WWW.LIT.I-DOCX.RU
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - различные публикации
 


«БЛГИРОВ Вугар Алинияз оглы БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ  АСПЕКТЫ  СОХРАНЕНИЯ ГЕНЕТИЧЕСКИХ РЕСУРСОВ ЖИВОТНЫХ ...»

На  равах  укописи

п р

БЛГИРОВ Вугар Алинияз оглы

БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ  АСПЕКТЫ  СОХРАНЕНИЯ

ГЕНЕТИЧЕСКИХ РЕСУРСОВ ЖИВОТНЫХ

03.00.23 - Биотехнология

03.00.13 - Физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Дубровицы - 2004

Работа  выполнена  в  отделе  биотехнологии  Всероссийского

государственного  научно-исследовательского  института  животноводства .

Научные консультанты: академик РАСХН Эрнст Лев Константинович;

доктор биологических наук, профессор Зиновьева Наталия Анатольевна .

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Клинский Юрий Дмитриевич;

доктор биологических наук, профессор Рябых Владимир Павлович;

доктор биологических наук, профессор Ерохин Анатолий Сергеевич .

Ведущее учреждение: Московская государственная  академия ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И. Скрябина Защита  диссертации  состоится  01  февраля  2005  года,  в  1000  часов,  на заседании  диссертационного  совета  Д.006.013.01  во  Всероссийском государственном  научно-исследовательском  институте  животноводства .

Адрес  института:  142132,  Московская  область,  Подольский  район, п. Дубровицы, ВИЖ. Факс 8 (0967) 65-11-01 С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ВИЖа .

Автореферат разослан  28  декабря 2004 года .

Ученый  секретарь диссертационного  совета, кандидат биологических  наук В.П. Губанова 1. Общая характеристика работы Актуальность темы. Сохранение генетических ресурсов и рациональное использования  животных  является  неотъемлемой  частью  биотехнологической  и сельскохозяйственной  науки.  Из  6200  пород  животных,  относящихся  к  40 видам,  внесенных  в  банк данных  ФАО/ЕАЖ,  более  30%  мировых генетических ресурсов  домашних  животных  находятся  на  грани  вымирания  (Shend,  1997;

Sherf, 2000) .

Впервые  проблему  сохранения  генетических  ресурсов  редких  и исчезающих  видов  животных поднял А.С.  Серебровский  (1928) и  ввел термин «генофонд».  Автор  подчеркивал,  что  «в  лице  генофонда  мы  имеем  такое  же национальное  богатство,  как  в  виде  нефти,  золота,  угля,  сокрытых  в  наших недрах».  Рассматривая  эту  проблему,  Ю.П.  Алтухов  с  соавторами  (1996)  ввели термин  «природоохранная  генетика»,  который  употребим  и  для  популяций сельскохозяйственных  животных,  поскольку  породы  -  это  не  что  иное,  как неотъемлемая  часть животного  мира .

Одним  из  выдающихся  достижений  отечественной  науки  XX  столетия явилась  разработка  биотехнологического  метода  искусственного  осеменения, позволяющего  тиражировать  ценные  генотипы  в  сотни  и  даже  тысячи  раз, увеличивая их распространение в популяциях и вытесняя при этом малоценные генотипы .

Открытие Миловановым В.К., Соколовской И.И., Смирновым И.В. (1947) возможности длительного  сохранения  семени  животных  в  глубокоохлажденном состоянии  явилось  основой  для  создания  криобанка  генетических  ресурсов высокопродуктивных, редких, уникальных и  исчезающих  видов животных/ Криобанк  семени  перед  традиционными  методами  сохранения  видов имеет  такие  преимущества,  как  возможность  транспортировки  на  большие расстояния;  легкость  обмена  генетического  материала  между  популяциями;





высокая  степень  надежности;  сведение  до  минимума  эффекта  генетического дрейфа  и  инбридинга;  обеспечение  сохранения  видов  в  случае  эпидемий, экологических  и  социальных  катастроф;  использование  отдаленной гибридизации  с  целью  совершенствования  животноводства;  создание коллекции  биологических  материалов для различных  исследований .

Генетический  материал,  сохраняемый  в  криобанке,  может  быть использован  не только для восстановления исчезающих  видов, но и для  обмена генетическим  материалом  между  популяциями,  разводимыми  в  неволе;  для обогащения  резерва  наследственной  изменчивости  свободноживущих популяций,  находящихся  под  угрозой  исчезновения  ввиду  их  малой численности;  при  разведении  животных-носителей  уникальных  генов, полученных в процессе трансгенеза (Эрнст Л.К. и др.,  1994; Эрнст Л.К., 2004) .

Существование  вида,  его  способность  выжить  в  данной  среде  зависит  от сохранности  генома,  которой  вносит ,  сперматозоид  в  ооцит  при оплодотворении.  Совокупность  механизмов  обеспечивающих  защиту  генома  в половых  клетках  самцов,  подвергающихся  сложным  трансформациям  в  ходе сперматогенеза,  является  одним  из  условий,  обеспечивающих  существование вида .

Цель и задачи исследований .

Целью  диссертационной  работы  являлась  разработка  и усовершенствование  технологий  и  методик  сохранения  и  рационального использования  генетических  ресурсов  разных  видов,  животных  с использованием  биотехнологических  методов .

Для достижения цели были поставлены и решены следующие задачи:

•  Усовершенствовать технологию криоконсервации семени  кроликов .

•  Разработать  технологию  криоконсервации  эпидидимального  семени животных .

•  Создать банк семени редких, исчезающих и уникальных видов животных .

•  Изучить  морфологические  и  гистологические  особенности  гонад  и выполнить  сравнительный  анализ  видовых  характеристик  сперматозоидов различных  видов  животных .

•  Разработать  методологию  рационального  использования  генетических ресурсов .

•  Изучить  возможность  получения  трансгенных  свиней  после  многолетнего хранения семени .

•  Изучить  возможность  использования  сперматозоидов  в  качестве  вектора для переноса чужеродной ДНК в ооциты кролика .

•  Усовершенствовать  методику  кариотипирования  с  использованием прикладных  компьютерных  программ  и  провести  цитогенетический  анализ животных  разных  видов .

Научная  новизна.  В  ходе  выполнения  диссертационной  работы  была усовершенствована  технология  криоконсервации  семени  кроликов, позволяющая  улучшить  биологическую  сохранность  сперматозоидов, получить  более  высокую  оплодотворяющую  способность  сперматозоидов  и повысить многоплодие в сравнении с прототипом .

Впервые  была  разработана  технология  криоконсервации эпидидимального семени овцебыка, сайгака, яка как метод сохранения редких и исчезающих  видов  животных .

  Предложен  метод  внутритрубного  осеменения для  размножения  трансгенных  свиней  при  наличии  ограниченных  количеств глубокозамороженного  семени.  Изучены  видовые  особенности  сперматозоидов яков, сайгаков, овцебыков, кроликов, баранов, хряков и быков. Доказано, что  в процессе  криоконсервации  семени,  сперматозоиды  способны  связываться  с чужеродной  ДНК  и  переносить  ее  в  ооциты  при  оплодотворении.  Изучено влияние  чужеродной  ДНК  на  уровень  хромосомной  изменчивости  у трансгенных свиней и кроликов .

Практическая  значимость.  Предложена  усовершенствованная технология  криоконсервации  семени  кроликов,  на  основе  которой  создан  банк семени  трансгенных  кроликов.  Разработана  технология  криоконсервации эпидидимального  семени  разных  видов  животных,  с  использованием  которой создан  банк  семени  редких,  уникальных  и  исчезающих  видов  животных (овцебыков,  сайгаков,  яков).  Создан  банк  семени  трансгенных  хряков  6-ти поколений  Доказано,  что  глубокозамороженное  семя трансгенных  хряков,  хранящееся  в  жидком  азоте  более  10  лет,  может  быть использовано  для  получения  потомства  и  возобновления  трансгенной  линии .

Разработана методика кариотипирования на основе прикладных компьютерных программ,  позволяющая  повысить  эффективность  цитогенетического  анализа животных .

Положения, выносимые на защиту .

•  Усовершенствованная  технология  криоконсервации  семени  кроликов, позволяющая  повысить  сохранность,  оплодотворяющую  способность сперматозоидов и многоплодие .

•  Технология  криоконсервации  эпидидимального  семени  как  метод сохранения  и рационального  использования  генетических ресурсов редких  и исчезающих  видов животных .

•  Биологическая  полноценность  семени  трансгенных  хряков,  хранившегося более  10 лет в криобанке .

•  Метод  внутритрубного  осеменения  как  способ  тиражирования  уникальных генотипов при ограниченном запасе семени .

•  Морфологические  и  гистологические  особенности  семенников  яков, сайгаков, овцебыков .

