«СПЕРМА БЫКОВ НЕРАЗБАВЛЕННАЯ ГОСТ Методы биологических исследований Non-diluted sperm of bulls. 20909.4-75 Methods of biological tests Постановлением Государственного комитета ...»

УД К 619:611-012.11:620.193.1(081.74).Группа Р39

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ СОЮЗА ССР

СПЕРМА БЫКОВ НЕРАЗБАВЛЕННАЯ

ГОСТ

Методы биологических исследований

Non-diluted sperm of bulls .

20909.4-75

Methods of biological tests

Постановлением Государственного комитета стандартов Совета Министров СССР

от 19 сентябре 197J г. Не 2440 срои действия установлен с 01.07.76 до 01.07.81 Несоблюдение стандарта преследуется по закону Настоящий стандарт распространяется на неразбавленную свежепол ученную сперму быков и устанавливает методы испытаний биологических свойств спермы — подвижности -сперм неа. абсо­ лютной выживаемости и выжлваомосгн спермнев в часах, осмоти­ ческой (физиологической) резистентности, активности дегидроге­ наз и резистентности спермнев к холодовому шоку .

1. МЕТОД ОТБОРА ПРОБ

1.1. Отбор проб — по ГОСТ 20909.1—75 .

1.2. Д ля проведения испытаний используют сперму, хранившу­ юся при температуре 30— 35*0 не более 30 мин с момента ее по­ лучения .

2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПОДВИЖНОСТИ СПЕРМНЕВ

Сущность метода заключается в определении количества спермиев с прямолинейным.поступательным движением .

2.1. О б о р у д о в а « и е -и р е а к т и в ы 2.1:1. Для проведения испытания применяют:

микроскоп биологический марки МБИ или МБР по ГОСТ 8284—67;

термостат ТМ-1 или другой конструкции, снабженный стандарт­ ным контактным или нестандартным однотемпературным термо­ метром;

Издание официальное Перепечатка воспрещена блуза ГОСТ 20М М —7SCrp. 2 стерта покровные по ГОСТ 6672 — 59;

стекла предметные по ГОСТ 9284—59;

стекла предметные с углублением;

палочки стеклянные или пипетки пастеровские;

натрий лимоннокислый трехза мешенный по ГОСТ 5.1314—72, 3%-ный раствор;

«атрий хлористый по ГОСТ4233—66, 1%-ный раствор .

2.2. П о д г о т о в к а к и с п ы т а н и ю 2.2.1. Подготовка и стерилизация лабораторной посуды — по ГОС Т 20939.2—75 .

2.2.2. Термостат включают за 20—30 мин до качала работы .

Температура л термостате должна быть 40—42°С .

2.2.3. Предметные и покровные стекла, стеклянные палочки, пипетки и растворы подогревают до 35—40°С .

2.3. П р о в е д е н и е и с п ы т а н и я 2.3.1. Подвижность спермиев определяют в раздавленной капле спермы под микроскопом в проходящем свете при увеличении 100—180*. Более точно количество живых и мертвых спермине оп­ ределяют в счетной камере по ГОСТ 20909.3—75 .

2.3.2. Пр« определении подвижности оиермиев иод микроскопом наносят на предметное стекло теплой стерильной стеклянной па­ лочкой или пастеровской пипеткой небольшую каплю спермы, к ко­ торой добавляют двух-четырех кратное количество 3% -«ого рачтпора лимоннокислого натрия. Сперму с раствором лимоннокисло­ го натрия тщательно перемешивают и накрывают покровным стеклом. Просматривают под микроскопом весь препарат. Под­ счет •шеротев производят не менее чем в трех полях эреш я мик­ роскопа с наибольшей подвижностью спермиев. Подсчитывают ко­ личество спермиев с прямолинейным поступательным движением н отдельно — количество спермиев с неправильным движением — манежным (перемещение по кругу). колебательным (спермин не перемещаются, но производят движение головкой или хвости­ ком) и мертвых спермиев .

