WWW.LIT.I-DOCX.RU
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - различные публикации
 


«БЕСКОВ Артем Александрович ВАРИАНТЫ  СТРОЕНИЯ  СПЕРМАТОЗОИДОВ  ЧЕЛОВЕКА В НОРМЕ И ПРИ ПАТОЛОГИИ, КРИТЕРИИ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ УСПЕШНОСТИ ЭКСТРАКОРПОРАЛЬНОГО  ОПЛОДОТВОРЕНИЯ И ДИФФЕРЕНЦИРОВАННОГО ПОДХ ...»

На правах рукописи

БЕСКОВ

Артем Александрович

ВАРИАНТЫ  СТРОЕНИЯ  СПЕРМАТОЗОИДОВ  ЧЕЛОВЕКА

В НОРМЕ И ПРИ ПАТОЛОГИИ,

КРИТЕРИИ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ УСПЕШНОСТИ

ЭКСТРАКОРПОРАЛЬНОГО  ОПЛОДОТВОРЕНИЯ

И ДИФФЕРЕНЦИРОВАННОГО ПОДХОДА

К ДИАГНОСТИКЕ  И ЛЕЧЕНИЮ  МУЖСКОГО БЕСПЛОДИЯ

03.00.25  -  гистология, цитология, клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук НОВОСИБИРСК-2005 Работа  выполнена  в  Государственном  учреждении  Научный  центр клинической  и  экспериментальной  медицины  Сибирского  отделения Российской  академии  медицинских  наук  (Новосибирск),  Российскоамериканском  центре репродукции  и  генетики  человека (Сочи) и  Сибирском институте репродукции и генетики  человека (Барнаул) .

Научный  руководитель:

академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ  Шкурупий Вячеслав Алексеевич

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор  Бгатова Наталья Петровна кандидат медицинских наук  Надеев Александр Петрович

Ведущая организация:

Государственное  образовательное  учреждение  высшего  медицинского  образования  Алтайский  медицинский  университет  Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию (Барнаул) .

Защита  состоится  2005  г.  в  часов  на заседании  диссертационного  совета  Д  001.048.01  в  Государственном учреждении  Научный  центр  клинической  и  экспериментальной  медицины  Сибирского  отделения  Российской  академии  медицинских наук  по  адресу:  ул.  Академика  Тимакова,  2,  г.Новосибирск,  630117 .

Тел./факс 8 (3832) 33-64-56 .

С  диссертацией  можно  ознакомиться  в  библиотеке  ГУ  Научный центр клинической и экспериментальной медицины СО РАМН Автореферат  диссертации  разослан  2005  г .

Ученый  секретарь диссертационного  совета Пальчикова  Н.А .

д.б.н. 

ОБЩАЯ  ХАРАКТЕРИСТИКА  РАБОТЫ

Актуальность темы. Количество бесплодных супружеских пар в России  достигает  12-15%,  что,  по данным Всемирной  организации здравоохранения  (ВОЗ),  сопоставимо с  распространенностью  бесплодия в  мире  (Кулаков В.И., Леонов Б.В., 2000).  При  изучении  структуры бесплодия ВОЗ определила мужской  фактор более  чем  в  половине случаев  (World  Health  Organization,  1987) .

Качество  сперматозоидов  является  важным  показателем  мужской  фертильности,  и  поэтому  их объективная  оценка играет одну  из ключевых  ролей  в  обеспечении  успешности  методов  вспомогательных  репродуктивных  технологий.  Наибольшее  распространение  получил  анализ  морфологии  сперматозоидов  по  строгим  критериям, разработанным  Kruger и  соавт.  (Kruger T.F.  et al.,  1986).  Для  повышения  информативности  разработаны  индексы  множественных  дефектов  сперматозоидов  (Jouannet  P.  et  al.,  1988;  Aziz N.  et  al.,  1996).  Однако,  современная  классификация  аномалий  сперматозоидов  не  позволяет  выделить  формы,  имеющие  отрицательную  или  положительную  связь  с  частотой  оплодотворения  тем  или  иным  методом  и  последующим  развитием  эмбрионов .





  Этим  могут  быть  обусловлены  и противоречия  в  данных  литературы  по  вопросам  преимущества  экстракорпорального  оплодотворения  или  интрацитоплазматической инъекции  сперматозоида  в  разных  клинических  ситуациях.  Поэтому более  дифференцированный  подход  к  выбору  метода  вспомогательных репродуктивных  технологий,  основанный  на точной  морфологической  оценке  мужских  гамет,  возможно,  позволит  избежать  слишком частого и неоправданного применения  интрацитоплазматической инъекции  сперматозоида,  которое  имеет  тенденцию  к  расширению показаний.  К  тому  же,  изучение  связи  морфологии  сперматозоидов  с успешностью  интрацитоплазматической  инъекции  может  способствовать повышению эффективности самой микроманипуляции .

Большинство  классификаций  морфологических  дефектов  сперматозоидов,  предложенных  до  сегодняшнего  дня,  основывается  на качественной  характеристике  их  формы.  Использование  более  сложных  и  трудоемких  способов  оценки  нецелесообразно  в  повседневной лабораторной  практике,  но  необходимо  для  фундаментального  изучения  связи  строения  сперматозоида  с  его  функциональной  компетентностью.  Поэтому  для  разработки  критериев,  позволяющих  оптимизировать  процедуру  интрацитоплазматической  инъекции  сперматозоида,  необходимо,  на  основе  точных  количественных  методов анализа,  выявить  прогностически  ценные  морфологические  параметры,  которые  могут  быть  оценены  и  без  использования  дополнительных  средств.  Компьютерная  морфометрия  является  высокоточным, воспроизводимым  и  стандартизованным  методом,  позволяющим  количественно  выразить  структурные  характеристики  объекта и доказательно  обосновать  или  отвергнуть  значимость  качественных  оценочных критериев .

Цель  исследования.  Изучить  варианты  строения  сперматозоидов человека в  норме и  при патологии  и  определить наиболее информативные  интегральные  морфологические  критерии  для  прогнозирования успешности лечения бесплодия  при  применении  вспомогательных  репродуктивных  технологий .