•  Морфологические  и  гистохимические  особенности  сперматозоидов  яков, сайгаков, овцебыков, кроликов, баранов, хряков и быков .

•  Новая  методика  кариотипирования  на  основе  использования  прикладных программ  как способ характеристики генетических ресурсов животных .

•  Влияние  чужеродной  ДНК  на  уровень  хромосомных  нарушений  и физиологические показатели у животных .

Апробация  работы.  Материалы  диссертационной  работы  доложены  и обсуждены на  12 научных конференциях (Москва, Дубровицы, Боровск, СанктПетербург,  Гаага,  Рим),  на  заседаниях  ученого  совета  ВИЖа.  По  материалам диссертации  опубликовано  33  научные  работы,  в  том  числе  в  центральных журналах  -  8,  книг  -  6,  методических  рекомендаций  -  3,  в  зарубежных изданиях  -  2 .

Объем работы. Диссертация изложена на 245 страницах машинописного текста,  включает  33  таблицы,  79  рисунков,  1  график,  3  схемы .

Библиографический  список  содержит  425  источников,  в  том  числе  257  на иностранных языках .

2. Материал и методы исследований .

Работа  выполнена  в  1993-2004  гг.  во  Всероссийском  государственном научно-исследовательском  институте  животноводства,  в  экспериментальных хозяйствах  ВИЖа  «Кленово-Чегодаево»,  «Дубровицы»,  в  экспериментальном хозяйстве  ВИЭВ  «Лисий  остров»  Тверской  области,  охранной  зоне  "Бикада" полуостров  Таймыр,  с.  Бизинги  Черекского  района  Кабардино-Балкарской Республики,  в  вольере  организации  «Охрана  дикой  природы»  Калмыцкой Республики .

Опыты  проводили  на  следующих  видах  животных:  1)  кролики (Qryctolagus  cuniculus)  пород  шиншилла,  шампань,  калифорнийская,  русская горностаевая  -  всего  50  самцов,  250  самок  и  4  вазэктомированных  самца  в возрасте  от  6  месяцев  до  4  лет;  2)  свиньи  (Sus  scrofa)  породы  крупная  белая, ландрас и их помеси, дюрок - всего 30 самцов и  80 самок в возрасте до 5 лет; 3) овцы  (Ovis  aris)  пород  романовская,  кавказская,  куйбышевская,  ромни-марш, тексиль,  финский  ландрас,  линкольн  и  их  помеси - всего  20  самцов  в  возрасте от  1  до 4  лет; 4)  быки (Bos  taurus)  20  пород - всего  50  голов  в  возрасте  от  1  до 10 лет;  5) овцебыки (Ovibos moschatus) - 2  самца в  возрасте больше 3  и  5  лет;  6) яки (Bos  mutus) - 4  самца  и  3  самки  в  возрасте от  1,5  до  7 лет;  7)  сайгаки (Saiga tatarica)  - 7  самцов  в  возрасте от  1,5  до 3,5  лет .

Исследования проводили по схеме, представленной на рисунке  1 .

Семя  брали  при  помощи  искусственной  вагины  от  самцов  кроликов, содержащихся  в  индивидуальных  клетках.  За  основу  взяты  инструменты, приспособления  и  методика  взятия  семени,  описанные  Соколовской  И.И.  и Кононовым  В.П.  (1971),  модифицированные  нами.  В  свежевзятых  эякулятах изучали  качественные  и  количественные  характеристики.  Концентрацию сперматозоидов  определяли  при  помощи  камеры  Горяева  при  увеличении х 400.  Разработку  среды  для  криоконсервации  семени  кроликов  проводили  с использованием  метода  треугольных  графиков  по  В.К.  Милованову  (1962)  для нахождения  оптимального  соотношения  испытуемых  компонентов .

Оптимальный  режим  замораживания  определяли  путем  изменения  объема гранул  семени,  замораживаемых  на  фторопластовой  пластине.  В  качестве прототипа использовали  среду,  предложенную  Н.А.  Комбаровой (1993) .

Разбавленное  семя  охлаждали  в  течение  4-х  часов  в  бытовом холодильнике  до  +4°С,  предварительно  поместив  пробирки  с  семенем  в поролоновый  теплоизолирующий  штатив.  Затем  семя  охлаждали  до  0  С, погружая  пробирки  в  смесь  воды  со льдом.  Замораживание  семени  проводили на  охлажденной  в  жидком  азоте  фторопластовой  пластине  (Ющенко  Н.П., 1968).  Оттаивание  семени  осуществляли  сухим  методом  с  помощью оттаивателя (Кононов В.П., Нарижный А.Г.,  1986) .

Время  выживания  сперматозоидов  оценивали  по  полупериоду подвижности  (Милованов  В.К.  и  др.  1981)  и  морфологической  сохранности акросом акроскопическим методом (Соколовская И.И.,  1980) .

Спаривание самки  с  вазэктомированным  самцом  проводили за 5  часов до осеменения.  Для  индукции  овуляции  самкам  непосредственно  перед осеменением  вводили  внутривенно  хорионический  гонадотропин  (Ovogest 1500, Intervet, Германия) из расчета 30 ME на 1  кг живой массы. Семя вводили в период  охоты  однократно  в  дозе  0,25  мл,  содержащей  около  20  млн .

подвижных  сперматозоидов.  На  12-13  день  крольчих  пальпировали  для предварительной  диагностики  сукрольности.  Результативность  осеменения оценивали  по  данным  окрола,  определяя  процент  окролившихся  маток  и размер  гнезда .

Рис. 1.Схема исследований Технология  замораживания эпидидимального  семени  включала несколько этапов:  получение  содержимого  эпидидимиса,  извлечение  из  него сперматозоидов и их криоконсервация .

Выделение  ДНК  из  ткани  (выщипы  ушной  раковины)  проводили перхлоратным  методом  по  усовершенствованной  методике  (Зиновьева  Н.А.  и др.,  2001).  Для доказательства трансгенности  использовали  метод ПЦР-анализа (Saiki  et  al.,  1985,  1988).  Продукты  амплификации  разделяли  методом электрофореза  в  агарозном  геле  и  визуализировали  в  УФ  свете  с  помощью цифровой камеры и компьютерной программы Biotest .

Образцы  тканей  для  гистологических  исследований  фиксировали  в  10% растворе  формалина  и  в  фиксаторе  Карнуа.  Гистопрепараты  готовили  на парафиновом  и  замораживающем  микротоме  по  методике  Ромейс  (1953) .

Анализ  препаратов  осуществляли  с  использованием  камеры  и  компьютерной программы  Image  Scope  (г.  Москва,  ООО  «Системы  для  микроскопии  и анализа»).  Для  этого  проводили  видеозахват  50  случайных  полей  зрения  на  3-х препаратах,  окрашенных  по  Фельгену,  определяли  длину,  ширину,  среднюю яркость  и  площадь  50  ядер  сперматозоидов.  Условную  плотность  находили  по формуле  а=(255-b),  где  а  -  плотность;  b  -  яркость.  Перемножая  условную плотность  на  площадь  ядра  (axS),  определяли  условное  количество  ДНК .

Препараты  сперматозоидов  для  морфометрического  анализа  окрашивали гематоксилином-эозином.  Измеряли  длину,  ширину,  площадь,  округлость головки  сперматозоидов .

Криоконсервацию  семени  хряков  проводили  по  методике  ВИЖ  с применением диализной криопротективной обработки .

Хирургические  операции  по  внутритрубному  осеменению  свиноматок проводили  под  общим  наркозом.  Свиноматок  фиксировали  на  операционном столе,  производили  разрез  брюшной  стенки  по  белой  линии  живота  между предпоследней  и  последней  парой  молочных  желез.  Выводили  на  поверхность брюшной  стенки  сначала  один  рог  матки  в  месте  его  соединения  с  яйцеводом, затем  второй .

Для  переноса  чужеродной  ДНК  (чДНК)  сперматозоидами  в  ооциты генную  конструкцию  pCMVlacZ  добавляли  к  охлажденному  до  0°С  семени  из расчета  1  мкг  ДНК  на  1  млн.  сперматозоидов  в  виде  0,01%  раствора  в  ТрисЭДТА  буфере.  В  контрольные  образцы добавляли  соответствующее  количество трис-ЭДТА  буфера.  Семя  инкубировали  при  0°С  в  течение  10-15  минут, замораживали  и  сохраняли  в  жидком  азоте  до  осеменения.  Через  44-46  часов после  осеменения  проводили  вымывание  эмбрионов  0,9%  раствором  NaCl .

Определяли  количество  оплодотворенных  яйцеклеток,  сопоставляя  его  с числом  овуляций  на  яичниках.  После  морфологического  тестирования эмбрионов  их  подвергали  гистохимической реакции  с  субстратом  X-gal  с целью выявления  активности  галактозидазы  (Гоголевский  П.А.,  1991;  Кузнецов А.В.,  1993) .

