WWW.LIT.I-DOCX.RU
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - различные публикации
 


«СИМОНЯН Алина Руслановна НОВЫЕ ГИДРОКСИЛАМИНСОДЕРЖАЩИЕ АНАЛОГИ АГМАТИНА И БИОГЕННЫХ ПОЛИАМИНОВ ...»

На правах рукописи

СИМОНЯН Алина Руслановна

НОВЫЕ ГИДРОКСИЛАМИНСОДЕРЖАЩИЕ

АНАЛОГИ АГМАТИНА И БИОГЕННЫХ ПОЛИАМИНОВ

03.00.03 - Молекулярная биология

02.00.10 - Биоорганическая химия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата химических наук

Москва 2008

Работа выполнена в Лаборатории молекулярных основ действия

физиологически активных соединений Учреждения Российской академии наук

Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН

Научный руководитель: кандидат химических наук А.Р. Хомутов

Официальные оппоненты: доктор химических наук А.А. Формановский доктор химических наук Т.В. Демидкина

Ведущая организация: Научно-исследовательский институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова 1 т lib*

Защита диссертации состоится « J- » в1 М РД 2008 г. в ' часов на заседании диссертационного Совета Д 002.235.01 по присуждению ученой степени доктора наук в Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта по адресу: 119991, Москва, ул .

Вавилова, д. 32 .

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИМБ им. В.А. Энгельгардта РАН (119991, Москва, ул. Вавилова, д. 32) Автореферат разослан « ' » ^5*uVjt 2008 г .

Ученый секретарь диссертационного Совета кандидат химических наук f/IC/^f A.M. Крицын /

Список использованных сокращений:

AdoMet - 5-аденозилметионин;

AdoMetDC-S-аденозилметиониндекарбоксилаза;

Agm - агматин (1-гуанидино-4-аминобутан);

AO-Agm- 1-аминоокси-З-гуанидинопропан;

AOSpm - аминооксиспермин (1-аминоокси-3,8-диаза-11 -аминоундекан);

АРА- 1-аминоокси-З-аминопропан;

ArgDC - аргининдекарбоксилаза;

BAOSpm - бмс-аминооксиспермин (1,10-диаминоокси-3,8-диазадекан);

Вое - тирш-бутилоксикарбонил;

Cbz - бензилоксикарбонил;

dcAdoMet - декарбоксилированный S-аденозилметнонин;

DMF - диметилформамид;

DTT - дитиотрейтол;

GAPA- 1-гуанидиноокси-З-аминопропан;

NGPG- 1-гуанидиноокси-З-гуанидинопропан;

Ns - о/тео-нитрофенилсульфонил;

ODC - орнитиндекарбоксилаза;

oxa-Spm - окса-спермин (1,12-диамино-4,9-диаза-5-оксадодекан);

РАО - полиаминоксидаза;

PLP - пиридоксаль-5'-фосфат;

Put - путресцин (1,4-диамияобутан);

SAG - солюсурьмин (динатриевая соль комплекса Sb5+ и глюконовой кислоты);

SMO - сперминоксидаза;

Spd - спермидин (1,8-диамино-4-азаоктан);

Spm - спермин (1,12-диамино-4,9-диазадодекан);

SSAT - спермидин/спермин-Л^-ацетилтрансфераза;

THF - тетрагидрофуран .

–  –  –

Актуальность проблемы. Биогенные полиамины спермин, спермидин и их предшественник пугресцин присутствуют в значительных количествах в животных клетках всех типов и необходимы для их нормального роста. При физиологическом значении рН полиамины существуют в форме поликатионов. Спермидин и спермин взаимодействуют с ДНК, РНК и нуклеопротеидами, служат регуляторами активности топоизомераз, рестриктаз, а также ферментов биосинтеза ДНК и РНК, а спермидин, являясь единственным донором аминобутильной группы в дезоксигипузинсинтазной реакции, необходим для посттрансляционной модификации фактора инициации трансляции еГР-5А, присутствующего у всех эукариот. Кроме того, полиамины участвуют в регуляции транспорта Са + митохондриями, являются модуляторами NMDA рецептора и эффекторами транспорта К+. Разнообразие и жизненная важность клеточных функций позволяют рассматривать спермин и спермидин в качестве низкомолекулярных регуляторов клеточного метаболизма .





Продуктивным подходом к выяснению роли и функций полиаминов и агматина в клетке является изучение биохимических эффектов их аналогов. Соответственно, направленное создание новых биологически активных производных полиаминов, исследование их взаимодействий с ферментами метаболизма спермидина и спермина, а также эффектов этих соединений in vitro и in vivo представляется весьма актуальным .

Целью работы является создание оригинальных биологически активных гидроксиламинсодержащих аналогов спермина и агматина, пригодных для изучения клеточных функций полиаминов и ферментов их метаболизма. Соответственно были поставлены следующие задачи: разработать удобные способы получения аминоокси- и окса-аналогов спермина; создать на их основе ингибиторы спермин/спермидин JV1ацетилтрансферазы, представляющие собой стабильные аналоги промежуточного бисубстратного комплекса ферментатиной реакции; разработать новый удобный метод гуанидилирования аминооксигруппы; создать набор оригинальных гидроксиламинсодержащих аналогов агматина и изучить их взаимодействие с Leishmania donovani .

Научная новизна. Разработаны удобные схемы синтеза аминоокси- и оксааналогов спермина, позволяющие получать эти соединения с высокими выходами из доступных исходных веществ. Получен набор новых ингибиторов спермин/спермидин Л^-ацетилтрансферазны, хорошо моделирующих промежуточный бисубстратный комплекс, возникающий в ходе ферментативного ацетилирования спермидина .

Предложен новый метод гуанидилирования аминооксигруппы, позволяющий с высокими выходами получать функционально-замещенные алкоксигуанидины, что привело к набору неизвестных ранее аминооксианалогов агаатина. Показано, что 1-гуанидинооксиаминопропан, активно проникая в Leishmania donovani, эффективно подавляет размно­ жение этого паразита .