Задачи  исследования:

1.  Выявить  качественные  морфологические  характеристики сперматозоидов,  влияющие  на  успешность  экстракорпорального  оплодотворения  и интрацитоплазматической инъекции в яйцеклетку .

2.  Оценить  возможность  использования  этих  характеристик для  выбора  метода  вспомогательных  репродуктивных  технологий .

3.  Оценить  возможности  компьютерной  морфометрии  для объективной  характеристики  сперматозоидов  при  использовании  в области  вспомогательных  репродуктивных  технологий .

4.  С помощью компьютерной  морфометрии  выявить наиболее информативные  интегральные  параметры  сперматозоидов,  пригодные для  планирования  лечения  методами  вспомогательных репродуктивных  технологий .

5.  На  основании  морфометрического  анализа  сперматозоидов выявить  параллели  между  параметрами,  полученными  в  результате интегрального  качественного  и  количественного  морфологического исследования .

Научная  новизна  исследования.  Выявлены  особенности  морфологической  оценки  сперматозоидов  при  подготовке  и  проведении лечения  бесплодия  методом  интрацитоплазматической  инъекции сперматозоида,  учет  которых  способствует  повышению  его  эффективности.  Установлены  критерии  оценки  структур,  которые  обеспечивают  прогнозирование  успешности  интрацитоплазматической  инъекции  сперматозоида.  Обнаружена  связь  между  качественной  характеристикой  строения  сперматозоидов  и  качеством  зигот,  полученных при  классическом  экстракорпоральном  оплодотворении.  Выявлены параллели  между  параметрами  качественного  и  количественного морфологического  анализа  сперматозоидов.  Определены  количественные  параметры,  характеризующие  форму  головки  сперматозоида и,  таким  образом,  адаптирующие  методику  качественного  анализа для  морфометрического  компьютерного  исследования  спермы .

Практическая  значимость  работы.  Знание  структурных  особенностей  сперматозоидов,  влияющих  на  развитие  эмбрионов  после интрацитоплазматической  инъекции,  позволит  повысить  эффективность  лечения  бесплодия  методами  вспомогательных  репродуктивных  технологий  за  счет  улучшения  результатов  микроманипуляции  и более  глубокого  и  дифференцированного  подхода  к  диагностике мужского  бесплодия  на  уровне  эмбриологической  лаборатории.  Выявленные  морфометрические  параметры  сперматозоидов,  имеющие прогностическое  значение,  будут  способствовать  увеличению  надежности  автоматизированного  морфологического  анализа  спермы  и скорейшему  его  распространению  в  лабораторной  практике  с  целью стандартизации  результатов  исследования .

Положения,  выносимые  на  защиту:

1.  Критерии,  разработанные  на  основе  морфометрических  параметров  сперматозоидов,  коррелирующих  с  успешностью  лечения методами  вспомогательных  репродуктивных  технологий,  объективизируют  систему  качественного  анализа  их  структурных элементов .

2.  Оценка  некоторых  структурных  особенностей  сперматозоидов,  отражающих  их  функциональное  состояние  -  фактора  формы круга  головки,  индекса  множественных  аномалий  шеечного  отдела, доли  сперматозоидов  с  искривленными  шейками,  округлости  головки,  большой  оси  головки,  отношения  «большая/малая  ось  головки», фактора  формы  круга  акросомы,  фактора  формы  эллипса  акросомы, округлости  акросомы,  малой  оси  акросомы,  отношения  «малая/большая  ось  акросомы»,  относительной  площади  акросомы,  отношения  «периметр/площадь  акросомы»  - должна  быть дифференцированной  при  прогнозировании успешности лечения бесплодия  методом  интрацитоплазматической  инъекции  сперматозоида  и  методом классического  экстракорпорального оплодотворения .

3.  Благодаря  выявленным  параллелям  с  морфометрическими параметрами  сперматозоидов  (фактором  формы  круга  головки  фактором  формы  круга акросомы, фактором формы эллипса акросомы), качественные  признаки  формы  головки  сперматозоида  и  акросомы  являются  значимыми  при  прогнозировании  успешности  интрацитоплазматической инъекции сперматозоида .

Апробация работы. Результаты исследований доложены на XII международной  конференции  Российской  ассоциации  репродукции человека  (Санкт-Петербург,  2003),  международной  конференции «Twin-Meeting  Alpha-Andrology:  4th  Biennial  Alpha  Conference  /  8th Meeting of Andrology in the 2000s» (Антверпен,  Бельгия, 2003), XXIX ежегодной  конференции  Американского  андрологического  общества (Балтимор, США, 2004) .

Публикации.  По  теме  диссертации  опубликовано  8  печатных работ .

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 134 страницах на русском языке и содержит 34 таблицы,  10 графиков,  16 фотографий  и  рисунков.  Состоит  из  введения,  обзора  литературы, главы  «Материал  и  методы  исследования»,  трех  глав  с  материалами собственных  исследований,  обсуждения  полученных  результатов, выводов,  практических  рекомендаций,  списка  литературы  (71  отечественный  и  170  иностранных источников).  Весь представленный  материал обработан и проанализирован лично автором .

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Основу  работы  составили  данные  о  супружеских  парах,  получавших лечение  по  поводу бесплодия  методами экстракорпорального оплодотворения  (ЭКО)  и  интрацитоплазматической  инъекции  сперматозоида (ИКСИ) в Российско-американском центре репродукции и генетики  человека в г.  Сочи и  в Сибирском  институте  репродукции и генетики  человека  с  августа  2001  года,  с  применением  «длинного»

протокола  стимуляции  суперовуляции,  с  использованием  спермы мужа. Причиной бесплодия был трубный фактор в 26,1% случаев, сочетание  нескольких  женских  этиологических  факторов  (13,0%),  а также  мужской  фактор  как  единственный  (12,5%)  или  в  сочетании  с женским (48,4%).  Средний  возраст женщин  составил  31,8 ± 4,7  (М ± о) лет (от 21  до 40), мужчин - 34,6 ± 5,8 (от 21  до 45) лет .