Для  получения  препаратов  хромосом  использовались  лимфоциты периферической  крови.  Для  этого,  в  зависимости  от  вида  животных,  брали кровь  в  количестве  2-5  мл  из  ушной  или  яремной  вены  в  стерильный одноразовый  шприц  с  гепарином.  Препараты  готовили  по  методике (Кленовицкий и др. 2003) .

Анализ  препаратов  хромосом  проводился  с  использованием стандартных  программ  обработки  видеоизображений  (Image  Scope  1  (OOO «Системы для микроскопии и анализа», г. Москва), Photoshop) .

3.  Результаты  исследований .

3.1.  Усовершенствование  технологии  криоконсервации  семени кролика .

Разработку технологии  криоконсервации  кроличьего  семени  проводили  в несколько этапов:

1) совершенствование  криопротективной среды;

2) оптимизация режима замораживания семени;

3) выбор способа замораживания семени;

4) усовершенствование  инструментария  для  искусственного  осеменения крольчих .

3.1.1. Совершенствование криопротективной среды .

Оптимальное  соотношение  основных  компонентов  криопротекторной среды  было  найдено  с  использованием  методов  геометрических  и арифметических рядов .

В  качестве  базовых  были  взяты  компоненты,  хорошо  зарекомендовавшие себя  как  защитные  факторы  в  работе  с  семенем  других  видов  животных.  В качестве  неэлектролита была использована лактоза как дисахарид,  обладающий высокими антиоксидантными свойствами и способный особо прочно связывать свободную  воду.  Электролитной  частью  среды  являлся  трис-цитратный  буфер, зарекомендовавший себя как способный  устойчиво удерживать  концентрацию водородных  ионов  при  охлаждении  семени  за  счет  сопряженного  подавления констант  диссоциации трис-катиона и основных анионов .

Таблица 1 Состав среды для  криоконсервации семени  кроликов В связи с особым значением специфических криопротекторов для защиты семени  при  замораживании  методом  треугольных  графиков  в  среду  в оптимальных  концентрациях  были  введены  наиболее  широко  используемые глицерин  и  ДМСО.  Результаты  исследования  по  нахождению  оптимальных концентраций  этих  криопротекторов  в  связи  с  характеристиками биологической  полноценности  оттаянного  семени  показали,  что  оптимальные концентрации глицерина 2% и ДМСО 2,5% .

Состав разработанной среды приведен в таблице  1 .

3.1.2.  Оптимизация  режима  замораживания  семени .

Следующим  этапом  исследований  явилось  нахождение  оптимального режима  глубокого  охлаждения  семени  при  замораживании  его  гранулами разного  объема.  Установлено,  что  объем  замораживаемых  гранул  имеет решающее  значение  для  выживаемости  сперматозоидов.  Чем  больше  объем гранулы  в  пределах  до  0,3  мл,  тем  лучше  сохраняется  биологическая полноценность сперматозоидов .

Изменение характеристик семени на разных этапах криоконсервирования с  использованием  разрабатываемой  нами  технологии  по  сравнению  с методикой-прототипом приведены в таблице 2 .

Таблица 2 Изменение  характеристик  семени  кроликов  на  разных этапах  криоконсервации

–  –  –

Из данных таблицы 2 видно, что замораживание семени по разработанной нами  методике  значительно  лучше  защищает  сперматозоиды  по  сравнению  с методикой-прототипом .

Результативность  осеменений  крольчих  при  использовании  естественной случки,  искусственного  осеменения  криоконсервированным  семенем  по  нашей технологии  и  методике-прототипу  приведена в таблице 3 .

Как  видно  из  таблицы  3,  криоконсервация  семени  с  использованием разработанной  технологии  позволяет  сохранить  более  высокую оплодотворяющую  способность  сперматозоидов  (+18%)  и  повысить многоплодие  на  0,9  крольчонка,  чем  при  использовании  технологиипрототипа (разница статистически достоверна) .

Таблица 3 Результативность осеменения  крольчих семенем, замороженным разными методами, в  сравнении  с естественным спариванием 3.1.3. Выбор способа замораживания семени .

Предложена и апробирована методика криоконсервации семени кроликов в  соломинках  объемом  0,25  мл.  Подвижность  замороженно-оттаянных сперматозоидов  в  гранулах  составила 25%,  в  то  время  как в  соломинках  -  20% .

Сохранность акросом при этом была 73% и 62%, соответственно .

Хотя  криоконсервация  семени  кроликов  в  гранулах  дает'  лучшие результаты  по  сравнению  с  соломинками,  замораживание  в  соломинках  имеет ряд  преимуществ,  таких  как  обеспечение  лучшей  стерильности,  легкость  и удобство оттаивания и маркировки .

3.1.4.  Усовершенствование  инструментария  для  искусственного осеменения  крольчих .

Исходя  из  физиологических  особенностей  кроликов,  при  искусственном осеменении  самок  возникают  проблемы,  связанные  с  трудностями  взятия семени  и  введения  шприц-катетера.  В  этой  связи  были  усовершенствованы вагина  для  взятия  семени  кроликов  и  шприц-катетер  для  искусственного осеменения крольчих .

Разработанная  нами  технология  уже  успешно  используется  для криоконсервации  семени  кроликов  в  рамках  создания  банка  семени трансгенных  животных  (раздел  3.3.1) .

3.2.  Усовершенствование  технологии  криоконсервации эпидидимального  семени  как  метода  сохранения  и  рационального использования  генетических  ресурсов  редких  и  исчезающих  видов животных .

Возможность  использования  эпидидимального  семени  разных  видов животных  с  целью  получения  потомства  была  доказана  еще  Ивановым  И.И .

(1910).  Эрнст Л.К.  с  соавторами (1986), Шайдуллин И.Н.  (1994), Абилов А.И.  с соавторами  (1994)  подтвердили  перспективность  использования  этого  метода .

Криоконсервация  эпидидимального  семени  на  сегодня  осуществлена  у снежного барана (Шайдуллин И.Н.,  1988) и зубра (Абилов А.И. и др.,  1994) .

Задачей  наших  исследований  явилось  усовершенствование  технологии получения  и  криоконсервации  эпидидимального  семени  животных  и  его  более рациональное  использование.  Предложенное  нами  фракционное  выделение спермы - это новый подход в получении эпидидимального семени .

Суть  предложенной  технологии  заключается  в  следующем:  хвост придатка отделяют от семенника и осторожно освобождают от оболочек и кровеносных сосудов, оставляя  чистый  клубок  извитого  канала  эпидидимиса,  заполненного сперматозоидами. Через надрезы канальцев эпидидимиса получают первую фракцию .

После  выделения  первой  фракции  чистого  семени  извитой  канал измельчают  ножницами,  получившуюся  массу  смешивают  со  средой  и фильтруют через стеклянный фильтр .

Технология  получения  и  криоконсервации  эпидидимального  семени животных включает в себя несколько этапов:

1) отбор семенников;

2) препарирование эпидидимиса;

3)  получение  содержимого эпидидимиса;

4) выделение сперматозоидов по фракциям;

5) разбавление сперматозоидов средой;

6) эквилибрация семени;

7) криоконсервация эпидидимального семени .

Первоначально  технология  была  отработана  на  кроликах.  Выделенные  из хвоста  эпидидимиса  по  вышеописанной  методике  сперматозоиды  подвергались глубокой  заморозке.  Сравнительный  анализ  выживания  сперматозоидов  в эякулированном и эпидидимальном семени приведен в таблице 4 .

Таблица 4 Результаты  замораживания  эпидидимальных сперматозоидов  кролика Этапы Подвижность Сохранность акросом, криоконсервации сперматозоидов, % сперматозоидов, %

–  –  –

3.3. Создание банка семени редких, исчезающих и уникальных видов животных .

Усовершенствованные  в  ходе  выполнения  диссертационной  работы технологии  криоконсервации  семени  (разделы  З.1.,  3.2.)  были  использованы для создания банка семени редких, исчезающих и уникальных видов животных .

–  –  –

Из  таблицы  5  видно,  что  подвижность  сперматозоидов  кроликов, трансгенных  по  генам  МСР  и  BLV,  после  замораживания  и  оттаивания составила  25-30%,  при  этом  сохранность  акросом  была  на  уровне  60-65% .

Всего заморожено  1930 доз семени трансгенных кроликов .

Биологическая  полноценность  семени  была  доказана  успешным получением  трансгенного  потомства.  В  ходе  выполнения  работы  было исследовано  пять  поколений трансгенных  животных.  Для уменьшения эффекта инбридинга в размножении использовались интактные кролики .

С  целью  получения  гомозиготного  трансгенного  потомства  проводили спаривание  по  типу  трансген  х  трансген.  Гомозиготность  самцов  по интегрированному  гену  была  доказана  последующими  анализирующими спариваниями  с  контрольными  самками.  Получено  2  гомозиготных трансгенных  самца,  семя  от  которых  в  количестве  200  доз  содержится  в криобанке .