Практическая ценность работы. Разработан общий метод синтеза функционально-замещенных алкоксигуанидинов, который позволяет получать эти неизвестные, или малодоступные ранее, соединения с практически количественными выходами. Синтезированный по этому методу 1-гуанидиноокси-З-аминопропан эффективно ингибирует размножение Leishmania donovani, в том числе формы, резистентные к сурьмасодержащим препаратам, что открывает новые возможности для практической полиаминотерапии лейшманиоза. Стабильные аналоги промежуточного бисубстратного комплекса спермин/спермидин-Л^-ацетилтрансферазной реакции предс­ тавляют собой практически значимый инструмент исследования активного центра этого ключевого фермента катаболизма полиаминов, в том числе и методами рентгеноструктурного анализа .

Апробация работы. Отдельные части работы докладывались на:

VII Международной Путинской школе-конференции молодых ученых "Биология наука XXI века" (Пущино, 2003 г.); International Conference for Young Scientists and Ph.D .

Students on Molecular Biology and Genetics (Kiev, Ukraine, 2003 г.); VII Международной Энгельгардтовской конференции (Суздаль, 2004 г.); XVII International Roundtable on Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids (Bern, Switzerland, 2006 г.); International Conference "Polyamine: Forty Years of Mammalian Ornithine Decarboxylase" (Kuopio, Finland, 2008 г.) .

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 статей .

Объем диссертации. Диссертация изложена на страницах и состоит из введения, обзора литературы, обсуждения полученных результатов, экспериментальной части и выводов. Материал иллюстрирован таблицами, рисунками и схемами. Список цитированной литературы включает наименований .

Работа выполнена при финансовой поддержке грантами РФФИ: 03-04-49080_а, 06-04-4963 8_а, 08-04-91317-ИНД_а, 08-04-91777-АФ_а; а также Федеральной целевой программой "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технического комплекса России" (Госконтракт № 02.512.11.2237) .

Введение. Полиамины спермин (Spm) и спермидин (Spd) присутствуют в клетках различных типов и жизненно необходимы для их нормального роста. Высокое внутри­ клеточное содержание Spm и Spd определяет разнообразие их клеточных функций, мно­ гие из которых остаются все еще малоизученными, что обеспечивает поступательное развитие этой области биохимии [Cohen S.S A guide to the polyamines. New York: Oxford University Press. 1998] .

–  –  –

Спермин (Spm) Рис.1. Метаболизм полиаминов. /JrgBC-аргининдекарбоксилаза; ODC -орнитиндекарбоксилаза;

/4АМеФС-5-аденозилметиониндекарбоксилаза; SMO - сперминоксидаза;

SSAT- спермин/спермидин-Л^-ацетилтрансфераза; РАО- полиаминоксидаза;

AdoMet - S-аденозилметионин; dc-AdoMet - декарбоксилированный 5-аденозилметионин .

Метаболизм полиаминов включает в себя несколько ферментов, ключевыми из которых являются на путях биосинтеза PLP-зависимая ODC и пируватзависимая AdoMetDC, а на путях катаболизма - SSAT (Рис. 1). Все эти ферменты весьма короткоживущие (время жизни в клетке - 30 мин.), а их активность и биосинтез определяются, в том числе, внутриклеточным содержанием полиаминов. Недавно в животных клетках была обнаружена SMO, флавинзависимый фермент, окисляющий Spm в Spd без предва­ рительного -ацетшшрования [Wang Y.et al, Cancer Res. 2001, 6_L 5370; Murray-Stewart Т., et al, Biochem, J. 2002, 368. 673]. Таким образом, деградация Spm может происходить двумя независимыми путями .

Избирательное регулирование активности ферментов метаболизма полиаминов широко используется при изучении биохимических функций Spm и Spd. Повышенное содержание полиаминов в опухолевых клетках, по сравнению с нормальными, делает задачу истощения пула Spm и Spd весьма актуальной. Первоначально основное внимание уделялось созданию специфических ингибиторов AdoMetDC и ODC, что привело к набору веществ, эффективно действующих в культуре клеток, но, как правило, сущест­ венно менее активных in vivo [Seller N. Curr. Drug Targets 2003, 4, 537]. Последнее связа­ но с тем, что клетки эукариот имеют систему активного транспорта полиаминов, а экзо­ генные Spm и Spd способны полностью заменять полиамины, синтезируемые клеткой .

Начиная с середины 90-х годов, активация ферментов катаболизма полиаминов, ключевым из которых является SSAT, стала рассматриваться в качестве универсального алгоритма истощения внутриклеточного пула Spm и Spd. Были найдены вещества (в основном, терминальноfoc-алкилированныепроизводные Spm и его гомологов), повы­ шающие клеточную активность SSAT в десятки и сотни раз и обладающие выраженной цитостатической и противоопухолевой активностью [Casero, R.A. & Marton L.J Nat. Rev .

Drug Discov. 2007, 6, 373]. В условиях супериндукции SSAT Spm и Spd не способны вос­ станавливать рост клеток, поэтому потребовалось создать метаболически устойчивые и функционально-активные а-метилированные производные Spm и Spd, пригодные для обращения эффектов in vivo и in vitro. Эти вещества оказались полезными инструмен­ тами для исследования метаболизма полиаминов и их функций [Keinanen T.A., et al, Mini Rev. Med. Chem. 2007, 7, 813] .