2.4. О б р а б о т к а р е з у л ь т а т о в 2.4.1. Подвижность спермиев (Пс ) в баллах вычисляют по формуле где л — общее число подсчитанных спермиев;

Я] — число подсчитанных спермиев с прямолинейным посту­ пательным движением;

10— постоянный коэффициент .

За окончательный результат испытания принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений. Ми­ нимальной подвижностью спермиев принято считать подвижность, равную 0,5 балла .

Стр 3 ГОСТ 20909.4--7S

3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АБСОЛЮТНОЙ ВЫЖИВАЕМОСТИ

И ВРЕМЕНИ ВЫЖИВАЕМОСТИ СЛЕРМИЕ8

'Сущность метода заключается в установлении подвижттоста спсрмисв за каждый последовательный интервал времени в про­ цессе хранения спермы после ее разбавления .

Выживаемость спсрмисв в часах определяют но количеству Времени, прошедшего от начала хранения спермы до ее гибели .

3.1. О б о р у д о в а н и е и р е а к т и в ы 3.1.1. Оборудование « реактивы — по п. 2.1:

«глкхкоэо- нитратно -желточм а я среда — «о ГОСТ 14746—69 .

3.2. П р о в е д е н и е и с п ы т а н и я 3.2.1.Отбирают из одного эякулята или серии спермы не менее двух проб для анализа, которые разбавляют глюкоэо-цитратиожелточной средой, приготавливая одно из.разведений от 1:8 до 1:32, и сохраняют при 2—оьС .

Подвижность сперм ней определяют через каждые 24 ч (в на­ чале хранения можно через 48 ч) по -п. 2.3. Последним днем ис­ пытания считают день, когда наблюдается единичная подвижность слермиев и нельзя установить минимальную «подвижность спермиев в баллах .

3.3. О б р а б о т к а р е з у л ь т а т о в 3.3.1. Абсолютную выживаемость «спермиев (S) вычисляют по формуле 5==я1 + Oj/j-f-tfj/j-K” + /| где ai, а2, а3... а п — подвижность спермнев за интервалы вре­ мени, баллы;

а, /г. 13... — последовательные интервалы времени, в течение которых подвижность спермнев со­ ответственно равна а,, о2. а 3... о „, ч, вы­ числяемые но л. 3.3.2;

a J и аг1 a3l3...a „ t„ — выживаемость слермиев за последователь­ 2, ные интервалы времени .

За окончательный результат испытания принимают среднее арифметическое результатов двух или -более параллельных опре­ делений. Допускаемые расхождения между двумя параллельны­ ми определениями «е должны превышать *10%. Бели из трех ил»

четырех определений одно имеет расхождение более чем на *10% .

то среднее аротфмегнческое вычисляют соответственно по двум или трем определениям. Если из трех или четырех определений два имеют расхождение более чем на *10%, то испытание повто­ ряют .

При проведении пяти определений среднее зрифметическое вы­ числяют по трем определениям, при шести или семи определени­ ях — по четырем, -при восьми « девяти определениях — сю пята определениям, имеющим расхождение не более *10% .

Н ГОСТ 20909.4—75 Crp. 4

3.32. Интервалы времени /|, ti, /3... ) в часах вычисляют по формуле ti.ад..=»Г«41ГХ"г-«., где Г — время, прошедшее от начала испытания до дня следую­ щего испытания, ч;

п — порядковый номер дня испытания .

При определении выживаемости спер мне а в день испытания, когда нельзя установить минимальную подвижность слермиев, ин­ тервал времени ( / „) в часах вычисляют по формуле

–  –  –

где Т п — время, прошедшее от начала испытания до :юслед«»его дня ИСПЫТ8ЯВ1Я, ч .