3.3.2. Банк семени трансгенных баранов .

С  молоком  трансгенных  животных  уже  получены  целый  ряд  ценных веществ  в  том  числе,  биологически  активные  вещества  технологического назначения, включая химозин (Эрнст и др.,  1995) .

Для  сохранения  генофонда  трансгенных  баранов  по  химозину  с  целью детального  изучения  этих  животных  и  их  дальнейшего  использования  создан банк семени.  Всего заморожено 580 доз .

Характеристика семени трансгенных баранов приведена в таблице 6 .

Таблица 6 Характеристика семени трансгенных баранов

–  –  –

Анализ  таблицы  6  показал,  что  сперматозоиды  баранов  после криоконсервации сохраняли свою биологическую полноценность.  Подвижность сперматозоидов  трансгенных  баранов  после  замораживания  и  оттаивания составила 45%, при этом сохранность акросом была на уровне 68% .

3.3.3. Банк семени трансгенных хряков .

Для  сохранения  генофонда  свиней,  трансгенных  по  генной  конструкции релизинг-фактора  гормона  роста,  нами  был  создан  банк  семени  трансгенных хряков  поколений  Вceгo  было  заморожено  2530  доз  семени .

Характеристика  отобранного  и  криоконсервированного  семени  хряков приведена в таблице 7 .

Как показано в таблице 7, подвижность свежевзятого семени трансгенных хряков  составляет  75-90%;  при  оценке  спермы  после  процесса  замораживанияоттаивания  активность  сперматозоидов  в  трансгенном  семени  составляла  35сохранность  акросом  составила  52-65%.  Полученные  данные свидетельствует  о  биологической  полноценности  сперматозоидов  трансгенных хряков .

Таблица 7 Характеристика банка семени трансгенных хряков

–  –  –

Из  таблицы  9  видно,  что  пик  развития  сперматогенеза  наблюдался  у животных  в  возрасте  2,5  и  3,5  года.  Приведенные  данные  показывают,  что общее  количество  сперматозоидов,  полученных  после  выделения  их  из эпидидимиса  составляло  у  быков  в  1,5  года -  12,8  млрд;  в  2,5  года - 37,7  млрд., в  3,5  года  -  53,4  млрд.  и  в  5,5  лет  -  12,7  млрд.  Подвижность  сперматозоидов после  замораживания-оттаивания  составила,  соответственно,  25%,  30%,  35%  и 25% .

Результаты  проведенных  экспериментов  показывают  возможность успешного  замораживания  эпидидимального  семени  яка,  что дает  возможность использовать  его  для  сохранения  генетических  ресурсов  и  отдаленной гибридизации .

–  –  –

Изучены особенности гистологического строения семенников овцебыка .

Результаты  показали,  что  у  старшего  быка  внутреннее  содержимое  канальцев было более наполнено клеточными структурами сперматогенного ряда .

–  –  –

3.4.3. Биологические особенности гонад сайгака .

Эксперименты  непосредственно  проводились  в  вольере  организации «Охрана дикой природы» Калмыцкой Республики .

Было  изучена  гистология  семенника  сайгака.  На  срезах  выявлена довольно  равномерная  заполненность  канальцев  клетками  сперматогенного ряда. Это говорит о нормальном функционировании органа .

3.4.4.  Сравнительный  анализ  сперматозоидов  различных  видов животных .

Сравнение  морфометрических  и  физиологических  параметров сперматозоидов у разных  видов животных  позволяет получить наиболее полное представление об их биологических особенностях (Милованов,  1962) .

Применение  новых  методов  исследований  по  изучению  и  автоматизации анализа  морфометрических  параметров  сперматозоидов  позволяет  более  точно и достоверно определять их показатели .

С  использованием  прикладных  компьютерных  программ  были  изучены основные  морфометрические  параметры  сперматозоидов  разных  видов животных  (таблица  13),  позволяющие  охарактеризовать  видовые  особенности формы и строения их отдельных структур .

Впервые  были  изучены  морфометрические  характеристики сперматозоидов  овцебыка,  сайгака  и  яка.  Проведенный  сравнительный  анализ морфометрических  показателей  сперматозоидов  у  разных  видов  животных выявил  видовые  особенности.  Обнаружены  достоверные  различия  по  общей длине, ширине, длине и площади головки сперматозоидов .

Таблица 13 Морфометрическая характеристика сперматозоидов у  разных видов животных

–  –  –

Как  видно  из  таблицы  14  наиболее  интенсивная  окраска  ядер сперматозоидов наблюдалась у быка, овцебыка  и барана, а самые крупные ядра были у барана,  сайгака и быка. Ядра сперматозоидов этих животных  содержали наибольшее количество ДНК. При этом отмечено, что наибольшая конденсация хроматина  у  всех  изученных  видов  наблюдается  в  участке,  прилегающем  к шейке сперматозоида ядра .

График 1 Зависимость  между  гаплоидным  числом  хромосом и количеством ДНК в сперматозоидах Сравнительный  анализ  ядер  сперматозоидов  разных  видов  животных показал,  что  количество  ДНК  положительно  коррелирует  с  числом  хромосом (график  1)  Коэффициент корреляции между этими признаками равен 0,6 .

3.5.  Изучение  возможности  получения  трансгенных  свиней  после многолетнего хранения семени .

Тиражирование  уникальных  генотипов  позволяет  осуществлять искусственное  осеменение.  Однако  в  свиноводстве  в  связи  с  видовой особенностью  воспроизводительной  функции  -  потребность  относительно большого  объема  семени  для  осеменения  одной  матки  -  эти,  несомненно, прогрессивные методы не достаточно эффективны (Эрнст и др.,  1994) .

Проблему  получения  за  короткий  срок  максимально  большего  числа потомков,  в  том  числе от  высокоценных  и  уникальных  хряков,  можно  решить, применяя  метод  хирургического  внутритрубного  осеменения  маток.  При  этом обеспечивается существенное, в сотни раз, сокращение потребности в семени в сравнении  с  обычным  естественным  или  искусственным  осеменением.  Метод внутритрубного  осеменения  маток  безальтернативен  при  незначительном запасе семени .

Данная  технология  была  использована  для  получения  трансгенного потомства с использованием семени, хранящегося более  10 лет в жидком азоте .

Сравнительная  оценка  замороженно-оттаянного  семени  трансгенных  и интактных  хряков  по  подвижности,  сохранности  акросом  и  выживаемости  не выявила существенных различий этих  показателей  (таблица  15) .

Таблица  15 Биологические свойства семени трансгенных хряков после длительного хранения

–  –  –

Как  вскоре  после  замораживания,  так  и  после  10-летнего  хранения  при температуре  -196°С  в  жидком  азоте,  в  оттаянной  сперме  имелось  около  40% сперматозоидов  с  прямолинейно-поступательным  движением  и  около  60%  с морфологически  нормальными  акросомами.  Следовательно,  столь  длительное хранение  семени  хряков  в  криоконсервированном  состоянии  не  повлияло заметно на его качественные показатели .

Основным  показателем  биологической  полноценности  как  свежевзятой, так  и  криоконсервированной  спермы  является  ее  оплодотворяющая способность .

Спустя  десятилетие  после  криоконсервации  семени  возникла необходимость  восстановления  генотипов  первого  поколения  трансгенных хряков (таблица.  16) .

Таблица  16 Результаты внутритрубного осеменения свинок спермой трансгенных хряков,  хранившейся более 10 лет

–  –  –

Из  данных  таблицы  16  видно,  что,  применяя  метод  внутритрубного осеменения  свиноматок  микродозами  криоконсервированного  семени уникальных  трансгенных  хряков,  хранившегося  в  течение  10  лет,  нам  удалось получить  потомство.  Из  12  осемененных  свиноматок  4  опоросились,  что составило 33%. При этом 35,7%  потомков оказались носителями трансгена .

Таким  образом,  эти  результаты  указывают  на  возможность  получения неограниченного  числа  потомков  от  производителя  с  использованием внутритрубного  осеменения  свиноматок  и,  наоборот,  получения  потомства  от минимальных  запасов  семени,  когда  традиционные  приемы  оказываются безуспешными .

Для  рационального  использования  генетических  ресурсов  уникальных свиней  метод  внутритрубного  осеменения  открывает  перспективы  в  этом направлении .

Таким  образом,  создавая  банк  семени  трансгенных  животных,  в частности  хряков,  можно  сохранить  наследственный  материал  в  качестве резерва генетических ресурсов с определенными заданными генами .

3.6. Новые подходы в генетической трансформации животных .