Гидроксиаминсодержашие аналоги спермина и спермидина и их производные. Биологические эффекты полиаминов и их аналогов определяются гео­ метрией молекулы и зарядом протонированных аминогрупп. Зависимость биологических эффектов аналогов Spm и Spd от их строения исследована весьма подробно, однако вклад зарядовой составляющей остается малоизученным. Поэтому зарядодефшщтные аналоги полиаминов являются полезным инструментом исследования клеточных функций и метаболизма Spm и Spd. Рациональным подходом к созданию веществ этого типа является понижение основности аминогруппы путем замены соседней СНг-группы на кислород. Таким образом, был получен набор гидроксиламинсодержащих аналогов полиаминов. Лучшие из этих веществ •?-(5'-дезокси-5'-аденозил)ме,гилтиоэтижидроксиламин и 1-аминоокси-З-аминопропан являются одними из самых эффективных необрати­ мых ингибиторов AdoMetDC и ODC соответственно (см. обзор [Хомутов А.Р. Биохимия 2002,67,1403] и ссылки в нем). Используя комбинацию этих ингибиторов, удалось впервые химическим способом полностью истощить пул Spm и Spd и показать ключевую роль Spd в поддержании роста и жизнеспособности клеток [Kramer D.L. et al, Biochem. J .

1989, 259. 325]. При помощи 5-(5'-дезокси-5'-аденозил)метилтиоэтилгидроксиламина было показано, что AdoMetDC синтезируется в клетках в виде пробелка [Autelli К, et al, Eur. J. Biochem. 1991, 196, 551], а также исследованы особенности транспорта полиами­ нов и их аналогов в клетки [Kramer D .

L., et al, J.Cell Physiol. 1993, 155, 399]. Таким образом, с помощью этих ингибиторов удалось получить ряд принципиальных для био­ химии полиаминов результатов. Изостерные и зарядодефицитные аминооксианалоги Spm и Spd [Khomutov A.R., et al, Tetrahedron 1996, 52, 13751] оказались эффекторами ферментов метаболизма полиаминов, они проникали в клетки, обладали низкой цитотоксичностью и регулируемой катаболической устойчивостью, а их активность опреде­ лялась не только структурой аналога, но и типом клеток [Хомутов А Р. Биохимия 2002, 67.1159]. Однако аминооксианалоги Spm остаются малодоступными соединениями .

Получение амияооксианалогов спермина и их моноадетильных производных. На первом этапе работы были разработаны удобные методы синтеза гидрокиламинсодержащих аналогов Spm, а также получены неизвестные ранее JV1- И NUмоко-Ас-производные AOSpm .

Синтез 1-аминоокси-3,8-диаза-11-аминоундекана (AOSpm) (Ш) был осуществлен, исходя из 7-(Г-зтоксиэтилиден)аминоокси-5-азагеігган-1-ола (Схема 1). На первой ста­ дии его аминогруппу защищали и образовавшееся Вос-производное (I) превращали в соответствующий мезилат, который без дальнейшей очистки вводили в реакцию с избытком 1,3-диаминопропана, что приводило к диамину (II). Одновременное удаление кислотолабильных защитных групп позволило получить целевой AOSpm (III) с выходом 52%, считая на исходный аминоспирт, что в три раза выше описанного ранее [Khomutov A.R., etal, Tetrahedron 1996, 52,13751] .

Схема 1

–  –  –

i-BocjO/диоксан;tf-MsCl/Et3N/CH2Cl2;u7-NH2(CHj)3NH2/THF; /v - HCl/H20/f-PrOH .

Первоначально мы предполагали, что исходным веществом в синтезе 11-(JVацетил)аминоокси-4,9-диаза-1-аминоундекана (VI) может служить три-Вос-производное (TV) (Схема 2). Для получения ключевого интермедиата (V) необходимо было избирательно удалить этоксиэтилиденовую защиту аминооксигруппы в присутствии кислотолабильных N-Boc-защитных групп. Оказалось, что это превращение гладко проходит даже в гетерогенных условиях при использовании KHSO4 в водном спирте. В гомогенных условиях, обрабатывая моль этоксиэтилиденового производного 0.5 молем H2SO4 в водном спирте в течение несколько минут при комнатной температуре, удается получить искомое три-Вос-производное //-ацетиламинооксиспермина (V) с выходом, близким к количественному. Таким образом, впервые удалось избирательно удалить кислотолабильную этоксиэтилиденовую защитную группу в присутствии кислотолабильной Л'-Вос-группы .

Схема 2 і У" Вое Іі,Ш (II) EU0AN.Ov^~.N^\/\^N.4^-4^NHBoc Вое (1) <

–  –  –

Избирательное удаление Л^-Вос-защитных групп в присутствии 0-замещенных эфиров ацетилгидроксамовой кислоты, a priori, представлялось вполне реальным. Однако выяснилось, что реакция проходит неоднозначно как при использовании НСІ/МеОН при 20°С, так и при использовании n-TosOH при 0°С. В обоих случаях наблюдалось образование значительных количеств AOSpm (ІП). Поэтому для получения соединения (VI) вместо Вос-защитных групп была использована Cbz группа (Схема 3) .

Схема 3

–  –  –

/ - CbzCl/THF/NaHCOj/HA li- MsCl/Et3N/CH2Cl2;tf/-NH2(CH2)3NH/THF;iv- CbzCMEt3N/CH2Cl2;

v - HCl/H20/:-PrOH; vi - AcCl/THF; vii - H2/Pd

–  –  –

I - C^H50(CH3)C=NO(CH2)2Br/K2C03/DMF; ii - PhSH/K2C03/DMF;«i - HCVH20//-PrOH .

Таким образом, были получены неизвестные ранее N1- и N11- моноацетильные производные аминооксиспермина (Т) и (XIII), а также предложены удобные методы синтеза AOSpm (III) и BAOSpm (XV) .