В  исследование,  посвященное выявлению  качественных морфологических характеристик сперматозоидов,  влияющих на успешность экстракорпорального  оплодотворения,  была  включена  261  пара,  получавшая  лечение  методом  классического  ЭКО,  и  106  пар,  которым потребовалось применение  ИКСИ.  Критериями эффективности  лечения  служили:  1)  роды  после  лечебного  цикла;  2)  наличие  плодного яйца  в  полости  матки  по  данным  ультразвукового  исследования (УЗИ); 3) частота имплантации; 4) качество эмбрионов,  переносимых в  полость  матки;  5)  качество  зигот;  6)  частота  и  качество  оплодотворения. Группы пациентов формировали на основании успешности лечения  (наступление  имплантации,  роды)  и  разных  значений  индекса Крюгера (ИК) и индекса тератозооспермии (ИТЗ) .

Для  определения  количественных  показателей,  имеющих  клиническую  значимость  при  проведении  ИКСИ,  при  помощи  компьютерного  морфометрического  анализа  сперматозоидов  использовали данные  по  42  случайно  выбранным  супружеским  парам,  у  которых был  выявлен  мужской  фактор  как  единственная  причина  бесплодия .

Средний  возраст  женщин  составил  30,7  ±  4,7  лет  (от  21  до  40),  мужчин - 36,3 ± 6,8 (от 21  до 50 лет) .

У  22  супружеских  пар  лечебные  циклы  завершились  безрезультатно  (I  группа),  у  20  женщин  наступила  имплантация  (по  данным УЗИ) (И группа). Группы I и  II были однородны по возрасту (женщины  30,1  ±  5,0  и  31,8  ±  3,4  лет,  мужчины  35,5  ±  7,2  и  38,0  ±  5,8  года, соответственно;  р    0,1),  а  также  ключевым  параметрам  стимуляции суперовуляции  и  особенностям  переноса  эмбрионов.  Оценку  значимости  показателей  производили  по  1187  сперматозоидам  в  I  группе (в среднем  54,0  на одну супружескую  пару)  и  511  сперматозоидам  во  11 группе  (в  среднем  25,6  сперматозоидов  на  одну  пару).  Для  расчетов, связанных с оценкой значимости  индексов множественных аномалий, количество сперматозоидов  в  I  группе составило  1684 (в среднем  76,5 на  одну  супружескую  пару),  во  II  группе  1600  (в  среднем  80,0  сперматозоидов на одну  пару) .

Обследование  пациентов  и  лечение  бесплодия  методами  экстракорпорального  оплодотворения  и  интрацитоплазматической  инъекции  сперматозоида  проводили  по  общепринятым  протоколам,  соответствующим  Приказу  МЗ  РФ  №67  от  26.02.2003  г.  Морфологическую  оценку  зигот  и  эмбрионов  осуществляли  по  распространенным классификациям  (Scott  L.  et  al.,  2000;  Леонов  Б.В.,  Гусарева А.А.,2005).  Анализ  спермы  проводили  по  методике  и  нормативным критериям,  рекомендованным  ВОЗ  (1999).  Для  морфологической оценки  использовали  окраску  препаратов  по  Паппенгейму-Крюкову .

Индекс  Крюгера  равнялся  относительному  количеству  сперматозоидов,  соответствовавших  строгим  морфологическим  критериям (Kruger  T.F.  et  al.,  1986).  ИТЗ  рассчитывали  как  отношение  общего числа  патологий  головки,  шейки  и  хвоста  к  количеству  аномальных сперматозоидов (Jouannet P.  et al.,  1988) .

Морфометрические  показатели  сперматозоидов  определяли  методом компьютерной  морфометрии  с  помощью  системы  анализа  изображений  «Видеотест -  Морфо»,  осуществляющей  преобразование  и количественный  анализ  изображений  на  основе  измерений  яркостных,  площадных и линейных параметров объектов,  имеющих замкнутый контур .

Статистическую  обработку  данных  производили  с  помощью компьютерной  программы GraphPad InStat 3.0. Для сравнения независимых  групп  по  количественному  признаку  использовали  критерии Стьюдента  (при  нормальном  распределении),  Манна-Уитни,  Крускалла-Уоллиса  (при  ненормальном  распределении),  критерий  %  и строгий  критерий  Фишера  (для  сравнения  качественных  признаков) .

Для  выявления  корреляционных  зависимостей  использовали  методы Пирсона  (параметрический)  и  Спирмена  (непараметрический).  Уровень  статистической  значимости  (р) установили  равным 0,05 .

РЕЗУЛЬТАТЫ  ИССЛЕДОВАНИЯ

Качественные  морфологические  и  функциональные  характеристики  сперматозоидов,  влияющие  на  успешность  ЭКО  и икси В  результате  проведенного  исследования  выявлено,  что  качественные  параметры  морфологии  сперматозоидов  по  строгим  критериям  Крюгера  находились  в  положительной  корреляционной  связи  с другими  показателями  спермограммы,  а в  программе  ЭКО - с  общей частотой  оплодотворения (r = 0,19,  р   0,01),  с  частотой  нормального оплодотворения  (r  =  0,13,  р    0,05),  с  относительным  числом  зигот (r  = 0,18,  р   0,05)  и  3-дневных  эмбрионов  (r  = 0,13,  р   0,05),  отнесенных  по  морфологическим  признакам  к  категории  1.  Однако,  для частоты  имплантации  не  было  обнаружено  подобной  зависимости .

Индекс  тератозооспермии  не  был  связан  ни  с  одним  из  оцениваемых параметров классического ЭКО .

В  группе  ИКСИ  были  получены  обратные  результаты  (рис.  1  и 2):  частота  оплодотворения  не  зависела  от  качественных  морфологических  параметров  сперматозоидов,  а  частота  имплантации  оказалась в  обратной  зависимости  от  индекса  Крюгера  (r  =  -0,30,  р    0,01)  и  в прямой -  от  индекса тератозооспермии  (r  =  0,32,  р    0,01).  Отмечена достоверно  более  высокая  частота наступления  беременности  в  объединенной  группе  с  индексом  Крюгера  менее  10  (28,75%  против 5,00%,  р   0,05).  Частота  имплантации  в  группе  с  индексом  Крюгера менее  10  тоже  была достоверно  выше  (11,9%  против  2,7%  р    0,05) .