–  –  –

Как  видно  из  графика  2,  добавление  чДНК  к  семени  перед замораживанием  и  последующая  инкубация  при  0°С  в  течение  15-20  мин привели  к  появлению  большого  числа дегенерированных эмбрионов  и  высокой эмбриональной смертности.  Поскольку  такого явления  не  было  в  контрольной группе,  эмбриональную  смертность  в  данном  случае  однозначно  можно объяснить  действием  экстрагенетической  информации,  заключенной  в  генной конструкции  pCMVlacZ .

При  обработке  сперматозоидов  рекомбинантными  ДНК  в  ряде  случаев  у доимплантационных  эмбрионов  кролика  были  выявлены  характерные морфологические признаки апоптоза .

Причиной  индукции  апоптоза  в  ранних  эмбрионах  может  быть деградация  как  экзогенной,  так  и  собственной  ДНК  в  сперматозоидах.  Данное предположение  основано  на  представлении  о  роли  белка  р53  в остановке и переключении клеточного цикла для репарации или дальнейшего развития  клетки  по  пути  апоптоза  при  появлении  разрывов  в  хромосомной ДНК (Nelson, 1994) .

Включение  механизмов  апоптоза  у  ранних  эмбрионов  в  ответ  на проникновение  со сперматозоидом  фрагментированной ДНК представляется вполне  вероятным.  Возможно,  это  является  одним  из  способов  защиты развивающегося организма от чужеродной генетической информации .

В  экспериментах по переносу pCMVlacZ в ооциты кролика с  помощью сперматозоидов  выявлены  задержки  развития,  дегенерация  и  гибель доимплантационных эмбрионов (график 3) .

График 3 Влияние чДНК на развитие эмбрионов

–  –  –

Данные  таблицы  17  показывают,  что  10-12%  эмбрионов,  полученных  от семени,  обработанного  чДНК,  имели  положительную  реакцию  на  галактозидазу .

Результаты  проведенных  экспериментов  показали,  что  в  процессе криоконсервации семени  генетическая конструкция pCMVlacZ была связана со сперматозоидами  и  перенесена  в  яйцеклетки  в  процессе  оплодотворения  с последующей экспрессией .

Количество  эмбрионов  с  положительной  реакцией  на  -галактозидазу было значительно меньше, чем число дегенерированных эмбрионов. Этот факт позволяет  предположить,  что  для  гибели  эмбриона  в  ряде  случаев  достаточно проникновения чДНК без наличия экспрессии .

Вместе  с тем,  некоторые  эмбрионы,  положительно  прореагировавшие  на присутствие  продукта  экспрессии,  не  были  дегенерированы,  нормально развивались,  что  указывает  на  возможность  использования  сперматозоидов, трансформированных  в  процессе  замораживания,  в  качестве  естественного вектора при получении трансгенных животных .

С  другой  стороны,  возникает  необходимость  защиты  сперматозоидов  от чужеродной  генетической  информации  и,  соответственно,  снижения эмбриональных  потерь.  Современная  технология  искусственного  осеменения не  позволяет  получать  стерильное  семя,  а  искусственная  санация  его  не избавляет  от  чДНК.  Кроме  того,  чужеродная  генетическая  информация заносится в семя при его технологической обработке .

–  –  –

А)  на  гистосрезе  видно  нормальное Б) На срезе видно начало разрушения состояние  структур  семенных паренхимы семенника канальцев. Сперматогенез не нарушен .

В)  Г) На  рисунках  В  и  Г  видно  разрушение  слоев  сперматогенных  тканей  семенника  в результате  инъекции  ретровирусной  конструкции .

Данные таблицы  19  показывают, что  введение ретровируса отрицательно действует  на  подвижность  сперматозоидов.  В  некоторых  случаях  в  эякуляте сперматозоиды  отсутствуют.  Это,  возможно,  связано  с  тем,  что  при многократной  инъекции  нарушается  гематотестикулярный  барьер,  что  в конечном итоге приводит к нарушению сперматогенеза (рис.1) 3.6.3.  Оптимизация  технологии  временного  блокирования сперматогенеза у кроликов .

Трансплантация  модифицированных  первичных  половых  клеток  в семенник  стерильного  самца  является  перспективным  принципиально  новым подходом  в  биотехнологии .

Стволовые  клетки  сперматогонии  инициируют  и  поддерживают сперматогенез  в  семенниках.  Изучена  возможность  стерилизации  самцов кроликов  с  целью  дальнейшей  трансплантации  в  их  семенники модифицированных первичных половых клеток .

Для  стерилизации  самцов  использовали  диметилфармамид  +  бусулфан (Д+Б),  40  мкг/мл.  Анализ  гистологических  срезов  семенников  показал  начало процесса  блокирования  сперматогенеза  через  неделю  после  введения  Д+Б.  В эякуляте  присутствовали  мертвые  сперматозоиды.  Отмечена деструкция  осадка эякулята .

Через три  недели  на гистосрезах  обнаружено  отсутствие  сперматозоидов и  сперматид  и  отмечался  эффект  разрушающего  действия  введенного  фактора .

В  эякуляте  сперматозоиды  отсутствуют.  Также  наблюдалась  деструкция  осадка эякулята .

Спустя  7  недель  структуры  канальцев  восстанавливалась.  Юные  формы сперматогенного  эпителия  выглядели  вполне  нормально,  хотя  отмечалось отсутствие  сперматозоидов  и  сперматид.  В  эякуляте  сперматозоиды отсутствовали.  Отмечена деструкция осадка эякулята .

С  14-й  недели  начинался  процесс  восстановления  сперматогенеза,  но появление  сперматозоидов  в  эякуляте  наблюдалось  только  на  15-м  месяце после  обработки.  В  дальнейшем  идет  полное  восстановление воспроизводительной  функции  и  отмечается  появление  сперматозоидов  в эякуляте .

3.7.  Цитогенетические  исследования  как  метод  характеристики генетических ресурсов .

3.7.1.  Усовершенствование методики  кариотипирования различных видов  животных  с  использованием  прикладных  компьютерных программ .

Цитогенетические  исследования  играют  большую  роль  в  решении  ряда теоретических  и  прикладных  вопросов.  В  том  числе  комплекс  мероприятий, связанных  с  сохранением  генетических  ресурсов,  включает  в  себя цитогенетическую аттестацию самцов, используемых для криобанка семени .

Однако  применение  цитогенетики  в  практике  животноводства  в  России еще  не  вышло  за  рамки  лабораторий  научных  и  учебных  центров.  Основная причина этого - низкая технологичность используемых в нашей стране методов изучения  хромосом.  Кроме  того,  отсутствует  программное  обеспечение  для анализа кариотипов сельскохозяйственных животных .

Анализ  препаратов  хромосом  является  наиболее трудоемким  процессом .

В  связи  с  этим  был  разработан  ряд  подходов,  позволяющих  упростить классический процесс кариотипирования. За основу были взяты система Image Scope 1 и Adobe Photoshop. Принципиальная схема кариотипирования показана на рисунке 2 .

Рис. 2 Схема кариотипирования с применением пакетов прикладных программ Image Scope 1 и Photoshop Система  Image  Scope  1  обеспечивает  получение,  передачу  изображения на компьютер с  последующей его записью  и  обработкой  (подсчет и измерение хромосом) .

Однако  Image  Scope  1  не  позволяет  напрямую  проводить кариотипирование.  Эта  проблема  решается  с  помощью  Photoshop .

Кариотипирование  ведется  в двухоконном  режиме («Окна - Без  перекрытия») .

В  одном  из  окон  открыт  исходный  файл,  во  втором  -  рабочий,  в  котором создается кариотип .

При  массовом  исследовании  подсчет  хромосом  проводится  визуально .

Используя  Image  Scope  1,  подсчет  можно  проводить  на  дисплее  или  в автоматическом  режиме.  Процесс  кариотипирования,  в  случае  необходимости, корректируется по морфометрическим показателям через рабочий файл и Image Scope 1 .

3.7.2.  Изучение  и  сравнительный  анализ  кариотипов  яка,  крупного рогатого скота, овцебыка и овец .

Изучены  хромосомные  наборы яка,  крупного рогатого  скота,  овцебыка и овец.  Проведенные  исследования  четырех  видов  полорогих  показали  наличие существенных  хромосомных различий .

Кариотип  яка  (Bos  mutus)  по  числу  и  морфологии  хромосом  идентичен кариотипу  крупного  рогатого  скота.  Содержит  29  пар  акроцентрических аутосом,  образующих  по  своей  величине  плавно  убывающий  ряд,  крупную субметацентрическую  Х-хромосому  и  Y-хромосому  -  мелкая  хромосома субметацентрической формы, диплоидное число равно 60 (рис. 3) .

Рис.  3.  Кариотип  яка.  Бык  из  кабардинской  популяции.  Окраска  по Романовскому-Гимза.  Предобработка  5-бром-дезоксиуридином  и  бромистым этидием .

