при температуре 30—35°С не более 30 мин с момента ее по­ лучения .

2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПОДВИЖНОСТИ СПЕРМИЕВ

Сущность метода заключается в определении количества спер­ миев с прямолинейным поступательным движением .

2.1.0борудование и реактивы 2.1.1. Для проведения испытания применяют:

микроскоп биологический марки МБИ или МБР по ГОСТ 8284—67;

термостат ТМ-1 или другой конструкции, снабженный стандарт­ ным контактным или нестандартным однотемпературным термо­ метром;

Издание официальное Перепечатка воспрещена кардиган связанный ГОСТ 20909.4— 75 Стр. 2 стекла покровные по ГОСТ 6672—59;

стекла предметные по ГОСТ 9284— 59;

стекла предметные с углублением;

палочки стеклянные или пипетки пастеровские;

натрий лимоннокислый трехзамещенный по ГОСТ 5.1314—72, 3%-ный раствор;

натрий хлористый по ГОСТ4233—66, 1%-ный раствор .

2.2. П о д г о т о в к а к и с п ы т а н и ю 2.2.1. Подготовка и стерилизация лабораторной посуды — по ГОСТ 20909.2—75 .

2.2.2. Термостат включают за 20— 30 мин до начала работы .

Температура в термостате должна быть 40— 42°С .

2.2.3. Предметные и покровные стекла, стеклянные палочки, пипетки и растворы подогревают до 35—40°С .

2.3. П р о в е д ен и е и с п ы т а н и я 2.3.1. Подвижность спермиев определяют в раздавленной капле спермы под микроскопом в проходящем свете при увеличении 100— 180х. Более точно количество живых и мертвых спермиев оп­ ределяют в счетной камере по ГОСТ 20909.3—75 .

2.3.2. При определении подвижности спермиев под микроскопом наносят на предметное стекло теплой стерильной стеклянной па­ лочкой или пастеровской пипеткой небольшую каплю спермы, к ко­ торой добавляют двух-четырехкратное количество 3%-ного раст­ вора лимоннокислого натрия. Сперму с раствором лимоннокисло­ го натрия тщательно перемешивают и накрывают покровным стеклом. Просматривают под микроскопом весь препарат. П од­ счет спермиев прсизводят не менее чем в трех полях зрения мик­ роскопа с наибольшей подвижностью спермиев. Подсчитывают ко­ личество спермиев с прямолинейным поступательным движением и отдельно — количество спермиев с неправильным движением — манежным (перемещение по кругу), колебательным (спермин не перемещаются, но производят движение головкой или хвости­ ком) и мертвых спермиев .

2.4. О б р а б о т к а р е з у л ь т а т о в 2.4.1. Подвижность спермиев (Я с ) в баллах вычисляют по формуле где п — общее число подсчитанных спермиев;

п\ —' число подсчитанных спермиев с прямолинейным посту­ пательным движением;

1 0 — постоянный к оэффициент .

З а окончательный результат испытания принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений. Ми­ нимальной подвижностью спермиев принято считать подвижность, равную 0,5 балла .

Стр 3 ГОСТ 20909 4— 75

3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АБСОЛЮТНОЙ ВЫЖИВАЕМОСТИ

И ВРЕМЕНИ ВЫЖИВАЕМОСТИ СПЕРМИЕВ

–  –  –

где Т „ — время, прошедшее от начала испытания до последнего дня испытания, ч .

Результаты испытаний по определению подвижности спермиев при вычислении абсолютной выживаемости и выживаемости спер­ миев в часах записывают в журнале испытаний. Форма журнала для записи результатов испытаний, а также примеры вычислений абсолютной выживаемости спермиев, интервала времени и выжи­ ваемости спермиев в часах приведены в приложениях 1 и 2 .

4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСМОТИЧЕСКОЙ (ФИЗИОЛОГИЧЕСКОЙ)

РЕЗИСТЕНТНОСТИ СПЕРМИЕВ

Сущность метода заключается в определении устойчивости спермиев к действию гипотонического раствора хлористого натрия .