Получение стабильных аналогов бисбстратного комплекса, возникающего в ходе спермин/спермидин Л^-апетилтрансФеразной реакции. Одной из традиционных задач химической энзимологии полиаминов является разработка методов истощения внутриклеточного пула Spm и Spd, что вполне естественно, учитывая повышенное содер­ жание полиаминов в опухолевых клетках. Соответственно, были найдены эффективные индукторы SSAT, ключевого фермента катаболизма полиаминов, однако набор ингиби­ торов SSAT, в отличие от ODC и AdoMetDC, весьма ограничен. Развитие молекулярной биологии полиаминов показало, что полиаминзависимый продуктивный и непродуктив­ ный сплайсинг пре-мРНК SSAT играет важную роль в регуляции уровня Spm и Spd в клетке [Нуопеп М.Т., et al, RNA 2006,.12, 1569]. Поскольку избирательные ингибиторы SSAT являются удобным инструментом исследования активных и неактивных форм фермента, в том числе и методами рентгеноструктурного анализа, возникла необхо­ димость получения таких структур .

Механизм S SAT-реакции не предусматривает промежуточного образования ацетилированного фермента происходит прямой перенос ацетильной группы Ас-СоА на субстрат. Поэтому вполне очевидным было использовать для ингибирования фермента конъюгаты SH-CoA со Spm или Spd. Ранее были описаны конъюгаты Со-А и полиаминов с ацетатным линкером (Рис. 2), которые ингибировали изолированный фермент с ICso 0.5-5 |іМ в зависимости от строения полиаминного фрагмента [Ervin B.G., et al, Biochemistry 1984, 23., 4250]. Однако схема синтеза была пригодна для получения производных только симметричных полиаминов. Поэтому для приготовления конъюгатов SH-CoA, а также D-пантотеина, избирательно по N - или Л^-положениям Spd был специально разработан достаточно сложный многостадийный синтез [Roblot G., et al, Tetrahedron 1993, 29,6381] .

Располагая набором гидроксиламинсодержащих аналогов Spm и Spd с концевой аминооксигруппой, естественным представлялось использовать различия в реакционной способности H2NO- и HN-rpynn для получения искомых конъюгатов СоА-полиамин .

–  –  –

Рис.2. Моделирование переходного состояния бисубстратного комплекса, возникающего в ходе SSAT-реакции, с помощью конъюгатов СоА-полиамин с ацетатным и ацетоновым линкерами .

На первой стадии разработанного нами простого двухстадийного синтеза CoA-SH или.D-пантотеин алкилировали хлорацетоном в слабощелочной среде (Схема 6). Полу­ ченный кетон без выделения реагировал с соответствующим О-замещенным гидроксиламином, что привело к целевым соединениям с выходами, близкими к количественным .

–  –  –

i - ClCH2COCH3/CH3CN/H20/NaHC05-Na2C03, II- RONH2; Ш - DTT/EtOH/HjO Как следует из данных Табл. 1, соединение (ХІП) в 22 раза активнее кетона (XVI), который действует хуже, чем любой из конъюгатов СоА-полиамин, что подтверж­ дает вклад полиаминного фрагмента в эффективность торможения. Наиболее активным оказалось соединение (XVIII), моделирующее конъюгат по лЛположению Spd, тогда как соединение (XVII), моделирующее конъюгат по N1 -положению Spd, было не столь эффективно (значения IC50 получены при 4.5 цМ концентрации Ас-СоА в субстратной смеси) .

–  –  –

Следует отметить, что использование ацетатного линкера давало обратную карти­ ну зависимости действия ингибитора от строения полиаминного фрагмента [ЕЫп B.G, et al, Biochemistry 1984, 23, 4250]. При этом активности лучших представителей каждого из набора коньюгатов были близки, т.е. эффективность действия ингибитора зависит не только от строения полиаминного фрагмента, но и от структуры линкера. Вклад аденозинового фрагмента СоА в эффективность торможения SSAT был определяющим, что прямо следует из низкой активности соответствующих пантотеиновых производных (ср. (XVIII) и (ХХІП)). Следует отметить, что в случае сукцинил-СоА-ацетоацетат трансферазы пантотеновая часть субстрата вносит значительный вклад в эффективность связывания субстрата [Fierke С.А. & Jencks WP. J. Biol. Chem. 1986, 261, 7603] .

Таким образом, был получен набор новых аналогов бисубстратного комплекса SSAT-реакции на основе CoA-SH и D-пантотеина. Соединения (XVIII), (XX) и (XVII) эффективно тормозили SSAT, причем их активность была сравнима с таковой для лучших из известных ранее ингибиторов .

Получение окса-анадогов спермина. В живых системах Spm и Spd во многом взаимозаменяемы, что осложняет исследование их роли в регуляции клеточного метаболизма. Поэтому одной из важных методических задач биохимии полиаминов является создание подходов, позволяющих "разделить" клеточные эффекты Spm и Spd .

Несмотря на кажущуюся простоту, эта задача до сих пор не имеет удачного решения изза взаимопревращений полиаминов Синтез набора стереоизомеров а-метилированных аналогов Spm и Spd, не являющихся субстратами SSAT, но способных выполнять основные функции полиаминов т vitro и in vivo, был первым шагом в этом направлении [Кеіпапеп ТА, et al, Mini Rev. Med. Chem. 2007, 7, 813]. Однако легкость расщепления а,со-диметильных производных Spm под действием SMO требует создания эффективных избирательных ингибиторов этого недавно открытого фермента .

В этой части работы описывается синтез неизвестного ранее oxa-Spm (XXIX). Так как замена метиленовой группы в пятом положении Spm на атом кислорода изостерна, то можно ожидать, что oxa-Spm (XXIX) будет хорошим конкурентным ингибитором SMO .

Атом кислорода понижает основность соседней NH группы на ~ 5 порядков (рКа 2.7 против рКа 7.97 у Я7-группы Spm, см. Рис. 3) и, следовательно, oxa-Spm (XIX) при физиологическом значении рН существует в виде трикатиона. Так как происходящее в активном центре SMO депротонирование вторичной аминогруппы Spm предшествует его окислению, то oxa-Spm (XXIX) может рассматриваться как своеобразный аналог промежуточно возникающей в активном центре SMO трехзарядной формы Spm .