Кариотип  крупного  рогатого  скота  содержит  29  пар  акроцентрических аутосом.  Полагают,  что  он  наиболее  близок  к  предковой  форме.  Мужская  и женская половые хромосомы метацентрические (рис. 4) .

Рис.  4.  Кариотип  крупного  рогатого  скота.  Бык.  Предобработка  5-бромдезоксиуридином и бромистым этидием. Окраска по Романовскому-Гимза .

Овцебык  (Ovibos  moschatus)  является  единственным  представителем трибы  Ovibovini.  По  хромосомному  набору  он  существенно  отличается  от  этих видов. Диплоидное число хромосом у овцебыка равно 48. Из них 6 пар аутосом метацентрические,  а  17  -  акроцентрики.  Акроцентрики  по  величине  образуют плавно убывающий  ряд.  Женская  половая  хромосома субтелоцентрическая,  Yхромосома-  метацентрик (рис.  5) .

Рис.5.  Кариотип  самца  овцебыка  из  таймырской  популяции .

Предобработка  5-бром-дезоксиуридином  и  бромистым  этидием.  Окраска  по Романовскому-Гимза .

Кариотип  овцы  содержит  27  пар  хромосом.  3  пары  аутосом метацентрические,  23  пары  акроцентрики.  Y-хромосома  -  метацентрик,  Xхромосома  -  крупный  акроцентрик.  По  характеру  дифференциальной изчерченности  кариотип  овцы  сходен  с  хромосомным  набором  крупного рогатого  скота.  Это  связано  с  тем,  что  кариотипы  полорогих  произошли  от общей предковой формы (рис. 6) .

Рис.  6.  Кариотип  домашней  овцы.  Самец.  Предобработка  5-бромдезоксиуридином и бромистым этидием. Окраска по Романовскому-Гимза .

Анализ  дифференциальной  структуры  хромосом  овцы  свидетельствует, что  хромосома  1-й  пары  у  О.  aries  L.  соответствует  1  и  3 ; 2 - 2 и 8 ; 3 - 5 и  11 парам хромосом В. taurus L. и С. hircus L. (Яковлев А.Ф.,  1989) .

Как  отмечает Л.С.  Билтуева (1995),  овцебык  имеет типичный для  козьих рисунок  9-й,  14-й  и  X  -  хромосом.  На  основании  анализа  дифференциальной окраски  хромосом  полагают,  что  формирование  метацентриков  у  овцебыка произошло  в  результате  центрических  слияний  базовых  хромосом, соответствующих  1  и  18; 2  и 22;  5  и 27;  11  и 23;  25  и 29;  24  и  28  хромосомам крупного рогатого скота .

Считают,  что  эволюция  кариотипов  в  семействе  полорогих  шла  путем центрических  слияний.  Проведенные  нами  сравнение  генных  карт  этих  видов по  484  общим  генам  выявило  54  группы  сцепления,  что  соответствует  26 перестройкам.  Разумеется,  требуется  дальнейшее  уточнение  этого  вопроса .

Однако ясно,  что  кариологические различия  между В.  taurus  L.  и  О.  aries  L.  не могут быть сведены лишь к наличию трех робертсоновских транслокаций .

Очевидно,  это  справедливо  и  для  других  видов,  входящих  в  семейство полорогих.  Из-за  отсутствия  генных  карт  у  яка  и  овцебыка  сравнительный анализ  их  хромосомных  наборов  проведен  только  по  морфологии  и  числу хромосом .

3.7.3. Анализ хромосомных аберраций у трансгенных животных .

На  современном  этапе  развитии  биотехнология,  позволяющая целенаправленно  нарабатывать  ДНК  как  носителя  генетической  информации, открывает новые перспективы в животноводстве .

В  последние  годы  в  нашей  стране  проводятся  работы  по  получению трансгенных  животных  с  целью  направленного  изменения  их  продуктивных качеств  и  создания  животных-продуцентов  биологически  активных  веществ .

Известно,  что  микроинъекции  чужеродной  ДНК  обуславливают дестабилизацию  генома  потомства  (в  ряде  случаев  трансгенез  сопровождается хромосомными  перестройками).  Это  свидетельствует  о  необходимости изучения цитогенетических нарушений у трансгенных животных .

3.7.3.1.  Изучение  влияния  чДНК  на  стабильность  кариотипа трансгенных  кроликов .

Хромосомный  набор  у  всех  55  опытных  животных  соответствовал видовой  норме  и  содержал  44  хромосомы.  Однако у значительной части  из  них был  обнаружен  повышенный  уровень  клеток  с  хромосомными  аберрациями (рис. 7) .

Рис. 7. Аберрации хромосом у кроликов, трансгенных по МСР а - хроматидные разрывы;  б - изохроматидный разрыв;  в - дицентрик .

Хромосомные  аномалии  у  этих  животных  представлены,  главным образом, хроматидными  и  изохроматидными пробелами и разрывами. Доля дицентриков  составила  около  3%  от  числа  аберраций.  Около  37%  пораженных клеток  несли  множественные  аберрации,  у  27,5%  были  выявлены изохромитидные аберрации.  Примерно  11% клеток одновременно содержали и множественные перестройки и изохроматидные аберрации .

Отмечена  определенная  закономерность  в  распределении  аберраций  по хромосомам  набора.  В  45,3%  случаев  были  поражены  хромосомы  1  пары .

Аномалии  затрагивали  как  короткое, располагались  преимущественно  в  зонах,  соответствующих  светлым  бендам, выявляемым  при инкубации с  5  бром 2 дезокиуридином  (5'BrdU) и  бромистым этидием,  в  прителомерных  и  прицентромерных  районах  обоих  плеч  1-й хромосомы.  Это  показывает  наличие  связи  хромосомной  нестабильности  с особенностями нуклеотидного состава определенных участков ДНК .

3.7.3.2.  Изучение  влияния  чДНК  на  стабильность  кариотипа трансгенных свиней .

Исследовали  свиней  второго  поколения,  трансгенных  по  гену соматолиберина,  полученных  методом  внутритрубного  осеменения глубокозамороженным  семенем,  хранившимся  10  лет.  Проведено  двукратное взятие  материала  от  6  хрячков  F2  и  5  контрольных  аналогов.  Анализ  показал наличие  нестабильности  хромосомного  набора  у  трансгенных  животных  (рис .

8,9) .

Рис.  8.  Структурные  хромосомные  нарушения  у  трансгенного  хряка№0438 .

Рис.  9.  Структурные  количественные  нарушения  хромосом  у трансгенного хряка .

На  рисунке  8  показан  кариотип  трансгенного  хряка  с  множественными хромосомными  аберрациями:  а  -  дицентрическая  хромосома,  возникшая  при слиянии  хромосом  2-й  и  9-й  пар;  б  -  ацентрический  фрагмент;  в  изохроматидный  разрыв  в  длинном  плече  хромосомы  7;  г  -  аберрантная хромосома неясной природы .

На  рисунке  9  приведен  кариотип  трансгенного  хряка  с  моносомией  по хромосоме 2-й пары - а и  дополнительная хромосома неясной природы. - б .

При первом взятии доля клеток с аберрациями  в среднем составила более 40%.  Спустя  три  месяца  частота  аберрантных  клеток  уменьшилась,  но оставалась  выше,  чем  в  контроле:  14,5  и  7,5%,  соответственно.  Известно,  что для  молодняка  характерен  более  высокий  уровень  хромосомной  изменчивости .

У  сибсов  доля  аберрантных  клеток  на  момент  второго  взятия  была  близка  к уровню этого показателя в контроле, хотя на начало исследования она почти в 3 раза  превосходила  контрольный  уровень.  Аналогично  изменялось  и  число аберраций  на клетку .

Результаты  этих  исследований  свидетельствуют  о  дестабилизирующем действии  экзогенов  на  ДНК  хозяина.  Таким  образом,  необходимым  условием сохранения  и  рационального  использования  трансгенных  животных  является оценка полноценности генома, в том числе на хромосомном уровне .

выводы 1.  Усовершенствованная  технология  криоконсервации  семени  кроликов позволяет  повысить  сохранность,  оплодотворяющую  способность сперматозоидов  и  многоплодие .

  Разработана  криопротективная  среда следующего  состава:  лактоза-2,17  г, лимонная  кислота-1,52  г,  Трис-2,74 г,  глицерин-2,0  мл,  ДМСО-2,5  мл,  желток  куриного  яйца-15  мл,  вода бидистиллированная-100  мл .

2.  Создан  банк  семени  гомозиготных  и  гемизиготных  трансгенных кроликов  по МСР и BLV. Дана оценка  криоконсервированного семени после оттаивания: подвижность сперматозоидов составляла 25-30%, при этом  сохранность  акросом  была  60-65%.  Получено  жизнеспособное потомство  от  замороженного  семени  трансгенных  кроликов  из криобанка .