При  этом  более  высокая  частота  самопроизвольного  прерывания  беременности в группе с индексом Крюгера до 4% была недостоверна .

В  семейных  парах,  у  которых  была  получена  беременность  после  ИКСИ,  средний  индекс  Крюгера  оказался  достоверно  ниже  (на 3,13%),  чем  в  группе  с  неудачными  попытками,  а средний  индекс тератозооспермии,  наоборот,  достоверно  выше  на  0,163  единицы.  Эти данные  свидетельствуют  в  пользу  того,  что  повышение  доли  сперматозоидов  с  множественными  аномалиями  строения  является  свидетельством  необходимости  применения  ИКСИ.  Тем  не  менее,  морфологические  характеристики  зигот  были  лучше  при  меньшей  степени повреждения  сперматозоидов  (коэффициент  корреляции  Спирмена для  индекса  тератозооспермии  и  среднего  балла  зигот  r  =  0,33, р0,05) .

Частота  наступления  беременности  была  высока  и  в  группе,  где в  эякуляте  не  было  морфологически  нормальных  сперматозоидов.  На основании  этих  данных  можно  констатировать,  что  введение  аномального  сперматозоида  в  яйцеклетку  не  всегда  препятствует  оплодотворению  и  нормальному развитию эмбриона .

Однако, возможность успешного завершения ИКСИ после оплодотворения  морфологически  аномальным  сперматозоидом  указывает и  на  недостаточную  точность  оценки  по  стандартным  качественным критериям.  Индекс  тератозооспермии  в  этом  случае  также  не  повышает  ее  информативность,  поскольку  не  выделяет  отдельных  форм аномалий  головки,  от  количества  которых,  по  данным  вышеперечисленных исследований, и зависит успешность ИКСИ. Поэтому для выявления  тонких  различий  в  морфологии  сперматозоидов,  используемых для  интрацитоплазматической  инъекции,  было  проведено  исследование  с  более  детальной  оценкой  морфологических  аномалий сперматозоидов,  в том числе с использованием  количественных показателей, полученных при помощи компьютерной морфометрии .

Анализ  качественных  морфологических  параметров  сперматозоидов  с  использованием  индексов  множественных  аномалий Оценка  распределения  аномалий  формы  различных  отделов сперматозоидов  в  группах  супружеских  пар,  у  которых  перенос  эмбрионов  не привел  к наступлению  беременности  (группа I) и пациенток,  у  которых  наступление  имплантации  было  зарегистрировано  по данным  УЗИ  (группа  II),  показала  достоверные  различия  по  относительному  количеству  сперматозоидов  с  аномальными  головками, причем  в  группе  забеременевших  этот  показатель был  на  5,49%  выше (87,56%  против  82,07%,  р0,01).  Различий  по  количеству  сперматозоидов с аномалиями шейки и хвоста не выявлено .

На  следующем  этапе  оценивали  распределение  отдельных  видов аномалий  каждого  из  отделов.  Результаты  дополняют  картину,  полученную  при  качественной оценке  с  помощью  индексов Крюгера и тератозооспермии  (таблица  1).  Показано,  что  в  группе  с успешным  исходом  переноса  эмбрионов  после  ИКСИ  наблюдали  более  высокое содержание  сперматозоидов  с  аномалиями  формы  головки  в  целом (на  9,93%),  а  также,  в  частности,  сперматозоидов  с  наиболее  деформированными  головками  -  гантелевидными  (на  2,25%)  и  аморфными (на  5,71%).  Кроме того,  в  группе с  произошедшей  имплантацией достоверно  выше  относительное  количество  сперматозоидов  с  аномальными  акросомами  (на 6,73%),  сперматозоидов с  чрезмерно большими головками  (на  2,10%),  сперматозоидов  с  вакуолями  (на  2,28%)  и  с двумя  головками  (на  1,13%).  Эти  дефекты,  как  правило,  видны  при проведении  ИКСИ,  что  способствует  более  успешной  селекции встречающихся  единичных сперматозоидов  нормальной  формы .

–  –  –

При  рассмотрении  различных  видов  патологии  шеечного  отдела сперматозоидов,  в  группе  I  обнаружено  более  высокое  содержание сперматозоидов с аномально короткими (0,65% против 0,01%, р=0,01) и  искривленными  шейками  (8,91%  против  6,88%,  р0,05).  Однако,  в группе  с  успешными  переносами  чаще  встречались  сперматозоиды  с аномалиями  прикрепления  шейки  к  головке  (15,25%  против  10,99%, р0,01) .

,  Из  различных  видов  аномалии  хвостового  отдела статистически достоверное  различие  (р0,01)  между  группами  наблюдалось  лишь по  числу сперматозоидов  с  аномальным количеством  жгутиков,  которых в группе II было в.7,3  раза больше .

Для  определения  степени  поражения  разных  отделов  сперматозоидов  были  введены  индексы  множественных  аномалий  каждого  из отделов,  учитывающие  характер  их  поражения.  Для  головки  принимали  в  расчет  аномалии  размера,  формы,  количества,  акросомальной области,  наличие  вакуолей  (возможные  значения  индекса  множественных  аномалий  головки  -  ИМАГ  =  1-5);  для  шейки  -  аномалии размера,  формы,  количества,  прикрепления  к  головке,  наличие  цитоплазматической  капли  (индекс  множественных  аномалий  шейки ИМАШ  =  1-5),  для  хвоста  -  аномалии  размера,  формы,  количества, наличие  патологических  изгибов  и  скрученности  (индекс  множественных  аномалий  хвоста  ИМАХ  =  1-4).  Индексы  множественных аномалий  рассчитывали  как  отношение  числа  патологий  данного  отдела сперматозоида к  количеству  сперматозоидов с аномалиями  этого отдела .

ИМАГ  был  выше  в  группе  пациенток,  у  которых  наступила  беременность. ИМАШ  как показатель тяжести  поражения  шеечного отдела  оказался  выше  в  группе  I,  что  свидетельствует  о  существенном значении  аномалий  шеечного отдела для эмбриогенеза (таблица 2) .