Известно, что ферментативное окисление Spm происходит через промежуточное образование основания ІПиффа, гидролиз которого приводит к 3-аминопропаналю и Spd .

Если oxa-Spm (XXIX) будет окисляться подобно Spm, то в активном центре SMO in situ может образоваться оксим (XXXVI), представляющий собой стабильный аналог основания Шиффа. Поскольку получение стабильных аналогов промежуточных соединений ферментативных реакций является универсальным алгоритмом создания эффективных ингибиторов ферментов, то наряду с oxa-Spm (XXIX) был получен и оксим (XXXVI) .

Синтез 1,12-диамино-4,9-диаза-5-оксадодекана (XXIX) был осуществлен последовательным наращивание аминометиленовой цепи (Схема 7), а также блочным методом (Схема 8). В обоих случаях ключевой стадией являлось алкшшрованне соответствующих 2-нитробензолсульфонильных (Ns-) производных 3-№Вос-аминопропилйодидом. Для получения соединения (ХХП) 0-замещенный гидроксиламин (XXVI) нозилировали в стандартных условиях сульфохлорирования аминов, что привело к образованию значительных количеств бис-продукта. Использование в качестве основания эквивалентных количеств пиридина вместо EtjN не снижает количеств биснозильного производного. Однако проведение реакции с 2.5-3.0-кратным избытком Озамещенного гидроксиламина без оснований позволяет получить л0Н0-№-производное (XXVII) с выходом около 70 %, считая на NsCl. Апеллирование Ns-производного (XVII) 3-і-Вос-аминопрошшйодидом и последующее "one-pot" денозилирование тиофенолом привели к тризащищенному соединению (ХХШ), из которого одновременным удале­ нием Вое- и Cbz- защитных групп, при помощи НВг/АсОН, был получен целевой тетрагидробромид oxa-Spm (XXIX) .

–  –  –

Использование конвергентного синтеза (Схема 8) повысило суммарный выход oxa-Spm (XXIX). На первой стадии аминогруппу 1-(Г-этоксиэтилиден)аминоокси-3аминопропана нозилировали эквивалентом NsCl. Затем удаляли этоксиэтшшденовую защиту мягким кислотным гидролизом и свободную аминооксигруппу нозилировали 0.4 экв. N s C l. Избыток гидроксиламина (XXXI) отделяли и вновь нозилировали. Затем соединение ( X X X I I ) алкилировали З-Л^-Вос-аминопропилйодидом, а после удаления з а щ и т н ы х групп получали oxa-Spm (XXIX). Следует отметить, ч т о данная последо­ вательность превращений позволяет выделить почти все промежуточные соединения, н е прибегая к колоночной хроматографии н а силикагеле .

–  –  –

Синтез оксима ( X X X V I ) б ы л осуществлен, исходя и з З-ЛЧЗос-аминопропанола (Схема 9), который сначала окисляли д о соответствующего альдегида действием хлорхромата пиридиния н а нейтральной AI2O3. Затем 3-(7/-тре/и-бутилоксикарбонил)аминопропаналь б е з выделения вводили в реакцию с 1-аминоокси-4-аза-7-аминогептаном, а образовавшийся оксим (XXXV) выделяли колоночной хроматографией н а силикагеле в виде смеси син- и антяи-изомеров в соотношении 40:60, как следует и з данных ' Н - Я М Р .

П о с л е д у ю щ е е удаление Вос-защитной группы действием НСІ/МеОН п р и 0 ° С привело к и с к о м о м у тригидрохлориду ( X X X V I ), при этом соотношение син- и аннш-изомеров м а л о изменилось и составило 35:65 .

–  –  –

/ - Boc2OmiF; U - Сг03Ру-НС1/А1203/СН2С12; iii - HiNOCCH^NHCH^NHj/MeOH/HjO; iv - HCl/MeOH .

Определение рКа аналогов спермина. Биологические свойства полиаминов и их аналогов зависят не только от геометрии молекул, но и от степени протонирования аминогрупп. Спермин при физиологических значениях рН существует в виде тетракатиона. Однако при замене СНг-группы на кислород основность соседнего атома азота сильно уменьшается, а аналоги представляют собой при физиологических значениях рН трикатионы. С применением метода 'Н-ЯМР спектроскопии были определены значения рКа аминооксигруппы AOSpm, BAOSpm (pKa 3.20) и oxa-Spm (pKa 2.67) .

–  –  –

Синтез и биологическая активность функционально-замещенных алкоксиганидинов. Среди природных производных гидроксиламина наиболее извес-тны аминокислота канаванин (а-амино-у-гуанидинооксимасляная кислота), широко рас­ пространенная в растениях, и антибиотик циклосерин (4-аминоизоксазолидон-З), при­ меняемый для лечения туберкулеза .

–  –  –

Методы синтеза и химия циклосерина были разработаны еще в конце 50-х начале 60-х годов, однако удобные способы получения алкоксигуанидинов, в том числе и канаванина, практически не развиты. Известно лишь, что обработка защищенного производного каналина й'-метилизотиомочевиной при 20°С в течение 72 ч приводит к канаванину с выходом 10% [Rosenthal G.A. et al, Anal. Biochem. 1983, 133, 277], a кипячение с циан-амидом в спирте (5 ч) позволяет получить канаванин с выходом 70 % [Frankel М., et al, J. Chem. Soc. 1963, 3127]. Таким образом, предполагая использовать функционально-замещенные алкоксигуанидины в качестве инструмента исследования метаболизма полиаминов, мы были вынуждены сначала разработать удобный метод синтеза этих малодоступных соединений .

В настоящей работе для получения гуанидинооксиалканов впервые был использован трифлат ди-Вос-гуанидина, который быстро и практически количественно превращает алифатические амины в соответствующие гуанидины [Feicktinger K.,et al, J .