3.  Установлено,  что  сперматозоиды  трансгенных  хряков,  хранившиеся  10 лет в жидком  азоте,  не потеряли своей биологической полноценности и сохранили  оплодотворяющую  способность.  Из  12  внутритрубно осемененных свиноматок  опоросилось 4, что составило 33%. При этом наследование трансгена было 35,7% .

4.  Создан  банк  семени  трансгенных  баранов.  Изучена  биологическая полноценность  сперматозоидов.  Установлено,  что  после криоконсервации  и  оттаивания  активность  сперматозоидов  у трансгенных  баранов составляла 45%,  а сохранность акросом - 68% .

5.  Создан банк семени трансгенных хряков 6 поколений Дана  оценка  биологической  полноценности  их  сперматозоидов.  После процесса  замораживания-оттаивания  активность  составляла  35-45%, сохранность  акросом  была 52-65% .

6.  Односторонняя  кастрация  самцов  не  приводит  к  снижению репродуктивной функции и может быть использована в качестве приема рационального использования и сохранения генетических ресурсов .

7.  На  основе  разработанной  технологии  получения  и  криоконсервации эпидидимального  семени  с  целью  сохранения  и  рационального использования  генетических  ресурсов  создан  банк  семени  редких, уникальных  и  исчезающих видов животных .

8.  Подвижность  замороженно-оттаянных эпидидимальных  сперматозоидов кролика  составляла  30%,  при  этом  сохранность  акросом  была  68% .

Получено  потомство  от  замороженно-оттаянной  эпидидимальной семени кроликов .

9.  Проведен  сравнительный  анализ  морфометрических  показателей сперматозоидов  разных  видов  животных.  Обнаружены  достоверные различия  по  общей  длине,  ширине,  длине  и  площади  головки сперматозоидов.  Впервые  дана  характеристика  видовых  особенности сперматозоидов сайгака, овцебыка и яка .

10.  В  результате  изучения  кариотипов  и  цитохимического  анализа выявлены  видовые  особенности,  а  также  установлена  положительная связь  между  числом  хромосом  и  содержанием  ДНК  в  сперматозоидах  у разных  видов  животных .

11.  При  криоконсервации  семени  кроликов  добавленная  чДНК  способна связываться  со  сперматозоидами  и  проникать  в  ооциты  при оплодотворении с последующей ее экспрессией .

12.  Связанная  со  сперматозоидами  чДНК  не  влияет  отрицательно  на  их оплодотворяющую  способность.  Перенесенная  со  сперматозоидами  в ооциты  чДНК  задерживает  развитие  зародышей,  вызывает дефрагментацию эмбрионов и раннюю эмбриональную смертность .

13.  В  результате  ПЦР-анализа  установлено  наличие  ретровирусной  генной конструкции  в  семени  кроликов,  баранов  и  быков.  Введение ретровирусной  конструкции  отрицательно  действует  на  подвижность сперматозоидов,  которая  снижается  до  20%  при  исходной  подвижности 80-90% .

14.  Анализ  гистологических  срезов  семенников  кроликов  показал,  что процесс  блокирования  сперматогенеза  начался  через  неделю  после введения  диметилфармамид+бусулфана.  С  14  недели  начинается процесс  восстановления  сперматогенеза.  Появление  сперматозоидов  в эякуляте наблюдается на  15 месяце после обработки .

15.  Разработанный  метод  использования  прикладных  компьютерных программ  позволяет  в  значительной  мере  повысить  эффективность цитогенетического  анализа .

16.  Установлено,  что  интеграция  чужеродных  генов  у  кролика  и  свиньи сопровождается  значительным  повышением  уровня  хромосомных нарушений .

ПРАКТИЧЕСКИЕ  ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1.  С  целью  повышения  эффективности  и  расширения  возможностей селекционно-племенной  работы  в  кролиководстве  предлагается технология  криоконсервации  семени  кроликов,  позволяющая  получать высокую  результативность  осеменения .

2.  Для  сохранения  и  рационального  использования  свиней  с  уникальными генотипами предлагается  метод внутритрубного осеменения свиноматок .

3.  Рекомендуется  технология  получения  и  криоконсервации эпидидимального  семени  животных  в  целях  сохранения  генетических ресурсов редких, уникальных и исчезающих  видов животных .

4.  В  целях сохранения  и рационального использования редких, уникальных и  исчезающих  видов  животных  рекомендуется  использовать  метод односторонней кастрации животных .

Список опубликованных работ по теме диссертации .

1.  Багиров  В.А.  Новый метод криоконсервации семени кроликов // Зоотехния .

1996. № 6. С. 28-29 .

2.  Кононов  В.П.,  Багиров  В.А.  О  некоторых  причинах  эмбриональной смертности  у  животных  //  Доклады  Российской  академии сельскохозяйственных  наук  1996.  № 6. С.37-38 .

3.  Эрнст  Л.К.,  Кононов  В.П.,  Багиров  В.А.,  Зыкунов  Н.П.,  Некрасов  А.А., Шатайло  В.Н.,  Чабан  И.М.  Трансгенных  поросята от спермы,  хранившейся в течении десяти лет // Свиноводство. 2002.  № 3. С.23-24 .

4.  Кленовицкий  П.М.,  Багиров  В.А.,  Иолчиев  Б.С.  Доцев  А.В.  Вопросы прикладной  цитогенетики  сельскохозяйственных  животных  //  Достижения науки и техники АПК. 2003. № 10. С. 17-19 .

5.  Багиров  В.А.  Технология  криоконсервации  семени  кролика  //  Достижения науки и техники АПК. 2004. № 9. С.35-37 .

6.  Кленовицкий  П.М.,  Багиров  В.А.  Сохранение  биоразнообразия  и характеристика  спермиев  разных  видов  животных  //  Аграрная  наука.  2004 .

№10.С.26-28 .

7.  Кленовицкий  П.М.,  Марзанов  Н.С.,  Багиров  В.А.,  Марзанов  Ю.С.,  Абдул Ахад  Бисвас  А.К.М.  Сравнение  генных  карт  и  анализ  дивергенции кариотипов  некоторых  полорогих  //  Вестник  Российской  академии сельскохозяйственных  наук. 2004.  № 3.  С.72-75 .

8.  Багиров  В.А.,  Эрнст  Л.К.,  Кленовицкий  П.М.,  Зиновьева  Н.А.  Сохранение генетических  ресурсов  редких,  исчезающих  и  уникальных  видов  животных // Цитология 2004. Том. 46. №9. С.767-768 .

9.  Кленовицкий  П.М.,  Багиров  В.А.,  Марзанов  Н.С.,  Зиновьева  Н.А.  Генные карты  сельскохозяйственных животных. Дубровицы.  2003.  91с .

10.Кленовицкий  П.М  Никишов  А.А.,  Иолчиев  Б.С,  Багиров  В.А.,  Марзанов Н.С.  Введение  в  прикладную  цитогенетику  одомашненных  животных .

Дубровицы. 2003.  56с .

11.Кленовицкий  П.М  Абдул  Ахад  Бисвас  А.К.М.,  Марзанов  Ю.С.,  Марзанов Н.С,  Багиров  В.А. Сравнительный анализ  генных порядков домашней овцы (Ovis  aries  L.)  и  крупного  рогатого  скота  (Bos  taurus  L).  Дубровицы.  2003 .

48с .

12.Кленовицкий  П.М.,  Багиров  В.А.,  Марзанов  Н.С,  Насибов  М.Г.  Генетика  и биотехнология  в селекции животных.  Москва. 2004.238с .

13.Кленовицкий  П.М.  Никишов  А.А.,  Иолчиев  Б.С,  Багиров  В.А.  Хромосомы одомашненных животных  и родственных  им видов. Дубровицы.  2002.44с .

14.Кленовицкий  П.М.,  Багиров  В.А.,  Нгбодо  Ж.В.,  Доцев  А.В.,  Иолчиев  Б.С .

Использование прикладных программ обработки изображений, совместимых с  Windows,  в  цитогенетических  исследованиях. Дубровицы..  2002.20с .

15.Зыкунов  Н.П.,  Багиров  В.А.,  Кононов  В.П.,  Некрасов  А.А.,  Голышев  Н.А .

Башкеев  Е.Д.,  Шатайло  В.Н.,  Чабан  И.М.,  Клецко  Н.Г.,  Эрнст Л.К.  Метод внутритрубного  осеменения  свиней.  Методические  рекомендации.  Быковос .

16.Багиров  В.А.,  Кленовицкий  П.М.,  Эрнст  Л.К.  Мутационные  изменения  у трансгенных  свиней.  Материалы  международной  конференции «Современные  достижения  и  проблемы  биотехнологии сельскохозяйственных животных». Дубровицы.  2003.  С.80-83 .