Для  определения  доминирующей  аномалии  сперматозоидов подсчитывали  частоту  встречаемости  отдельных  видов  аномалии  и  их сочетаний  у  каждого  пациента.  Для  этого  был  разработан  алгоритм, согласно  которому  каждому  виду  аномалии  по  ВОЗ  (грушевидные, гантелевидные,  округлые  и  т. д.)  присваивали свой  математический

–  –  –

порядок (единицы, десятки, сотни и т.д.), после чего значения суммировали,  и  по  полученному  числу можно  было  судить  о  наборе  аномалий  у  каждого  сперматозоида.  Например,  показатель  10100  означал сперматозоид с  аномально  маленькой  головкой  и дефектом  акросомы (которым  соответствовала  единица)  и  нормальные  значения  остальных  параметров  (которым  соответствовал  «0»).  Аномалии  шейки  и хвоста кодировали  по аналогичному принципу,  но с множителями 2 и 4,  соответственно,  чтобы  показатели  можно  было  складывать.  Например,  показатель  300  означал  сперматозоид  с  малыми  размерами головки  и  аномальным  прикреплением  шейки  (100+200)  при  нормальных значениях  остальных  параметров .

При  сравнении  доминирующих  аномалий  разных  отделов  сперматозоидов  между  исследуемыми  группами  выявлено,  что  в  группе  с зарегистрированной  имплантацией  доминирующей  аномалией  головок  (ДАГС)  является  удлиненная  форма  головки  в  сочетании  с  аномалией  акросомы.  Частота ее  встречаемости составила  14,28%,  что  на 3,72%  больше,  чем  относительное  количество  сперматозоидов  со вторым  по  частоте сочетанием дефектов  головок (маленький  размер  в сочетании  с  аномалией  акросомы)  (р0,01) .

  В  группе  без  имплантации  доминировали  сразу  несколько  сочетанных  аномалий,  частота встречаемости  которых  была  достоверно  выше,  чем  в  группе  II (р0,05):  сперматозоиды  с  головками  малых  размеров  в  сочетании  с аномалией  акросомы  (14,04%  против  10,56%),  с  головками  удлиненной  формы  (10,85%  против  8,35%),  грушевидной  формы  (10,71% против  7,99%),  а также  с  аномалией  акросомы  как  единственным  дефектом  (9,84%  против  6,78),  что  говорит  о  возможном  снижении  оплодотворяющей  способности  сперматозоидов с этими дефектами, или о роли  таких отклонений  как  индикаторов тяжелого нарушения сперматогенеза,  которое  может  затрагивать  и  морфологически  нормальные  сперматозоиды  на субмикроскопическом  уровне.  Так  или  иначе, относительное  количество  этих  форм  свыше  12,26%,  9,27%,  9,14%,  и 8,34%,  соответственно  (по  нижним  границам  95% доверительных  интервалов  в  группе  без  имплантации),  может  считаться  неблагоприятным прогностическим  признаком при производстве ИКСИ. Более высокая  частота  сперматозоидов  с  утолщенными  искривленными  шейками  (более  3,93%)  в  группе  без  имплантации  также  позволяет  отнести этот признак к числу  неблагоприятных .

Морфометрический  анализ  сперматозоидов.  Количественные  показатели,  имеющие  клиническую  значимость  при  проведении ИКСИ .

По  результатам  морфометрической  оценки  сперматозоидов  с использованием нормативных величин, рекомендованных ВОЗ, сперматозоиды  были  разделены  на  две  группы:  с  головками,  соответствующими  нормативным  параметрам  ВОЗ,  и  не  соответствующими им.  На  основании  нормативных  значений,  рекомендованных  ВОЗ, были рассчитаны нормативы по дополнительным параметрам, позволяющим количественно выразить степень отклонения формы головки от правильного  эллипса  с  ровными  контурами,  по  размерам  соответствующего  головке  нормального  сперматозоида:

-  площадь  головки,  соответствующий  нормативный  интервал  7,85-13,75  мкм2;

-  периметр  головки,  соответствующий  нормативный  интервал 10,21-13,35 мкм;

-  отношение  периметра  к  площади,  соответствующий  нормативный  интервал  0,97-1,3 .

Кроме того, в соответствии с определенными ВОЗ нормальными значениями  большой и  малой  осей  головки  сперматозоида,  диапазон допустимых значений  отношения  длины  к  ширине  был  расширен  до 1,42-1,75,  поскольку  при  минимально  допустимой  величине  малой оси (3,5 мкм) максимально допустимое значение большой оси (5 мкм) возможно лишь при их соотношении, равном  1,42 .

Определили  величины  фактора  формы  круга,  фактора  формы эллипса,  округлости  и  отношения  периметра  к  площади -  введенных нами  параметров,  позволяющих дать количественную характеристику форме  сперматозоидов,  -  и  сравнили  их  величины  между  группами сперматозоидов,  соответствующих  и  не  соответствующих  строгим критериям  Крюгера.  Выявленные  статистически  достоверные  различия  между  группами  позволили  определить  величины,  соответствующие  значениям  между  5-м  и  95-м  процентилями  и  характеризующие сперматозоиды, форма которых была признана соответствующей критериям  Крюгера  при  качественной  оценке.  Для  фактора  формы круга  интервал  этих  величин  составил  0,884-0,979  отн.  ед.,  для  фактора  формы  эллипса  0,995-0,999  отн.  ед.,  и  для  округлости  0,588отн. ед .

Кроме  того,  была  проведена  компьютерная  оценка  отделов  головок  сперматозоидов - акросомы  и  ядра.  Для  акросом  были  определены  интервалы  (границами  которых служили  5-й  и  95-й  процентили для  сперматозоидов,  оцененных  как  нормальные)  по  следующим  параметрам,  характеризующим  их  размеры  и  форму:  периметр  (7,42мкм),  большая  ось  (2,59-3,30  мкм),  малая  ось  (1,89-2,83  мкм), отношение  малой  оси  к большой (0,66-0,93),  отношение  периметра к площади (1,43-1,99),  фактор  формы  круга (0,746-0,953  отн.  ед.),  фактор  формы  эллипса  (0,946-0,983  отн.  ед.)  и  округлость  (0,605-0,805 отн.  ед.).  Для  ядра:  периметр  (7,56-10,1  мкм),  большая  ось (2,53-3,28 мкм),  малая  ось  (1,95-2,82  мкм),  отношение  малой  оси  к  большой (0,70-0,95),  отношение  периметра  к  площади  (1,46-2,02).  Полученные  показатели  могут  быть  использованы  при  автоматическом  компьютерном  морфологическом  анализе  сперматозоидов .