Результаты испытании.по определению -подвижности сиермиев при вычислении абсолютной выживаемости и выживаемости снермиев в часах записывают в журнале испытаний. Форма журнала для записи результатов.испытаний, а также примеры вычислений абсолютной выживаемости спсрмиев, интервала времени и выжи­ ваемости слермиев в часах приведены в приложениях 1 и 2 .

4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСМОТИЧЕСКОЙ (ФИЗИОЛОГИЧЕСКОЙ)

РЕЗИСТЕНТНОСТИ СПЕРМИЕВ

Сущность метода заключается в определении устойчивости слермиев к действию гипотонического раствора хлористого натрия .

4.1. О б о р у д о в а н и е и р е а к т и в ы 4.1.1. Для проведения испытания применяют:

микроскоп биологический марки Л1БИ или МБ!1 по ГОСТ 8284" 67;

термостат ТМ-1 для микроскопа;

флаконы вместнмостыю 10—15 мл или пробирки;

михросгипетюи стеклянные по ГОСТ 12487—67;

колбы стеклянные вместимостью 100—500 мл но ГОСТ 12487—67;

стекла предметные ж ГОСТ 9284—59;

стекла покровные по ГОСТ 6672—59;

Стр. 5 ГОСТ УММЛ—75

–  –  –

значением концентрации раствора хлористого натрия, при которой подвижность спермиев составляет -не менее 0,5 балла. Чем ниже концентрация раствора хлористого натрия, в котором спермин ос­ таются живыми, тем выше осмотическая резистентность спермы .

Пример. В «робирке М 8 (0,16%-ный раствор хлористого на­ трии) определена единичная подвижность спермиев, а в пробирке № 7 (0,2%-ный раствор хлористого натрия) подвижность -^гершиев 0.5 балла. Следовательно, значение осмотической резистент­ ности спермы равно 0,2. Или. если в пробирке М 8 мертвые спер­ ?

ший, в пробирках.M 7 « 6 единичная подвижность спермиев, а в r пробирке Л? 5 (0.3%-ный раствор хлористого натрия) подвиж­ ность — 0.5 балла. Следовательно, осмотическая резистентность спермы равна 0,3 .

4.42. Коэффициент резистентности ( R K) вычисляют но фор­ муле R _ ол где 0,1 — постоянный коэффициент;

осмотическая резистентность (концентрация -раствора хлористого натрия, %) .

5. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ДЕГИДРОГЕЯАЭНОЙ АКТИВНОСТИ СПЕРМЫ

Сущность метода заключается в определении скорости обес­ цвечивания метиленовой сини, добавленной к сперме .

Скорость обесцвечивания метиленовой сини зависит от актив­ ности дегидрогеназ-ферментов дыхания спермиев .

Дегидрогенадаую активность спермы определяют з капиллярах или в пробирках .

5.1. М е т о д о п р е д е л е н и я д е г и д р о г с н а з н о й а к ­ т и в н о с т и спермы в капиллярах 5.1.1. Оборудование и реактивы

Для проведения испытания применяют:

термостат ТМ-1 для 'микроскопа;

термометр по ГОСТ 215—73;

термостат или ультратермостат, юли баню водяную;

секундомер по ГОСТ 5072—72;

-стекла предметные по ГОСТ 9284-^59;

пипетки глазные и пастеровские;

трубочки стеклянные длиной 5 — см с внутренним диаметром 0,8—1,0,мм или катетеры от шприцов для искусственного осеме­ нения коров;

натрий хлористый по ГОСТ 4233—66;

синь метиленовую 0,01 %-ный раствор;

воду дистиллированную по ГОСТ 6709—72 .

5.1.2. Подготовка к испытанию Стр. 7 ГОСТ 30909.4—75 5.1.2.1. Концентрацию с тем н е в в сперме определяют но ГОСТ 20909.5—75 .

,5.1.2.2. Подвижность спермиев определяют по п. 2.3 .