4.1. О б о р у д о в а н и е и р е а к т и в ы 4.1.1. Для проведения испытания применяют:

микроскоп биологический марки МБИ или М БР по ГОСТ 8284—67;

термостат ТМ-1 для микроскопа;

флаконы вместимостью 10— 15 мл или пробирки;

микропипетки стеклянные по ГОСТ 12487— 67;

колбы стеклянные вместимостью 100—500 мл по ГОСТ 12487—67;

стекла предметные по ГОСТ 9281— 59;

стекла покровные по ГОСТ 6672—59;

Стр. 5 ГОСТ 20909.4—75

–  –  –

При исследовании большого количества проб спермы раствор хлористого натрия в концентрациях от 0 6 до 0,1% готовят в д е­ вяти колбах, затем из каждой колбы переносят мерной стеклянной пипеткой по 5 мл раствора в заранее приготовленные флаконы или пробирки .

4.2.3. Приготавливают по две пробирки с раствором хлористо­ го натрия каждой из указанных в таблице концентраций. Про­ бирки закрывают резиновыми пробками, обернутыми пергамент­ ной бумагой, и ставят в термостат при температуре 3D— -35“С на 10— 15 мин .

4.3. П р о в е д е н и е и с п ы т а н и я 4.3.1. В каждую пробирку с раствором хлористого натрия теп­ лой микропипеткой вносят по 0,025 или 0,05 мл испытуемой спер­ мы. Получают разбавление от 1:100 до 1:200 .

Пробирки с разбавленной спермой выдерживают 3 ч п р и тем­ пературе 18—2Т С .

Подвижность спермиев в раздавленной капле определяют по п. 2.3 без добавления раствора лимоннокислого натрия .

4.4. О б р а б о т к а р е з у л ь т а т о в 4.4.1. Осмотическую резистентность спермы (R 0 ) выражают ГОСТ 20909.4— 7$ Стр. 6 значением концентрации раствора хлористого натрия, при которой подвижность спермиев составляет не менее 0,5 балла. Чем ниже концентрация раствора хлористого натрия, в котором спермин ос­ таются живыми, тем выше осмотическая резистентность спермы .

Пример. В пробирке № 8 (0,15%-ный раствор хлористого на­ трия) определена единичная подвижность спермиев, а в пробирке № 7 (0,2%-ный раствор хлористого натрия) подвижность сперми­ ев 0,5 балла. Следовательно, значение осмотической резистентнссти спермы равно 0,2. Или, если в пробирке № 8 мертвые спер­ мин, в пробирках № 7 и 6 единичная подвижность спермиев, а в пробирке № 5 (0,3%-ный раствор хлористого натрия) подвиж­ ность — 0,5 балла. Следовательно, осмотическая резистентность спермы равна 0,3 .

4.4.2. Коэффициент резистентности (Як) вычисляют по фор­ муле где 0,1 — постоянный коэффициент;

R о— осмотическая резистентно сть (концентрация раствора хлористого натрия, %) .

5. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ДЕГИДРОГЕНАЗ НОЙ АКТИВНОСТИ СПЕРМЫ

Сущность метода заключается в определении скорости обес­ цвечивания метиленовой сини, добавленной к сперме .

Скорость обесцвечивания метиленовой сини зависит от актив­ ности дегидрогеназ-ферментов дыхания спермиев .

Дегидрогеназную активнсегь спермы определяют в капиллярах или в пробирках .

5.1. М е т о д о п р е д е л е н и я д е г и д р ог е н а з н о й а к ­ т и в н о с т и спермы в капил ляр ах 5.1.1. Оборудование и реактивы

Для проведения испытания применяют:

термостат ТМ-1 для микроскопа;

термометр по ГОСТ 2Я5—73;

термостат или ультратермостат, или баню водяную;

секундомер по ГОСТ 5072—72;

стекла предметные по ГОСТ 9284—5Э;

пн пет* и глазные и пастеровские;

трубочки стеклянные длиной 5—S см с внутренним диаметром 0,8—1,0 мм или катетеры от шприцов для искусственного осеме­ нения коров;

натрий хлористый по ГОСТ 4233—66;

синь метиленовую 0,01%-ный раствор;

воду дистиллированную по ГОСТ 6709—72 .

5.1.2. Подготовка к испытанию Стр. 7 ГОСТ 20909.4— 75 5.1.2.1. Концентрацию спермиев в сперме определяют п ГОСТ 20909.5—75 .

5.1.2.2. Подвижность спермиев определяют по п. 2.3 .

Раствор метиленовой сини готовят, растворяя 0,01 г метилено­ вой сини и 0,9 г хлористого натрия в 190 мл дистиллированной воды .