При  подсчете  относительного  количества  сперматозоидов,  соответствующих  перечисленным  новым  критериям,  в  группах  пациенток,  у  которых  перенос  эмбрионов  не  привел  к  наступлению  беременности  (группа  I)  и  пациенток,  у  которых  наступление  имплантации  было  зарегистрировано  по  данным  УЗИ  (группа  II),  была  обнаружена  меньшая  частота  встречаемости  сперматозоидов  с  нормальным  отношением  периметра  акросомы  к  ее  площади  в  группе  I (46,42%  против  52,84%  в  группе  забеременевших).  В  то  же  время, сперматозоидов с нормальным  фактором  круга было  меньше в группе II (39,92% против 46,17%) .

При  сравнении  данных,  полученных  при  компьютерной  морфологической  оценке  головок  сперматозоидов  в  группах  пациенток  с произошедшей  имплантацией  и  без  имплантации,  получены  достоверные различия  в  значениях фактора формы  круга,  округлости,  длины головки и соотношения большой и малой осей (таблица 3) .

Границы,  установленные  по 5-му  и  95-му  процентилям  в группе забеременевших,  оказались  шире, чем установленные на основе  качественной  оценки  сперматозоидов:  фактор  формы  круга  0,691-0,986;

округлость  0,397-0,775;  большая  ось  3,85-6,77  мкм;  отношение большая/малая  ось  1,29-2,63.  Характер  распределений  в  обеих  группах  схож,  но  для  фактора  формы  круга  характерен  сдвиг  в  сторону больших величин в группе без имплантации .

–  –  –

По  различиям  в величинах,  полученных при  морфометрической оценке  акросом,  также было возможно  выделить  границы,  соответствующие  5-му  и  95-му  процентилям  в  группе  забеременевших:  фактор формы  круга  0,683-0,964;  фактор  формы  эллипса  0,926-0,990  отн .

ед.;  округлость  0,425-0,830  отн.  ед.;  малая  ось  3,85-6,77  мкм;  отношение  малая/большая  ось  0,48-0,94;  процент  площади  от  площади всей  головки  15,53-60,64 .

При  оценке  распределения  частот  различных  видов  патологии головок  и  шеек  сперматозоидов  в  исследуемых  группах  обнаружена тенденция  к  повышенному  содержанию  сперматозоидов  с  аномальными  акросомами  в  группе  без  имплантации  (53,2%  против  48,3%, р=0,06) .

Оценка  доминирующих  комбинированных  аномалий  различных отделов  сперматозоидов  производилась  по  морфометрическим  нормативам  ВОЗ  и  по  предложенным  нами  показателям  количественной оценки  формы  сперматозоидов  (фактор  формы  круга,  фактор  формы эллипса, округлость, отношение периметра к площади) .

При  применении  нормативов ВОЗ достоверных различий  по доминирующим  аномалиям  обнаружено  не  было.  При  оценке  с  помощью предложенных нами  интервалов параметров для  количественной оценки  формы  сперматозоидов  обнаружена  более  высокая  частота встречаемости  сперматозоидов с сочетанием  отклонений  по  параметрам  фактор формы  круга + округлость + периметр + длина + ширина +  отношение  'периметр  акросомы  /  площадь  акросомы'  в  группе  с произошедшей  имплантацией  (3,43%  против  1,55%,  р0,05),  что  свидетельствует  о  меньшем  влиянии  этой  комбинации  морфологических дефектов  на  оплодотворяющую  способность  сперматозоида,  или  о том, что эта комбинация манифестирует менее тяжелые формы общего  нарушения  сперматогенеза.  По  остальным  комбинированным формам достоверных различий  не обнаружено .

Полученные  данные  позволяют дополнить объективную  морфометрическую  оценку  сперматозоидов  параметрами,  характеризующими  форму  головки  сперматозоида  (фактор  формы  круга,  фактор формы эллипса,  округлость, отношение  периметра к площади),  которые имеют особую значимость в случаях применения ИКСИ .

ОБСУЖДЕНИЕ  ПОЛУЧЕННЫХ  РЕЗУЛЬТАТОВ

Результаты  работы  свидетельствуют  о  ценности  интегральной морфологической  оценки  эякулята  как  прогностического  критерия при проведении ИКСИ, однако эта оценка имеет существенные отличия  от  общепринятой  методики,  применяемой  для  прогнозирования при  естественном  оплодотворении  и  ЭКО.  Обнаружен  ряд  выраженных  структурных аномалий  головок сперматозоидов,  частота  которых положительно  коррелирует  с  частотой  имплантации  эмбрионов.  Это может быть  связано  с  особенностями  выбора сперматозоида для  инъекции  при  повышенной  частоте  таких  аномалий  в эякуляте.  Предложены  новые  параметры  оценки,  один  из  которых  -  фактор  формы круга  головки  сперматозоида  - имеет  независимое  значение  для  прогнозирования  успешности  ИКСИ.  Показаны  отклонения  в  структуре сперматозоидов,  не  снижающие их оплодотворяющий  потенциал  при интрацитоплазматической  инъекции,  за счет  чего  предложены  новые нормативные  величины,  применимые  только  в  случаях  ИКСИ.  В  то же  время,  выделены  аномалии  строения  сперматозоидов  (акросомального  и  шеечного  отделов),  повышенная  частота  которых  в  эякуляте  является  неблагоприятным  признаком  при  ИКСИ.  Определение доминирующей  комбинированной  аномалии  сперматозоидов  в  эякуляте не имеет клинического значения .