Org. Chem. 1998, 63^ 3804]. Однако О-замещенные гидроксиламины существенно менее нуклеофильны по сравнению с соответствующими алифатическими аминами. Поэтому на первом этапе мы исследовали взаимодействие трифлата ди-Вос-гуанидина с модельным О-бензилгидроксиламином .

уВос | p Y ^ ° ' N H j B C NN S a F ffV^0'' Q H ^ H OC, Оказалось, что ди-Вос-производное бензилоксигуанидина образуется с практически количественным выходом, но реакция протекает существенно медленнее (Рис. 4), чем в случае бензиламина. Величина константы скорости реакции второго порядка (мольные соотношения (9-бензилгидроксшіамина и трифлата дн-Вос-гуанидина), определенная с использованием метода 'Н-ЯМР (Рис. 4) по изменению интегралов сигналов СНгпротонов О-бензилгидроксиламина (8 4.63 м.д.) и СНг-протонов ди-Вос-защшценного бензилоксигуанидина (5 5.01 м.д.), составила 2.66-10'2 л-моль^-мин"1 (тід 75 мин при 37°С) .

8? 80 g60 время час Рис.4. Кинетика гуанидинилирования О-бензилгидроксиламина (0.3 М) трифлатом ди-Вос-гуанидина (0.3 М) в присутствии Et3N (0.3 М) в CDC13 (0.5 мл) при 37°С .

На следующем этапе работы в реакцию с трифлатом ди-Вос-гуанидина были введены различные эфиры гидроксиламина, включая функционально-замещенные (Схема 10). Оказалось, что гуанидшшрование аминооксисоединений с высоким выходом удается осуществить при наличии в радикале меркапто- и гидроксигрупп, а также экзоциклической аминогруппы аденина .

–  –  –

Исходным соединением в синтезах AO-Agm (XXXVIII), GAPA (XLI) и NGPG (XLIII) служит 1-(Г-этоксиэтилиден)аминоокси-3-аминопропан (Схема 11). Гуанидинилирование его свободной аминогруппы трифлатом ди-Вос-гуанидина было осущест­ влено по стандартной методике для аминов, и ди-Вос-производное (ХХХН) получено с выходом, близким к количественному. Удаление защитных групп действием HCl/EtOH привело к медленно смокающему на воздухе дигидрохлориду AO-Agm (XXXVIII), который был превращен в хорошо кристаллизующийся дитозилат .

–  –  –

/ - (BocNH)2C=NTCEt3N/CH2Cl2; Й - HCl/;-PrOH/H20; til - Cbz-Cl/Et3N/THF; jv - HCl/Et0H/H2O;

v - (BocNH)2C=NTCEt3N/CHCy37°C; vl - HBr/AcOH; н - Dowex 1x8 в TosCT форме .

Следует отметить, что AO-Agm является изостерным зарядодефицитным аналогом Agm и образует, подобно другим О-замещенным гидроксиламинам, стабиль­ ные оксимы с альдегидами и кетонами, включая PLP, который служит коферментом ArgDC. Так как аминооксианалоги субстратов пируват- и PLP-зависимых ферментов метаболизма аминокислот являются их эффективными ингибиторами (см.обзор [Хомутов А.Р. Биохимия 2002, 67, 1403] и ссылки в нем), то следует ожидать высокой активности AO-Agm (XXXVIII) по отношению к ArgDC .

При получении GAPA (XLI) свободную аминогруппу І-(Г-этоксиэтилиден)аминоокси-3-аминопропана сначала карбобензоксилировали, а затем удаляли этоксиэтилиденовую защиту, что приводило к соответствующему гидрохлориду (XXXIX) (Схема 11). Гуанидинилирование аминооксигрупны трифлатом ди-Вос-гуанидина позволило получить с высоким выходом соединение (XL). Одновременное удаление Воси Cbz-защитных групп привело к кристаллическому дигидробромиду GAPA (XLI) .

Мы реализовали несколько схем получения NGPG (ХЫП), наиболее удачной из которых является синтез, исходящий из 1-аминоокси-З-аминопропана, свободные аминои ачинооксигруппы которого гуанидилировали 1.9 экв. трифлата да Вос-гуанидина при 37СС (Схема 11). Соединение (XLII) очищали колоночной хроматографией на силикагеле, и после удаления Вос-защитных групп получали дигидробромид NGPG (ХЫП) .

Определение рКа аналогов агматина. Основность гуанидиноокси-фрагмента GAPA и NGPG имеет значение для правильного использования этих аналогов в биохимии полиаминов. С применением метода 'Н-ЯМР спектроскопии были определены значения рКа аминооксигруппы AO-Agm (pKa4.05) и гуанидинооксигрупп GAPA (рКаб.7) и NGPG (рКаб.9). Таким образом, GAPА, являясь изостером Agm, по основности ближе к Put и, скорее всего, будет активно переноситься в клетки, используя, подобно Agm, систему транспорта Put .

–  –  –

GAPA1 .

Ингибирование размножения Leishmania donovani действием Протозойные инфекции - причина заболевания и смерти миллионов людей преиму­ щественно в тропиках и субтропиках. Висцеральный лейшманиоз, возбудителем которого является Leishmania donovani, одно из самых распространенных заболеваний в Индии. Сегодня в мире не существует противолейшманиозной вакцины, а появление форм, устойчивых к "Солюсурьмину" (SAG), основному сурьмасодержащему противолейшманиозному препарату, еще более осложнило лечение этого заболевания [Croft SL, etal, Clin. Microbiol. Rev. 2006,19, 111] .

Одним из жизненно важных метаболитов Ldonovani является трипанотион бис-(глутатионил)спермидин), образование которого зависит, в том числе, от уровня Spd у паразита. Метаболизм полиаминов у L.donovani (Рис. 7) не так сложен, как у млекопитающих (Рис. 1). У паразита отсутствует Spm, a Spd не катаболизирует до Put .

