«СПЕРМА БЫКОВ НЕРАЗБАВЛЕННАЯ ГОСТ Методы биологических исследований Non-diluted sperm of bulls. 20909.4-75 Methods of biological tests Постановлением Государственного комитета ...»
УД К 619:611-012.11:620.193.1(081.74).Группа Р39
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ СОЮЗА ССР
СПЕРМА БЫКОВ НЕРАЗБАВЛЕННАЯ
ГОСТ
Методы биологических исследований
Non-diluted sperm of bulls .
20909.4-75
Methods of biological tests
Постановлением Государственного комитета стандартов Совета Министров СССР
от 19 сентябре 197J г. Не 2440 срои действия установлен с 01.07.76 до 01.07.81 Несоблюдение стандарта преследуется по закону Настоящий стандарт распространяется на неразбавленную свежепол ученную сперму быков и устанавливает методы испытаний биологических свойств спермы — подвижности -сперм неа. абсо лютной выживаемости и выжлваомосгн спермнев в часах, осмоти ческой (физиологической) резистентности, активности дегидроге наз и резистентности спермнев к холодовому шоку .
1. МЕТОД ОТБОРА ПРОБ
1.1. Отбор проб — по ГОСТ 20909.1—75 .
1.2. Д ля проведения испытаний используют сперму, хранившу юся при температуре 30— 35*0 не более 30 мин с момента ее по лучения .
2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПОДВИЖНОСТИ СПЕРМНЕВ
Сущность метода заключается в определении количества спермиев с прямолинейным.поступательным движением .2.1. О б о р у д о в а « и е -и р е а к т и в ы 2.1:1. Для проведения испытания применяют:
микроскоп биологический марки МБИ или МБР по ГОСТ 8284—67;
термостат ТМ-1 или другой конструкции, снабженный стандарт ным контактным или нестандартным однотемпературным термо метром;
Издание официальное Перепечатка воспрещена блуза ГОСТ 20М М —7SCrp. 2 стерта покровные по ГОСТ 6672 — 59;
стекла предметные по ГОСТ 9284—59;
стекла предметные с углублением;
палочки стеклянные или пипетки пастеровские;
натрий лимоннокислый трехза мешенный по ГОСТ 5.1314—72, 3%-ный раствор;
«атрий хлористый по ГОСТ4233—66, 1%-ный раствор .
2.2. П о д г о т о в к а к и с п ы т а н и ю 2.2.1. Подготовка и стерилизация лабораторной посуды — по ГОС Т 20939.2—75 .
2.2.2. Термостат включают за 20—30 мин до качала работы .
Температура л термостате должна быть 40—42°С .
2.2.3. Предметные и покровные стекла, стеклянные палочки, пипетки и растворы подогревают до 35—40°С .
2.3. П р о в е д е н и е и с п ы т а н и я 2.3.1. Подвижность спермиев определяют в раздавленной капле спермы под микроскопом в проходящем свете при увеличении 100—180*. Более точно количество живых и мертвых спермине оп ределяют в счетной камере по ГОСТ 20909.3—75 .
2.3.2. Пр« определении подвижности оиермиев иод микроскопом наносят на предметное стекло теплой стерильной стеклянной па лочкой или пастеровской пипеткой небольшую каплю спермы, к ко торой добавляют двух-четырех кратное количество 3% -«ого рачтпора лимоннокислого натрия. Сперму с раствором лимоннокисло го натрия тщательно перемешивают и накрывают покровным стеклом. Просматривают под микроскопом весь препарат. Под счет •шеротев производят не менее чем в трех полях эреш я мик роскопа с наибольшей подвижностью спермиев. Подсчитывают ко личество спермиев с прямолинейным поступательным движением н отдельно — количество спермиев с неправильным движением — манежным (перемещение по кругу). колебательным (спермин не перемещаются, но производят движение головкой или хвости ком) и мертвых спермиев .
2.4. О б р а б о т к а р е з у л ь т а т о в 2.4.1. Подвижность спермиев (Пс ) в баллах вычисляют по формуле где л — общее число подсчитанных спермиев;
Я] — число подсчитанных спермиев с прямолинейным посту пательным движением;
10— постоянный коэффициент .
За окончательный результат испытания принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений. Ми нимальной подвижностью спермиев принято считать подвижность, равную 0,5 балла .
Стр 3 ГОСТ 20909.4--7S
3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АБСОЛЮТНОЙ ВЫЖИВАЕМОСТИ
И ВРЕМЕНИ ВЫЖИВАЕМОСТИ СЛЕРМИЕ8
'Сущность метода заключается в установлении подвижттоста спсрмисв за каждый последовательный интервал времени в про цессе хранения спермы после ее разбавления .Выживаемость спсрмисв в часах определяют но количеству Времени, прошедшего от начала хранения спермы до ее гибели .