17.Bisvas  A.A.A.K.M.,  Klenovitsky  P.M.,  Bagirov  V.A.  Marzanov  N.S.  Syntenic maps  construction  of  domestic  sheep  (Ovis  aries  L.).  Материалы международной  конференции  «Современные  достижения  и  проблемы биотехнологии  сельскохозяйственных  животных».  Дубровицы.  2003 .

С.153-155 .

18.Багиров  В.А.,  Зыкунов  Н.П.,  Кононов  В.П.,  Эрнст  Л.К.  Метод внутритрубного  осеменения  свиноматок.  Материалы  международной научно-практической  конференции  «Роль  и  значение  искусственного осеменения с.х. животных XX и XXI  веков». Дубровицы.  2004.  С. 149-152 .

19. Bagirov  V.A.  Exogenous  DNA  as  the  reason  of embryonic  mortality  at  animals .

Материалы  международной  научно-практической  конференции  «Роль  и значение  искусственного  осеменения сельскохозяйственных  животных XX  и XXI  веков».  Дубровицы.  2004.  С.217-222 .

20.Багиров  В.А.,  Эрнст  Л.К.,  Грезина  Н.М.,  Кленовицкий  П.М.,  Зиновьева Н.А.  Сохранение генетических  ресурсов разных  видов  животных  и  изучение особенностей  ядер  их  сперматозоидов.  Материалы  международной  научнопрактической  конференции  «Прошлое,  настоящее  и  будущее зоотехнической науки». Дубровицы. 2004.  С. 129-134 .

21.Багиров  В.А.  Криоконсервация  семени  кролика.  Школа-практикум:

«Методы  исследований  в  биотехнологии  сельскохозяйственных  животных» .

Дубровицы. 2002.  С.7-12 .

22.Кленовицкий  П.М.,  Багиров  В.А.,  Доцев  А.В.  Получение  хромосомных препаратов  и  кариотипирование  кроликов.  Школа-  практикум:  «Методы исследований  в  биотехнологии  сельскохозяйственных  животных» .

Дубровицы.  2002.  С.62-66 .

23.Bagirov  V.A.,  Kononov  V.P..  The  possibility  of exogenous  DNA  penetration  into th spermatozoa  at  semen  cryopreservation.  Book  of  Abstracts  of  the  51   Annual Meeting of the EAAP. The Hagua. Netherland. 2000. P. 19 .

24.Иолчиев  B.C.,  Кленовицкий  П.М.,  Багиров  В.А.,  Гришин  В.Н .

Компьютерная  обработка  изображений  в  цитогенетике  животных .

Материалы  международной  научно-практической  конференции «Повышение  конкурентоспособности  животноводства».  Быково.  2002 .

Вып.8.  С.228-229 .

25.Багиров В.А. Возможность проникновения экстрагенетической информации в  сперматозоиды  при  криоконсервации  семени.  И-международная конференция  «Актуальные  проблемы  биологии  в  животноводстве».  Боровск

1995.С.169-170 .

26.Багиров  В.А.,  Кононов  В.П.  Сперматозоиды  как  векторы  для  переноса чужеродного  генетического  материала.  Современные  проблемы воспроизводства  стада  сельскохозяйственных  животных  и  задачи  кадрового обеспечения. Быково.  1996. С.21-22 .

27.Багиров  В.А.  Индукция  суперовуляции  у  крольчих.  Научно-практическая конференция  «Повышение  конкурентоспособности  животноводства  и задачи кадрового  обеспечения». Быково.  1997. С.111-113 .

28.Багиров  В.А.,  Новые  приемы  получения  трансгенных  животных.  Научнопрактическая  конференция  «Повышение  конкурентоспособности животноводства  и  задачи  кадрового  обеспечения».  Быково.  1998.  Часть  I .

С.95-97 .

29.Багиров  В.А.,  Кононов  В.П.  О  возможности  проникновения экстрагенетической  информации  в  сперматозоиды  при  криоконсервации семени.  Международная  научно-практическая  конференция.  «Актуальные проблемы биологии в животноводстве».  Боровск.  1997.  С.272-278 .

30.Эрнст  Л.К.,  Зыкунов  Н.П.,  Багиров  В.А.,  Некрасов  А.А.,  Шатайло  В.Н., Чабан И.М. Трансгенные поросята от семени, сохраненного в течение десяти лет.  VIII-Международная  научно-практическая  конференция  «Перспективы развития свиноводства в XXI веке». Быково. 2001. С. 151-153 .

31 .Кононов В.П., Зыкунов Н.П., Багиров В.А., Ондар А.А. Экстрагенетическая информация,  как  возможная  причина эмбриональной  смертности  у  свиней .

VIII-Международная  научно-практическая  конференция  «Перспективы развития  свиноводства  в XXI  веке». Быково. 2001.  С.147-150 .

32.Зыкунов  Н.П.,  Некрасов  А.А.,  Багиров  В.А.  Внутритрубное  осеменение свиноматок  микродозами  семени  хряка.  Материалы  юбилейной международной  научно-практической  конференции,  посвященной  10-летию РАМЖ  по  проблеме  «Повышение  конкурентоспособности  животноводства и задачи кадрового  обеспечения». Быково. 2004. С. 186-190 .

33.Bagirov  V.A.,  Klenovitsky  P.M.,  Zinoveva  N.A.  Analysis  of  chromosome aberrations  in  transgenic  pigs  and  rabbits.  Book  of Abstracts  of the  54lh  Annual Meeting of the EAAP. Rome, Italy. 2003. P. 14 .

Издательство РУЦ ЭБТЖ 142132, Московская обл., Подольский р-н,  п. Дубровицы тел.  8  (27) 65-14-24,  8(27)65-14-07 Сдано в набор 22.12.2004 Заказ №37.  Печ.л.2,1 Тираж  150 экз .






Похожие работы:

«Хапчаев Аскер  Юсуфович ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ  КИНАЗЫ ЛЕГКИХ ЦЕПЕЙ  МИОЗИНА И  БЕЛКА KRP  В РЕГУЛЯЦИИ  СОКРАТИТЕЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ  ГЛАДКИХ МЫШЦ 03.00.04 - Биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени...»

«008674 Изобретение относится к медицине и ветеринарии, в частности, к эмбриологии и может быть использовано для хранения микроскопических биологических объектов. К уникальным единичным микроскопическим биологическим об...»

«Экосистемы. 2016. Вып. 8. С. 59–62 УДК 502.75 ДИНАМИКА ВОЗРАСТНОЙ СТРУКТУРЫ ПРОСТРЕЛА ЛУГОВОГО (PULSATILLA PRATENSIS MILL.) В БАЛАШОВСКОМ РАЙОНЕ САРАТОВСКОЙ ОБЛАСТИ Шаповалова А. А. Балашовский институт Саратовского национального государственного исследовательского университета, Балашов, kupena07@rambler.ru В 2013–2016 гг. поведе...»

«Самсонова Наталья Николаевна Клонирование  и  функциональная  характеристика  гена ygjG  из Escherichia  oli  12. cK 03.00.03  - Молекулярная  биология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва, 20...»

«Сценарий внеклассного мероприятия Питание и здоровье Автор: учитель биологии высшей категории Новикова Н.Н. ЦЕЛИ: Пропагандировать здоровый образ жизни; активизировать познавательную деятельность учащихся; заинтересовать учащихся изучением вопросов здоровья; развивать творческие способности; расширить понятие о здоровом питании.ХОД ЗАНЯТИЯ Учитель....»

«МОЧАЛОВА Ольга Инаровна ПРИРОДНО-АНТРОПОГЕННЫЕ ПРОЦЕССЫ И СОВРЕМЕННЫЕ ЛАНДШАФТЫ ЗОНЫ БРАТСКОГО ВОДОХРАНИЛИЩА 25.00.36 - геоэкология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата географических  наук Москва - 2005 Работа выполнена ...»

«Плосконос Мария Вячеславовна ФИЗИОЛОГИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ ПОЛИАМИНОВ В РЕПРОДУКТИВНОЙ ФУНКЦИИ МУЖЧИН В НОРМЕ И ПРИ ЕЁ НАРУШЕНИЯХ 03.00.13 -физиология Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук Астрахань 2004 Работа выполнена на кафедре общей и биоорганической химии Аст...»

«1С • ггп: МАЛЫШЕВА Зинаида Георгиевна ЭКОЛОГО-БИОЛОГИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ ТЕХНОЛОГИИ ПОДГОТОВКИ СЕМЯН ОРЕХОПЛОДНЫХ ПОРОД к ПОСЕВУ (на примере Ростовской области) П.00.11 Охрана окрз^ающей среды и рациональное использо­ вание природных ресурсов 06.03.01 Лесные культуры, селекция и семеноводство АВТОРЕФЕРАТ диссер...»







 
2018 www.lit.i-docx.ru - «Бесплатная электронная библиотека - различные публикации»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.