5.1.3. Проведение испытания На чистое предметное стекло, подогретое до 30—37“С, наносят 0,05 мл (каплю) спермы и добавляют теплой пипеткой такое же количество (каплю) 0,01%-ного раствора метиленовой сини, подо­ гретой до 30°С. Смесь спермы с краской тщательно смешивают и набирают ее в теплую (30—37°С) стеклянную трубку, рассчиты­ вая, чтобы высота столбика смеси составляла 2—3 см. Столбик смеси, не содержащий пузырьков воздуха, располагают в центре трубки .

Трубочку, заполненную смесью опермы с метиленовой синью, помещают в термостат при температуре 37*0,5°С на лист белой бумаги в горизонтальном положении. Записывают время начала испытания и окончания обесцвечивания метиленовой сини. При этом учитывают, что концы столбика (1—2 мм) обычно не обес­ цвечиваются .

5.1.4. Обработка результатов 5.1.4.1. Дегидрогеназную активность спермы выражают в ус­ ловных единицах .

За единицу активности принимают такую активность, когда 1 млрд, спермиев обесцвечивает за 1 мин 0,05 мл 0,01%-ного ра­ створа метиленовой сини (0,000005 г порошка метиленовой сини) .

5.1.4.2. Дегидрогеназную активность спермы ( Д а) в условных единицах вычисляют по формуле _ Яс--С п М&— ю »

где П с — подвижность спермиев, баллы;

t — время обесцвечивания метиленовой сини в опыте,мин;

С — концентрация спермы, млрд/мл;

10 — постоянный коэффициент .

За окончательный результат испытания принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений .

Допускаемые расхождения между результатаии двух парал­ лельных определений не должны превышать ±10% .

5.2. Метод определения д е г ид р оге н а з ной ак­ тивности спермы в пробирках 5.2.1. Оборудование и реактивы

Для проведения испытания применяют:

термостат ТМ-1 для микроскопа;

термометр по ГОСТ 215—73;

термостат или ультратермостат, или баню водяную;

ГОСТ 20909.4— 75 Стр. 8 секундомер по ГОСТ 5072—72;

стекла предметные по ГОСТ 9284— 59;

пипетки стеклянные вместимостью 1 мл по ГОСТ 12487—67;

колбы стеклянные по ГОСТ 12487— 67;

пробирки стеклянные вместимостью 5 мл и диаметром 1 см;

синь метиленовую, 0,05%-ный раствор;

натрий лимоннокислый по ГОСТ 5.1314—72;

масло вазелиновое по ГОСТ 3164—52, хл.;

глюкозу по ГОСТ 4233—66;

воду дистиллированную по ГОСТ 6709—72 .

5.2.2. Подготовка к испытанию 5.2.2.1. Приготовляют глюкозо-цитратный раствор на прокипя­ ченной дистиллированной воде, для чего растворяют в колбе вме­ стимостью 100 мл 3 г глюкозы и 1,4 г лимоннокислого натрия .

Раствор доводят до метай водой .

5.2.2.2. Раствор мэтиленоной сини готовят на прокипяченной дистиллированной воде, растворяя в мерной колбе вместимостью 100 мл 3 г глюкозы, 1,4 г цитрата натрия и 0,05 г метиленовой сини. Объем раствора доводят до метки .

5.2.2.3. Концентрацию спермиев определяют по ГОСТ 20909.5—75 .

5.2.3. П роведение испытания В чистую, подогретую до 30—37°С стеклянную пробирку вно­ сят 0,8 мл теплого (37—45°С) глюкозо-цитратного раствора, добав­ ляют 0,1 мл 0,05%-ного раствора метиленовой сини и 0,2 мл спермы. Содержимое тщательно перемешивают и наслаивают очи­ щенное вазелиновое масло в таком количестве, чтобы получился столбик масла высотой 0,5— 1,0 см .

Пробирки со смесью ставят в термостат или в водяную баню при температуре 45°С и учитывают время обесцвечивания метиле­ новой сини .

Допускается одновременно определять показатель выживаемо­ сти спермиев при температуре 45*С. Для этого через каждые 10— 15 мин из пробирок берут пробу стеклянной палочкой и оценива­ ют подвижность спермиев по п. 2.3 .

5.2.4. Обработка результатов Дегвдрогеназную активность спермы и коэффициент дегидрогеназиой активнасгн вычисляют по пп. 5.1.4 и 5.1.5 .

6. ОПРЕДЕЛЕНИЕ РЕЗИСТЕНТНОСТИ СПЕРМИЕВ

К ХО Л О Д О ВО М У Ш ОКУ

Сущность метода заключается в определении выживаемости спермиев после быстрого их охлаждения до температуры 1— 3°С .