Известно, что подавление биосинтеза Spd у L.donovani приводит к снижению содержания трипапотиона и гибели паразита [НеЪу О., et al, Amino Acids 2007, 33, 359]. Сложность применения этого подхода для практической полиаминотерапии состоит в том, что Spd Совместно с Prof. R.Madhubala (Университет Дж. Неру, Дели, Индия) необходим и клеткам хозяина. Однако ODC паразитов не имеет С-концевых PESTпоследовательностей, поэтому время ее полужизни существенно больше, по сравнению с ODC млекопитающих, что позволяет создать в паразите значительное количество "заингибированного" фермента. Например, а,а-дифторметилорнитин (DFMO) - эффек­ тивный необратимый ингибитор ODC, используется для лечения поздних стадий сонной болезни, вызываемой Tripanosoma brucei gambeisi [Burri С. & brun R., Parasitol. Res .

2003,90,S49] .

–  –  –

Рис.7. Метаболизм полиаминов у L donovam I- Орнитиндекарбоксилаза, //-S-аденозилметиониндекарбоксилаза, ///—спермидинсинтаза, tv - глутатионилспермидиясиіггаза,

- трипанотионсинтаза, і - трипанотиондисульфидредуктаза .

Успех применения специфических ингибиторов для практической терапии во многом определяется возможностью создания их активно-транспортируемых форм .

Однако такие ингибиторы ODC как DFMO и АРА in vitro весьма активны по отношению к L.donovani [Singh S., et al, Antimicrob. Agents Chemother. 2007, 5_L 528] и Plasmodium falciparum [Das Gupta R., et al, Antimicrob. Agents Chemother. 2005, 49, 2857], хотя и пассивно проникают в эти паразиты. Поэтому в заключительной части настоящего исследования мы попытались создать активно-транспортируемую форму АРА, превратив его в GAPА, который сможет проникать в клетки, используя систему транспорта Put .

Известно, что АРА ингибирует ODC из Ldonovani с К, 10"9М [Singh S„ et al, Antimicrob. Agents Chemother. 2007, 5_L 528], тогда как GAPA оказался существенно менее активен К,6-10"бМ. Однако по отношению к Ldonovani дикого типа оба ингибитора проявляли близкую активность (Табл. 2) .

Табл. 2. Сравнение эффектов SAG, АРА и GAPA на SAG-чувствительные (S-1) и SAG-резистентные (R-1 и GE-1) клинические изоляты L donovani (Данные любезно предоставлены Prof. R.Madhubala университет Дж.Неру, Дели, Индия)

–  –  –

*Промастигота - жгутиковая форма L donovani, в организме москитов переносчиков .

* * Амаститота - безжгутиковая форма L. donovani, внутри паразитофоряой вакуоли макрофагов .

Сопоставление активностей АРА и GAPA по отношению к изолированной ODC и L.donovani свидетельствует, что GAPA, скорее всего, активно проникает в паразит и, следовательно, позволяет считать GAPA первым активно-транспортируемым ингиби­ тором ODC .

Возможность внутриклеточной трансформации GAPA в АРА (Рис. 8) определяется наличием в клетке низкоспецифичных уреидогидролаз. Известно, что многие аргиназы способны превращать канаванин в каналин, а некоторые из них способны даже расщеплять Agm до Put [Dabir S., et al, Int. J. Biol. Sci. 2005,1, 114]. Кроме того, макро­ фаги, в которых локализована L donovani, обладают агматиназной активностью [Sastre М .

etal, Biochem. J. 1998, 330,1405] .

–  –  –

Проникнув в Ldonovani, GAPA, подобно АРА, вызывает снижение уровня Put и Spd (Табл. 3), а экзогенные Put и/или Spd полностью нейтрализуют эффекты ингибитора (данные не приведены), что свидетельствует о том, что биохимическая мишень GAPA связана с метаболизмом полиаминов. Однако GAPA, в отличие от АРА, мало влияет на уровень трипанотиона в L.donovani (Табл. 3). Таким образом, наблюдаемая картина, повидимому, не может быть описана только в терминах ингибирования ODC под действием GAPA или в результате ее расщепления до АРА, а взаимосвязь: уровень Spd - уровень трипанотиона у L donovani может иметь достаточно сложный характер .

Табл. 3. Влияние GAPA и АРА на уровень полиаминов и трипанотиона (Try) у промастигот Ldonovanl (Данные любезно предоставлены Prof. R.Madhubala университет Дж Неру, Дели, Индия)

–  –  –

•Данные из работы [Singh S, et al, Antimicrob. Agents Chemother. 2007, L 528] Другим принципиальным отличием GAPA от АРА и DFMO является его высокая эффективность по отношению к формам Ldonovani, резистентным к сурьмасодержащим препаратам (Табл. 2). Следует отметить, что устойчивость к этим препаратам сопровож­ дается повышенной активность ферментов биосинтеза Spd, в первую очередь ODC, что, по-видимому, и снижает эффективность АРА и DFMO .

Таким образом, нельзя исключить, что GAPA имеет еще одну метаболическую мишень, отличную от ODC. Нечто подобное наблюдалось при сравнении эффектов DFMO и АРА на рост мицелия фитопатогенного гриба Pyr.oiyzae. Оба ингибитора ODC снижали содержание Put и замедляли рост мицелия, который восстанавливался при внесении в среду Put. Однако АРА, действуя, в отличие от DFMO, еще и на ранние этапы биосинтеза меланина, вызывал обесцвечивание мицелия, окраска которого восстанав­ ливалась после добавления Put [Хомутов А Р., и др. Биоорган, химия 1989,15, 706] .

Таким образом, механизм действия GAPA требует детального исследования, поскольку возможность существования биологической мишени для GAPA, отличной от ODC, может быть уникальным для этого паразита и, следовательно, представлять перспективную цель для избирательного воздействия на L.donovani .