Определены  морфометрические  параметры,  которые  дополняют критерии  ВОЗ  и  могут  быть  использованы  при  компьютерном  морфологическом  анализе  сперматозоидов  при  ЭКО,  поскольку  предоставляют возможность оценки  компьютером  не только  размеров,  но  и формы головки сперматозоида и ее частей (таблица 4) .

–  –  –

Кроме  того,  для  использования  в  практической  работе  предложены  следующие  параметры,  соответствующие  95%-ным  доверительным  интервалам  в  группе  с  зарегистрированной  имплантацией, как прогностически благоприятные в случаях ИКСИ (таблица 5) .

–  –  –

Из  этих  параметров,  определение  индекса  множественных  аномалий  шейки  и  относительного количества сперматозоидов  с искривленными  шейками  не  требует  специального  оборудования  и  может быть  использовано  в  повседневной  практике.  Для  измерения  остальных  показателей  необходимо  применение  методов  морфометрии,  в том  числе  с  использованием  вычислительной  техники.  Однако,  они могут приблизительно быть оценены  и  визуально,  что имеет значение для  диагностики  при  невозможности  морфометрии  и  для  выбора сперматозоида непосредственно во время  процедуры ИКСИ .

выводы 1.  Критерии,  полученные  при  качественной  оценке  строения сперматозоидов  с  использованием  индекса  Крюгера,  в  случаях  применения  метода  классического  экстракорпорального  оплодотворения положительно  коррелировали  не только с  частотой  оплодотворения  и качеством  дробления эмбрионов,  но  и  с  качеством  зигот,  что  расширяет  возможности  прогнозирования  результатов  лечения .

  Индекс  тератозооспермии  в этих случаях не имел значения .

2.  В  случаях  применения  метода  интрацитоплазматической инъекции  сперматозоида  отмечена  статистически  значимая  зависимость  частоты  имплантации  от  качественных  морфологических  характеристик  сперматозоидов,  причем  корреляция  с  индексом  Крюгера  была  отрицательной,  а  с  индексом  тератозооспермии  -  положительной,  что  следует  использовать  в  практике  для  выбора  метода  оплодотворения .

3.  Частота  имплантации  эмбрионов,  полученных  с  помощью интрацитоплазматической  инъекции  сперматозоида,  не  только  не снижается  с  повышением  относительного  количества сперматозоидов с ярко выраженными отклонениями  головок от нормального строения (гантелевидные,  аморфные,  чрезмерно  большие,  вакуолизированные, с  дефектами  акросом  и  аномалиями  количества,  повышенные  величины индекса множественных аномалий головки),  но и положительно коррелирует с  ним,  что  может быть  связано  с  более  успешной  селекцией  оператором  сперматозоидов  с  минимальными  нарушениями структурной организации для инъекции  в ооцит .

4.  Повышенная  частота  встречаемости  некоторых  дефектов шеечного  отдела  (искривление,  укорочение)  и  увеличение  индекса множественных  аномалий  шейки  в  группе  с  безуспешными  попытками  интрацитоплазматической  инъекции  свидетельствуют  о снижении оплодотворяющей  способности  сперматозоидов  с  поврежденными шейками .

5.  Определение  доминирующей  комплексной  аномалии  сперматозоидов  по  предложенным  нами  критериям  в  настоящее  время  не имеет  клинического  значения,  но  может  найти  применение  при  разработке  автоматизированных  компьютерных  методов  морфологического анализа спермы .

6.  Определены  дополняющие  критерии  Всемирной  организации  здравоохранения морфометрические  параметры,  численно характеризующие  форму  головки  сперматозоида  и  ее  частей  (фактор  формы  круга,  фактор  формы  эллипса,  округлость,  отношение  «периметр/площадь»,  отношение  «малая/большая  ось»),  одни  из  которых могут быть использованы  при  компьютерной  морфологической  оценке  спермы  при  классическом  экстракорпоральном  оплодотворении, другие  имеют  диагностическую  ценность  только  в  случаях  применения  метода  интрацитоплазматической  инъекции  сперматозоида.  Эти критерии  могут  быть успешно  использованы  при  качественном  и  количественном  морфологическом  анализе  эякулята  для  эффективной диагностики  мужского  бесплодия  и  определения  путей  его  преодоления .

Практические  рекомендации.  Обнаруженные  особенности строения сперматозоидов и предложенные новые параметры их оценки  позволяют  использовать  качественные  и  количественные  методы интегрального  морфологического  анализа  спермы  для  прогнозирования  успешности  ИКСИ  и  повышения  эффективности  микроманипуляции,  а также  могут  быть  положены  в  основу  создания  методов  автоматизированной  компьютерной  морфометрии  сперматозоидов  для введения  в  практическую  медицину.  Введение  результатов  данной работы  в  клиническую  практику  будет  способствовать  более  адекватному  планированию  тактики  лечения  методами  вспомогательных  репродуктивных  технологий  и  в  некоторых  случаях  позволит  избежать необоснованного применения ИКСИ за счет обоснования применения ЭКО  или  использования  донорской  спермы.  Это  даст  возможность повысить  эффективность  лечения  бесплодия,  уменьшить  психоэмоциональную  нагрузку  на пациентов  и  снизить  финансовые и  временные затраты .

Список работ, опубликованных по теме диссертации 1.  Зависимость  успешности  интрацитоплазматической  инъекции сперматозоидов  от  их  морфологических  особенностей  /  А.А.  Бесков, А.Г.  Маркдорф,  Д.С.  Бронештер,  А.Ю.  Высоцкий,  В.А.  Шкурупий  // Проблемы  репродукции.-2003.-№5.-С.35 .

2.  Влияние  морфологических  характеристик  сперматозоидов, пронуклеусов и  эмбрионов на результаты  лечения бесплодия  методом экстракорпорального оплодотворения / А.Ю. Высоцкий, А.А. Бесков, Д.С. Бронештер, А.Г. Маркдорф, В.А. Шкурупий. // Проблемы репродукции.-2003 -№5.-С.37 .

3.  Особенности  стимуляции  суперовуляции  и  экстракорпорального оплодотворения, влияющие на качество дробления эмбрионов In vitro / А.Ю. Высоцкий, А.А. Бесков, Д.С. Бронештер, А.Г. Маркдорф, В.А.  Шкурупий //Проблемы репродукции.-2003.-№5.-С.36-37 .