3.1. О б о р у д о в а н и е и р е а к т и в ы 3.1.1. Оборудование « реактивы — по п. 2.1:
«глкхкоэо- нитратно -желточм а я среда — «о ГОСТ 14746—69 .
3.2. П р о в е д е н и е и с п ы т а н и я 3.2.1.Отбирают из одного эякулята или серии спермы не менее двух проб для анализа, которые разбавляют глюкоэо-цитратиожелточной средой, приготавливая одно из.разведений от 1:8 до 1:32, и сохраняют при 2—оьС .
Подвижность сперм ней определяют через каждые 24 ч (в на чале хранения можно через 48 ч) по -п. 2.3. Последним днем ис пытания считают день, когда наблюдается единичная подвижность слермиев и нельзя установить минимальную «подвижность спермиев в баллах .
3.3. О б р а б о т к а р е з у л ь т а т о в 3.3.1. Абсолютную выживаемость «спермиев (S) вычисляют по формуле 5==я1 + Oj/j-f-tfj/j-K” + /| где ai, а2, а3... а п — подвижность спермнев за интервалы вре мени, баллы;
а, /г. 13... — последовательные интервалы времени, в течение которых подвижность спермнев со ответственно равна а,, о2. а 3... о „, ч, вы числяемые но л. 3.3.2;
a J и аг1 a3l3...a „ t„ — выживаемость слермиев за последователь 2, ные интервалы времени .
За окончательный результат испытания принимают среднее арифметическое результатов двух или -более параллельных опре делений. Допускаемые расхождения между двумя параллельны ми определениями «е должны превышать *10%. Бели из трех ил»
четырех определений одно имеет расхождение более чем на *10% .
то среднее аротфмегнческое вычисляют соответственно по двум или трем определениям. Если из трех или четырех определений два имеют расхождение более чем на *10%, то испытание повто ряют .
При проведении пяти определений среднее зрифметическое вы числяют по трем определениям, при шести или семи определени ях — по четырем, -при восьми « девяти определениях — сю пята определениям, имеющим расхождение не более *10% .
Н ГОСТ 20909.4—75 Crp. 4
3.32. Интервалы времени /|, ti, /3... ) в часах вычисляют по формуле ti.ад..=»Г«41ГХ"г-«., где Г — время, прошедшее от начала испытания до дня следую щего испытания, ч;
п — порядковый номер дня испытания .
При определении выживаемости спер мне а в день испытания, когда нельзя установить минимальную подвижность слермиев, ин тервал времени ( / „) в часах вычисляют по формуле
где Т п — время, прошедшее от начала испытания до :юслед«»его дня ИСПЫТ8ЯВ1Я, ч .
Результаты испытании.по определению -подвижности сиермиев при вычислении абсолютной выживаемости и выживаемости снермиев в часах записывают в журнале испытаний. Форма журнала для записи результатов.испытаний, а также примеры вычислений абсолютной выживаемости спсрмиев, интервала времени и выжи ваемости слермиев в часах приведены в приложениях 1 и 2 .
4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСМОТИЧЕСКОЙ (ФИЗИОЛОГИЧЕСКОЙ)
РЕЗИСТЕНТНОСТИ СПЕРМИЕВ
Сущность метода заключается в определении устойчивости слермиев к действию гипотонического раствора хлористого натрия .4.1. О б о р у д о в а н и е и р е а к т и в ы 4.1.1. Для проведения испытания применяют:
микроскоп биологический марки Л1БИ или МБ!1 по ГОСТ 8284" 67;
термостат ТМ-1 для микроскопа;
флаконы вместнмостыю 10—15 мл или пробирки;
михросгипетюи стеклянные по ГОСТ 12487—67;
колбы стеклянные вместимостью 100—500 мл но ГОСТ 12487—67;
стекла предметные ж ГОСТ 9284—59;
стекла покровные по ГОСТ 6672—59;
Стр. 5 ГОСТ УММЛ—75
значением концентрации раствора хлористого натрия, при которой подвижность спермиев составляет -не менее 0,5 балла. Чем ниже концентрация раствора хлористого натрия, в котором спермин ос таются живыми, тем выше осмотическая резистентность спермы .
Пример. В «робирке М 8 (0,16%-ный раствор хлористого на трии) определена единичная подвижность спермиев, а в пробирке № 7 (0,2%-ный раствор хлористого натрия) подвижность -^гершиев 0.5 балла. Следовательно, значение осмотической резистент ности спермы равно 0,2. Или. если в пробирке М 8 мертвые спер ?
ший, в пробирках.M 7 « 6 единичная подвижность спермиев, а в r пробирке Л? 5 (0.3%-ный раствор хлористого натрия) подвиж ность — 0.5 балла. Следовательно, осмотическая резистентность спермы равна 0,3 .