–  –  –

1. Предложены удобные методы получения аминооксианалогов спермина, их неизвестных ранее моно-ацетильных производных, а также окса-аналогов спермина, необходимых для исследования ферментов катаболизма полиаминов .

2. Синтезирован набор новых ингибиторов спермин/спермидин-І1 -ацетилтрансферазы (SSAT) на основе СоА, Л-пантотеина и аминооксианалогов полиаминов с использова­ нием ацетонового линкера. Показано, что производные СоА эффективно ингибирует фермент в цМ концентрациях .

3. Предложен общий способ превращения О-замещенных гидроксиламинов в алкоксигуанидины, позволяющий получать разнообразные функционально-замещенные производные с выходами близкими к количественным .

4. Синтезированы неизвестные ранее зарядодефицитные аналоги агматина на основе 1аминоокси-3-аминопропана. Предложен способ превращения 1-аминоокси-З-аминопропана, эффективного ингибитора орнитиндекарбоксилазы, в активно-транспорти­ руемый проингибитор. Показано, что 1-гуанидиноокси-З-аминопропан эффективно ингибирует размножение Leishmania donovani, в том числе и формы резистентные к сурьмасодержащим препаратам .

Основное содержание работы

отражено в следующих публикациях:

1. Хомутов А.Р., Симонян А.Р.. Вепсалайнен Й., Кейнанен Т.А., Алхонен Л., Янне Ю. "Новые окса-аналоги спермина." // Биоорган. Химия, 2005, т. 31, № 2, с. 206Симонян А.Р.. Григоренко Н.А., Вепсалайнен Й., Хомутов А.Р. "Новые зарядодефицитные аналоги агматина." // Биоорган. Химия, 2005, т. 31, № 6, с. 645Симонян А.Р.. Вепсалайнен Й., Хомутов А.Р. "Аминооксианалоги спермина и их моно-ацетильные производные." // Биоорган. Химия, 2006, т. 32, № 6, с. 643-650 .

4. Grillo M.A., Battaglia V., Colombatto S., Rossi C.A., Simonian A.R.. Salvi M., Khomutov A.R., Toninello A. "Inhibition of agmatine transport in liver mitochondria by new charge-deficient agmatine analogues." // Biochem. Soc. Trans., 2007, v. 35, № 2, p. 401-404 .

5. Simonian A.. Khomutov A., Hyvonen Т., Grigorenko N., Keinanen Т., Vepsalainen J., Alhonen L., Janne J. "Novel CoA-polyamine conjugates for effective inhibition of spennine/spermidine-A^'-acetyltransferase." // Nucleosides, Nucleotides, and Nucleic Acids, 2007, v. 26, № 10-12, p. 1245-1248 .

6. Singh S., Jhingran A., Sharma A., Simonian A.R.. Soininen P., Vepsalainen J., Khomutov A.R., Madhubala R. "Novel agmatine analogue, y-guanidinooxypropylamine (GAPA) efficiently inhibits proliferation at Leishmania donovani by depletion of intracellular polyamine levels." // Biochem. Biophys. Res. Commun., 2008, v. 375, № 1, p. 168-172 .

Напечатано с готового оригинал-макета

–  –  –






Похожие работы:

«Жамурина Надеязда Алексеевна ПОПУНЯЦИОННАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ ДИК0РАСТУ1ДИХ ВИДОВ POPULUSL. НА ТЕРРИТОРИИ ОРЕНБУРГСКОГО ПРИУРАЛЬЯ 03.00.05.-ботаника АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени канд...»

«Ископаемые водоросли УДК 551.77:561.26(265.2) В.С. ПУШКАРЬ1,3, М.В. ЧЕРЕПАНОВА2, О.Ю. ЛИХАЧЕВА1 Дальневосточный геологический ин-т ДВО РАН, пр. 100-летия Владивостока, 159, Владивосток 690022, Россия Биолого-почвенный и...»

«У ЗОГРАФ ЮЛИЯ КОНСТАНТИНОВНА Ультраструктура мужской половой системы и сперматозоидов у свободноживущих морских нематод из отряда Chromadorida 03.00.25 гистология, цитология, клеточная биология 03.00,08-зоология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук В ладн восток—2006 Работа выполнена в Институте биологии мор...»

«На  равах  укописи п р БЛГИРОВ Вугар Алинияз оглы БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ  АСПЕКТЫ  СОХРАНЕНИЯ ГЕНЕТИЧЕСКИХ РЕСУРСОВ ЖИВОТНЫХ 03.00.23 - Биотехнология 03.00.13 - Физиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологическ...»

«ШОРИНА Марина  Владимировна АККУМУЛЯЦИЯ КАДАВЕРИНА И ЕГО ФИЗИОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ ПРИ ДЕЙСТВИИ СОЛЕВОГО СТРЕССА 03.00.12 - "физиология и биохимия растений" АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва - 2005 Работа  выполнена  в  лаб...»

«ШАБАНОВА Маргарита Михайловна МНОГОЩЕТИНКОВЫЕ  ЧЕРВИ  СЕМЕЙСТВА  POLYNOIDAE (ANNELIDA,  POLYCHAETA).  СИСТЕМА  И  ФИЛОГЕНИЯ. 03.00.08  -  зоология АВТОРЕФЕРАТ диссертации  на  соискание ученой  степени кандидата  би...»

«Сценарий внеклассного мероприятия Питание и здоровье Автор: учитель биологии высшей категории Новикова Н.Н. ЦЕЛИ: Пропагандировать здоровый образ жизни; активизировать познавательную деятельность учащихся; заинтересовать учащихся изучением вопросов здоровья; развивать творческие способности; расширить понятие о здоровом питании.ХОД ЗАНЯТИЯ Учитель...»







 
2018 www.lit.i-docx.ru - «Бесплатная электронная библиотека - различные публикации»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.