4.  Strict  morphology  of spermatozoa  have  discordant  predictive  value for  ICSI  and  conventional  IVF  /  A.A.  Beskov,  A.G.  Markdorf,  A.Y.  Vysotsky,  D.S.  Broneshter,  V.A.  Shkurupy  //  Reproductive  Biomedicine Online.-2003.-Vol.7,Suppl.l.-P.21 .

5.  Морфологическая  оценка  сперматозоидов  как  критерий  прогнозирования  успешности  применения  вспомогательных  репродуктивных  технологий  /  А.А.  Бесков,  В.А.  Шкурупий,  А.Ю.  Высоцкий, Д.С.  Бронештер,  Т.А.  Негуляева  //  Сибирский  консилиум.-2004.С. 39-44 .

6.  Роль  оценки  качества  зигот  и  эмбрионов  в  прогнозировании успешности  экстракорпорального  оплодотворения  и  переноса  эмбрионов / А.Ю. Высоцкий, В.А. Шкурупий, А.А. Бесков, Д.С. Бронештер, А.Г. Маркдорф // Сибирский консилиум.-2004.-№1(31).-С. 34Vysotski  A.Y.  Morphology  of  spermatozoa  affects  human  embryo quality  in  vitro  depending  on  the  method  of fertilization  /  A.Y.  Vysotski, A.A.  Beskov,  A.G.  Markdorf,  D.S.  Broneshter  //American  Society  of Andrology:  29th  Annual  Meeting.  April  17-20,  2004,  Baltimore,  Maryland, Program  and  Abstracts.-2004.-P.62 .

8.  Vysotski  A.Y.  The  impact  of genital  infection  on  human  spermatozoa assessed  by  spermograms,  including  strict morphological  analysis,  and the  outcome  of  in  vitro  fertilization  /  A.Y.  Vysotski,  A.A.  Beskov,  A.G .

Markdorf,  D.S.  Broneshter  //  American  Society  of Andrology:  29th  Annual  Meeting.  April  17-20,  2004,  Baltimore,  Maryland,  Program  and  Abstracts.-P.62 .

СПИСОК  СОКРАЩЕНИЙ

ВОЗ - Всемирная  организация здравоохранения ДАГС -доминирующая  аномалия  головок  сперматозоидов ИК - индекс Крюгера ИКСИ - интрацитоплазматическая инъекция сперматозоида ИМАГ - индекс  множественных аномалий  головок сперматозоидов ИМАХ -  индекс  множественных  аномалий  хвостового  отдела сперматозоидов ИМАШ - индекс  множественных аномалий  шеечного  отдела сперматозоидов ИТЗ - индекс тератозооспермии Отн.  ед. - относительные единицы УЗИ  -  ультразвуковое  исследование ЭКО - классическое  экстракорпоральное  оплодотворение

Соискатель

Подписано в печать 14.05.2005 .

Формат 60x84/16. Объем 1 п.л .

Бумага офсетная. Печать ризографическая. Тираж 100 экз. Заказ № 14 .

Отпечатано: РА «ПАРАГРАФ», г. Барнаул, пр. Ленина, 40, каб. 334,тел.: (385-2) 366-143 Лицензия на полиграфическую деятельность ПД 12-061 от 04.01.2002 г






Похожие работы:

«Жамурина Надеязда Алексеевна ПОПУНЯЦИОННАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ ДИК0РАСТУ1ДИХ ВИДОВ POPULUSL. НА ТЕРРИТОРИИ ОРЕНБУРГСКОГО ПРИУРАЛЬЯ 03.00.05.-ботаника АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических н^к V V. Оренбург, 2006 Работа выполнена в ФГОУ ВПО "Оренбургский государственный аграрный униве...»

«Экосистемы. 2016. Вып. 8. С. 59–62 УДК 502.75 ДИНАМИКА ВОЗРАСТНОЙ СТРУКТУРЫ ПРОСТРЕЛА ЛУГОВОГО (PULSATILLA PRATENSIS MILL.) В БАЛАШОВСКОМ РАЙОНЕ САРАТОВСКОЙ ОБЛАСТИ Шаповалова А. А. Балашовский институт Саратовского национального государственного исследовательского университета, Балашов, kupena07@rambler.ru В 20...»

«z R \m ?ппп Ha правах рукоппси ВЯТКШ! Александр Иванович РОД К Р А С О Д Н Е В (HE.MEROCALLIS L, BCtJEIlPH 03 00.05 -"Ботаника" АВТОРЕФЕРАТ диссертации, на соискание ученой степени кандидата биологических наук Q \J Новосибирск 2000 Работа выполнена в Цент...»

«ШАБАНОВА Маргарита Михайловна МНОГОЩЕТИНКОВЫЕ  ЧЕРВИ  СЕМЕЙСТВА  POLYNOIDAE (ANNELIDA,  POLYCHAETA).  СИСТЕМА  И  ФИЛОГЕНИЯ. 03.00.08  -  зоология АВТОРЕФЕРАТ диссертации  на  соискание ученой  степени кандидата  биологи...»

«У ЗОГРАФ ЮЛИЯ КОНСТАНТИНОВНА Ультраструктура мужской половой системы и сперматозоидов у свободноживущих морских нематод из отряда Chromadorida 03.00.25 гистология, цитология, клеточная биология 03.00,08-зоология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биолог...»

«Хапчаев Аскер  Юсуфович ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ  КИНАЗЫ ЛЕГКИХ ЦЕПЕЙ  МИОЗИНА И  БЕЛКА KRP  В РЕГУЛЯЦИИ  СОКРАТИТЕЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ  ГЛАДКИХ МЫШЦ 03.00.04 - Биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени...»

«ШОРИНА Марина  Владимировна АККУМУЛЯЦИЯ КАДАВЕРИНА И ЕГО ФИЗИОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ ПРИ ДЕЙСТВИИ СОЛЕВОГО СТРЕССА 03.00.12 - "физиология и биохимия растений" АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва - 20...»







 
2018 www.lit.i-docx.ru - «Бесплатная электронная библиотека - различные публикации»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.