4.42. Коэффициент резистентности ( R K) вычисляют но фор муле R _ ол где 0,1 — постоянный коэффициент;
осмотическая резистентность (концентрация -раствора хлористого натрия, %) .
5. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ДЕГИДРОГЕЯАЭНОЙ АКТИВНОСТИ СПЕРМЫ
Сущность метода заключается в определении скорости обес цвечивания метиленовой сини, добавленной к сперме .
Скорость обесцвечивания метиленовой сини зависит от актив ности дегидрогеназ-ферментов дыхания спермиев .
Дегидрогенадаую активность спермы определяют з капиллярах или в пробирках .
5.1. М е т о д о п р е д е л е н и я д е г и д р о г с н а з н о й а к т и в н о с т и спермы в капиллярах 5.1.1. Оборудование и реактивы
Для проведения испытания применяют:
термостат ТМ-1 для 'микроскопа;
термометр по ГОСТ 215—73;
термостат или ультратермостат, юли баню водяную;
секундомер по ГОСТ 5072—72;
-стекла предметные по ГОСТ 9284-^59;
пипетки глазные и пастеровские;
трубочки стеклянные длиной 5 — см с внутренним диаметром 0,8—1,0,мм или катетеры от шприцов для искусственного осеме нения коров;
натрий хлористый по ГОСТ 4233—66;
синь метиленовую 0,01 %-ный раствор;
воду дистиллированную по ГОСТ 6709—72 .
5.1.2. Подготовка к испытанию Стр. 7 ГОСТ 30909.4—75 5.1.2.1. Концентрацию с тем н е в в сперме определяют но ГОСТ 20909.5—75 .
,5.1.2.2. Подвижность спермиев определяют по п. 2.3 .
Раствор мели.чековой сини готовят, растворяя 0,01 г метилено вой сини и 0,9 г хлористого натрия в 100 мл дистиллцровамной воды .
5.1.3. Проведение испытания На чистое предметное стекло,.подогретое до 30— C, наносят 37B 0,05 мл (каплю) спермы м добавляют теплой пипеткой такое же количество (каплю) 0,01%-ного раствора метиленовой он ни, подо гретой до Ж С. Смесь спермы с краской тщательно смешивают и набирают ее в теплую (30—ЗГС) стеклянную т.рубку, рассчиты вая, чтобы высота столбика смеси составляла 2—3 см. Столбик смеси, не содержащий пузырьков воздуха, располагают в центре трубки .
Трубочку, заполненную смесью опермы с метиленовой синью, помещают в термостат при температуре 37-0,5'С на лист белой бумаги в горизонтальнол! положении. Записывают время начала испытания и окончания обесцвечивания метиленовой синя. При этом учитывают, что концы столбкка (1—2 мм) обычно не обес цвечиваются .
5.1.4. Обработка результатов о. 1.4.1. Дегндрогеназную активность спермы выражают в ус ловных единицах .
За единицу активности принимают такую активность, когда 1 млрд, спермиев обесцвечивает за 1 мин 0,05 мл 0.01%-ного ра створа метиленовой сини (0.000005 г порошка метиленовой сини) .
5.1.4.2. Дегидрогеназную акт)шность спермы ( Д а ) в условных единицах вычисляют по формуле 7 - Пс / С Ма~ где П е — подвижность спермнсв, баллы;
t — время обесцвечивания метиленовой сини в опыте,.мин ^ С — концентрация спермы, мл-рд4мл;
10 — постоянный коэффициент .
За окончательный результат испытания принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений .
Допускаемые расхождения -между результатами двух парал лельных определений не должны превышать *40% .
5.2. Метод определения д ег и д р о г е м а зной ак тивности спермы d пробирках 5.2.1. Оборудование и реактивы
Для проведения.испытания п-римеияют:
термостат ТМ-1 для микроскопа;
термометр по ГОСТ 215—73;
термостат или ультратермостат, или баню, водяную;
ГОСТ 20*09.4—/S Стр. 8 секундомер но ГОСТ 5072—72;
•стекла предметные тто ГОСТ 9284—59;
пипетки стеклянные вместимостью 1 мл по ГОСТ 12487--67;
колбы стеклянные по'ГОСТ 12487—67;
пробирки стеклянные вместимостью 5 мл и диаметром 1 см;
синь метиленовую, 0,05%-ный раствор;
натрий лимоннокислый но ГОСТ 5.1314—72;
•масло вазелиновое по ГОСТ 3164—52, х.ч.;
глюкозу по ГОСТ 4233--66;
воду дистиллированную но ГОСТ 6709—72 .