Раствор мели.чековой сини готовят, растворяя 0,01 г метилено­ вой сини и 0,9 г хлористого натрия в 100 мл дистиллцровамной воды .

5.1.3. Проведение испытания На чистое предметное стекло,.подогретое до 30— C, наносят 37B 0,05 мл (каплю) спермы м добавляют теплой пипеткой такое же количество (каплю) 0,01%-ного раствора метиленовой он ни, подо­ гретой до Ж С. Смесь спермы с краской тщательно смешивают и набирают ее в теплую (30—ЗГС) стеклянную т.рубку, рассчиты­ вая, чтобы высота столбика смеси составляла 2—3 см. Столбик смеси, не содержащий пузырьков воздуха, располагают в центре трубки .

Трубочку, заполненную смесью опермы с метиленовой синью, помещают в термостат при температуре 37-0,5'С на лист белой бумаги в горизонтальнол! положении. Записывают время начала испытания и окончания обесцвечивания метиленовой синя. При этом учитывают, что концы столбкка (1—2 мм) обычно не обес­ цвечиваются .

5.1.4. Обработка результатов о. 1.4.1. Дегндрогеназную активность спермы выражают в ус­ ловных единицах .

За единицу активности принимают такую активность, когда 1 млрд, спермиев обесцвечивает за 1 мин 0,05 мл 0.01%-ного ра­ створа метиленовой сини (0.000005 г порошка метиленовой сини) .

5.1.4.2. Дегидрогеназную акт)шность спермы ( Д а ) в условных единицах вычисляют по формуле 7 - Пс / С Ма~ где П е — подвижность спермнсв, баллы;

t — время обесцвечивания метиленовой сини в опыте,.мин ^ С — концентрация спермы, мл-рд4мл;

10 — постоянный коэффициент .

За окончательный результат испытания принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений .

Допускаемые расхождения -между результатами двух парал­ лельных определений не должны превышать *40% .

5.2. Метод определения д ег и д р о г е м а зной ак­ тивности спермы d пробирках 5.2.1. Оборудование и реактивы

Для проведения.испытания п-римеияют:

термостат ТМ-1 для микроскопа;

термометр по ГОСТ 215—73;

термостат или ультратермостат, или баню, водяную;

ГОСТ 20*09.4—/S Стр. 8 секундомер но ГОСТ 5072—72;

•стекла предметные тто ГОСТ 9284—59;

пипетки стеклянные вместимостью 1 мл по ГОСТ 12487--67;

колбы стеклянные по'ГОСТ 12487—67;

пробирки стеклянные вместимостью 5 мл и диаметром 1 см;

синь метиленовую, 0,05%-ный раствор;

натрий лимоннокислый но ГОСТ 5.1314—72;

•масло вазелиновое по ГОСТ 3164—52, х.ч.;

глюкозу по ГОСТ 4233--66;

воду дистиллированную но ГОСТ 6709—72 .

5.2.2. Подготовка к испытанию 5.2.2.1. Приготовляют глюкозо-цитратный раствор на прокипя­ ченной дистиллированной воде, для чего растворяют в колбе вме­ стимостью 100 мл 3 г глюкозы и 1,4 г лимоннокислого натрия .

Раствор доводят до метки «одой .

6.2.2.2. Раствор метиленовой сини 'готовят на (прокипяченной дистиллированной воде, растворяя в мерной колбе вместимостью 100 мл 3 г глюкозы, 1,4 г цитрата натрия и 0,05 г метиленовой сини. Объем раствора доводят до метки .

5.2.2.3. Концентрацию еяермиев определяют по ГОСТ 20909.5-75 .

5.2.3. Проведение испытания Б чистую, подогретую до 30—37*0 стеклянную пробирку вно­ сят 0,8 мл теплого (37—45X1) глюкозо-нитратного раствора, добав­ ляют 0,1 мл 0,05%-ного раствора метиленовой синя и 0,2 мл спермы. Содержимое тщательно перемешивают и наслаивают очи­ щенное вазелиновое масло в таком количестве, чтобы получился столбик масла высотой 0,5—4,0 см .