6.1. О б о р у д о в а н и е и р е а к т и в ы 6.1.1. Для проведения испытания применяют:

микроскоп биологический марки МБИ или МБР по ГОСТ 8284—67;

Стр. 9 ГОСТ 20909.4—7$ термостат ТМ-1 для микроскопа;

стекла предметные по ГОСТ 9284—59;

стекла покровные размером 18x18 или 24 X 24 мм го ГОСТ 6672—59;

палочки стеклянные или пипетки пастеровские;

флаконы вместимостью 2 мл;

глюкозу по ГОСТ 6038—74, 6%-ный раствор .

6.2. П о д г о т о в к а к и с п ы т а н и ю 6.2.1. Перед началом работы готовят на прокипяченной дистил­ лированной воде 6%-ный раствор глюкозы, растворяя 6 г глюкозы в мерной колбе вместимостью 100 мл. Объем раствора доводят во­ дой до метки. Приготовленный раствор разливают по 1—2 мл в пробирки или флаконы из расчета на каждую пробу спермы не менее трех пробирок .

Готовят ванну со льдом с температурой 2±ГС, в которую не менее чем за 5 мин до начала исследования ставят для охлажде­ ния по две из трех пробирок. Третью пробу с 6%-ным раствором глюкозы ставят в термостат при температуре 37—40°С .

Подвижность слермиев определяют по п. 2.3 .

6.3. П р о в е д е н и е и с п ы т а н и я 6.3.1. Одну-две капли неразбавленной спермы, выдержанной при комнатной температуре не менее 10 и не более 30 мин, вносят стеклянной пипеткой в пробирки или флаконы с 6%-ным раство­ ром глюкозы, охлажденной до 2±ГС, и в пробирку с раствором, подогретым до 37—40°С. Выдерживают 5 мин. Подвижность спер­ миев определяют под микроскопом по п. 2.3 .

6.4. О б р а б о т к а р е з у л ь т а т о в 6.4.1. Резистентность снермиев к холодовому шоку ( R x ) вы­ числяют по формуле

–  –  –

Пункты 2.1 .

1, 4.1.1. Заменить ссылки: ГОСТ 8284—67 на ГОСТ 8284—78, ГОСТ 6672—59 на ГОСТ 6672—75, ГОСТ 9284—59 на ГОСТ 9284—75, ГОСТ 4233—66 на ГОСТ 4233—77 .

Пункты 2.1 .

1, 5:2.1. Заменить ссылку: ГОСТ 5.1314—72 на ГОСТ 22280— 76 .

Пункт 4.1 .

1. Заменить слова: «микропипетки стеклянные по ГОСТ 12487—67» на «микропипетки стеклянные» .

Пункты 5.1 .

1, 5.2.1. Заменить ссылки: ГОСТ 5072—72 на ГОСТ 5072—79, ГОСТ 9284—50 на ГОСТ 9284—75, ГОСТ 4233—66 на ГОСТ 4233—77 .

Раздел 5 дополнить новым пунктом — 5.1.4.3:

«5.1.4.3. Коэффициент дегидрогеназной активности (/(Да) вычисляют по формуле (Продолжение см. стр. 236) (Продолжение изменения к ГОСТ 20909.4—75) где Д а — дегидрогеназная активность» .

Пункт 5.2 .

1. Заменить слова и ссылки: «пипетки стеклянные вместимостью 1 мл по ГОСТ 12487—67» на «пипетки стеклянные вместимостью 1 мл по ГОСТ 20292—74», ГОСТ 12487—67 на ГОСТ 1770—74, ГОСТ 3164—52 на ГОСТ 3164—78 .

Пункт 5.2 .

4. Исключить слова: «и 5.1.5» .

Пункт 6.1 .

1. Заменить ссылки: ГОСТ 8284—67 на ГОСТ 8284—78, ГОСТ 9284—59 на ГОСТ 9284—75, ГОСТ 6672—59 на ГОСТ 6672—75, ГОСТ 6038на ГОСТ 6038—79 .

Приложение 1. Графа «Последовательные интервалы времени, t, ч». Заме­ нить значение: 26 на 36;

графа а. Для 12-го дня проведения испытаний заменить знак:— на ЕП (3 раза) .

(ИУС № 8 1981 г.) ГОСТ 20909.4-75