5.2.2. Подготовка к испытанию 5.2.2.1. Приготовляют глюкозо-цитратный раствор на прокипя ченной дистиллированной воде, для чего растворяют в колбе вме стимостью 100 мл 3 г глюкозы и 1,4 г лимоннокислого натрия .
Раствор доводят до метки «одой .
6.2.2.2. Раствор метиленовой сини 'готовят на (прокипяченной дистиллированной воде, растворяя в мерной колбе вместимостью 100 мл 3 г глюкозы, 1,4 г цитрата натрия и 0,05 г метиленовой сини. Объем раствора доводят до метки .
5.2.2.3. Концентрацию еяермиев определяют по ГОСТ 20909.5-75 .
5.2.3. Проведение испытания Б чистую, подогретую до 30—37*0 стеклянную пробирку вно сят 0,8 мл теплого (37—45X1) глюкозо-нитратного раствора, добав ляют 0,1 мл 0,05%-ного раствора метиленовой синя и 0,2 мл спермы. Содержимое тщательно перемешивают и наслаивают очи щенное вазелиновое масло в таком количестве, чтобы получился столбик масла высотой 0,5—4,0 см .
Пробирки со смесью ставят в термостат или в водяную баню при температуре 45*С и учитывают время обесцвечивания ацетиле новой сили .
Допускается одновременно определять показатель выживаемо сти спермнев три температуре 45Х. Для этого через каждые 10— 1о мин из пробирок берут пробу стеклянной палочкой и оценива ют подвижность спермиев по л. 2.3 .
5.2.4. Обработка результатов Депндрогеназную активность спермы и коэффициент дегидро»
ген а зной активности -вычисляют по яп. 5.1.4 и 5.1.5 .
. ОПРЕДЕЛЕНИЕ РЕЗИСТЕНТНОСТИ СПЕРМИЕВ
К ХОЛОДОВОМУ ШОКУ
Сущность метода заключается в определении выживаемости опершие в после быстрого ш охлаждения до температуры 1—3°С .6.1. О б о р у д о в а и не и р е а к т и в ы 6.1.1. Д ля проведения испытания применяют:
микроскоп биологический марки МБИ или.МБР по ГОСТ 8284-67;
Стр. 9 ГОСТ 20909.4—75 термостат ТМ-1 для микроскопа;
стекла предметные по ГОСТ 9284—59;
стекла (покровные размером 18x18.или 24X24 им по ГОСТ 6672—59;
палочки стеклянные или пипетки пастеровские;
флаконы вмесли мостью 2 м л;
глюкозу по ГОСТ 6038—74, 6%-ный раствор .
6.2. П о д г о т о в к а к и с п ы т а н и ю 6.2.1. Перед началом работы готовят на прокипяченной дистил лированном воде 6%-ный раствор глюкозы, растворяя 6 г глюкозы в мерной колбе вместимостью 100 мл. Объем раствора доводят во дой до метки. Приготовленный (раствор разливают по 1—2 !.чл в пробирки или флаконы из расчета на каждую пробу спермы не менее трех пробирок .
Готовят ванну со льдом с температурой 2 - ГС, в которую не менее чем за 5 мин до начала исследования ставят для охлажде ния по две из трех пробирок. Третью пробу с 6%-ным раствором глюкозы ставят в термостат при температуре 37—40°С .
Подвижность спермиев определяют по п. 2-3 .
6.3. II р о в е д е н и е и с п ы т а н и я 6.3.1. Одну-две капли неразбавленной спермы, выдержанной при комнатной температуре не менее 10 и не более 30 мин, вносят стеклянной пипеткой в пробирки или флаконы с 6%-ным раство ром глюкозы, охлажденной до 2± ГС, и в пробирку с раствором, подогретым до 37—40вС. Выдерживают 5 мин. Подвижность спер миев определяют под микроскопом по и. 2.3. '
6.4. О б р а б о т к е р е з у л ь т а т о в 6.4.1. Резистентность спермиев к холодовому шоку (/?„) вы числяют по формуле где а\ — подвижность спермиев через 5 мин после внесения спер мы в 6%-ный раствор глюкозы при температуре 2* ГС, баллы;
а2 — подвижность спермиев через 5 мип после внесения спер мы в 6%-ный раствор глюкозы при температуре 37—• 4(ГС, баллы .
За окончательный результат испытания принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений. До пускаемые расхождения между результатами параллельных оп ределений не должны превышать *10% .
Пример. Подвижность спермиев в 6%-ном растворе глюкозы при температуре 37—40‘С — 8,0 баллов, а.в растворе с темпера турой 2 * ГС — 1,5 балла .
Следовательно, резистентность к холодовому шоку ПРИЛОЖЕНИЕ ! к ГОСТ 2090М -75 Рекомендуемое
ГОСТ 20909.4-75