Пробирки со смесью ставят в термостат или в водяную баню при температуре 45*С и учитывают время обесцвечивания ацетиле­ новой сили .

Допускается одновременно определять показатель выживаемо­ сти спермнев три температуре 45Х. Для этого через каждые 10— 1о мин из пробирок берут пробу стеклянной палочкой и оценива­ ют подвижность спермиев по л. 2.3 .

5.2.4. Обработка результатов Депндрогеназную активность спермы и коэффициент дегидро»

ген а зной активности -вычисляют по яп. 5.1.4 и 5.1.5 .

. ОПРЕДЕЛЕНИЕ РЕЗИСТЕНТНОСТИ СПЕРМИЕВ

К ХОЛОДОВОМУ ШОКУ

Сущность метода заключается в определении выживаемости опершие в после быстрого ш охлаждения до температуры 1—3°С .

6.1. О б о р у д о в а и не и р е а к т и в ы 6.1.1. Д ля проведения испытания применяют:

микроскоп биологический марки МБИ или.МБР по ГОСТ 8284-67;

Стр. 9 ГОСТ 20909.4—75 термостат ТМ-1 для микроскопа;

стекла предметные по ГОСТ 9284—59;

стекла (покровные размером 18x18.или 24X24 им по ГОСТ 6672—59;

палочки стеклянные или пипетки пастеровские;

флаконы вмесли мостью 2 м л;

глюкозу по ГОСТ 6038—74, 6%-ный раствор .

6.2. П о д г о т о в к а к и с п ы т а н и ю 6.2.1. Перед началом работы готовят на прокипяченной дистил­ лированном воде 6%-ный раствор глюкозы, растворяя 6 г глюкозы в мерной колбе вместимостью 100 мл. Объем раствора доводят во­ дой до метки. Приготовленный (раствор разливают по 1—2 !.чл в пробирки или флаконы из расчета на каждую пробу спермы не менее трех пробирок .

Готовят ванну со льдом с температурой 2 - ГС, в которую не менее чем за 5 мин до начала исследования ставят для охлажде­ ния по две из трех пробирок. Третью пробу с 6%-ным раствором глюкозы ставят в термостат при температуре 37—40°С .

Подвижность спермиев определяют по п. 2-3 .

6.3. II р о в е д е н и е и с п ы т а н и я 6.3.1. Одну-две капли неразбавленной спермы, выдержанной при комнатной температуре не менее 10 и не более 30 мин, вносят стеклянной пипеткой в пробирки или флаконы с 6%-ным раство­ ром глюкозы, охлажденной до 2± ГС, и в пробирку с раствором, подогретым до 37—40вС. Выдерживают 5 мин. Подвижность спер­ миев определяют под микроскопом по и. 2.3. '

6.4. О б р а б о т к е р е з у л ь т а т о в 6.4.1. Резистентность спермиев к холодовому шоку (/?„) вы­ числяют по формуле где а\ — подвижность спермиев через 5 мин после внесения спер­ мы в 6%-ный раствор глюкозы при температуре 2* ГС, баллы;

а2 — подвижность спермиев через 5 мип после внесения спер­ мы в 6%-ный раствор глюкозы при температуре 37—• 4(ГС, баллы .

За окончательный результат испытания принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений. До­ пускаемые расхождения между результатами параллельных оп­ ределений не должны превышать *10% .

Пример. Подвижность спермиев в 6%-ном растворе глюкозы при температуре 37—40‘С — 8,0 баллов, а.в растворе с темпера­ турой 2 * ГС — 1,5 балла .

Следовательно, резистентность к холодовому шоку ПРИЛОЖЕНИЕ ! к ГОСТ 2090М -75 Рекомендуемое

–  –  –

ГОСТ 20909.4-75