«Самсонова Наталья Николаевна Клонирование  и  функциональная  характеристика  гена ygjG  из Escherichia  oli  12. cK ...»

На правах рукописи

Самсонова Наталья Николаевна

Клонирование  и  функциональная  характеристика  гена ygjG  из

Escherichia  oli  12 .

cK

03.00.03  - Молекулярная  биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва, 2004 г .

Работа  выполнена  в  лаборатории  №2  Научно-исследовательского  института

Аджиномото-Генетика  (ЗАО  "АГРИ") .

кандидат химических наук  Научный руководитель:  Л. Р. Птнцын Официальные оппоненты: доктор биологических наук  А. С. Миронов кандидат биологических наук  Л. В. Генинг Центр биоинженерии РАН

Ведущая организация: 

2004 г.  в  1400  часов  на  заседании Диссертационного Защита  состоится  совета  Д217.013.01  при  ФГУП  «Государственный  научно-исследовательский  институт генетики и селекции  промышленных микроорганизмов»  по адресу:  11754S,  г.Москва,  1-й Дорожный проезд, д.1 .

С диссертацией  можно ознакомиться в библиотеке  ФГУП «Государственный научноисследовательский институт генетики  и  селекции  промышленных микроорганизмов»

Автореферат  разослан  апреля  2004  г Ученый  секретарь Диссертационного  Совета кандидат  биологических  наук  В.И.Щербакова

-1ВВЕДЕНИЕ Актуальность  проблемы .

Полиамины присутствуют практически во всех видах биологических организмов,  от бактерий  и  вирусов  до  человека,  и  участвуют  в  огромном  количестве  разнообразных биологических и биохимических реакций, включая синтез ДНК, РНК и белков [Abraham, 1968;  Frydman et  al.,  1992].  Исследование  клеток прокариот  и  эукариот показало,  что  в различных  организмах  не  только  функционируют  одинаковые  соединения  полиаминов (чаще  всего  это  путресцин,  спермидин,  спермин  и,  существенно  реже,  кадаверин),  но также  универсальны  и  многие  этапы  биосинтеза  этих  поликатионов  [Tabor  et  al.,  1985;

Pegg,  1986].  Хотя  не  вызывает  сомнений  тот  факт,  что  полиамины  выполняют  важные физиологические  функции  и  совершенно  необходимы  для  обеспечения  нормального клеточного  роста,  было  показано,  что  избыточное  накопление  полиаминов  в  клетке ингибирует синтез белков, вызывает замедление роста, а в некоторых случаях приводит к гибели  организма  [Не  et  al.,  1993].  Ацетилирование  полиаминов  по  так  называемому ацетилазному пути деградации, помогает предотвратить эффект токсичности полиаминов как  в  про-,  так и  в  эукариотах  [Matsui  et  al.,  1982].  Образующиеся  при  этом ацетилпроизводные  полиаминов  далее  окисляются  полиаминооксидазами, деацетилируются,  либо  экскретируются  из  клетки  [Ignatenko  et  al.,  1996].  У  некоторых микроорганизмов  охарактеризован  также  альтернативный  аминотрансферазный  путь деградации полиаминов .

Наиболее  подробно  изучен  аминотрансферазный  путь  деградации  путресцина  в клетках Escherichia  coli.  Показано,  что  трансаминирование  путресцина,  катализируемое путресцин  аминотрансферазой  (КФ  2.6.1.29),  и  последующее  декарбоксилирование образующегося  аминобутиральдегида приводят к образованию  (GABA), который в дальнейшем преобразуется в сукцинат, включаясь в цикл Кребса  [Snaibe et al., 1985].  Совокупность  реакций  биосинтеза  путресцина  из  аргинина  и  его  деградации  до сукцината  образуют  так  называемый  аргинин  декарбоксилазный  путь  деградации аргинина  (ADC)  Ecoli.  Было  показано,  что  все  ферменты  ADC  пути,  за  исключением аргинин  декарбоксилазы,  индуцируются  в  условиях  азотного  голодания  [Snaibe  et  al .

, 1985].  Однако,  несмотря  на  то,  что  ADC  путь  деградации  Ecoli  довольно  хорошо охарактеризован  как  биохимически,  так  и  генетически,  еще  не  все  гены  этого  пути картированы.  Так  до  сих  пор  не  были  локализованы  гены,  кодирующие  ключевые ферменты деградации путресцина - пиридоксальфосфат (PLP) - зависимую путресцин:хкетоглутарат  аминотрансферазу  (ПАТазу)  и  аминобутиральдегид  дегидрогеназу .

Вследствие  того,  что  уровень  активности  ПАТазы  даже  в  индуцирующих  условиях азотного  голодания  чрезвычайно  низкий,  изучение  этого  фермента  до  сих  пор проводилось  только  в  мутантных  по  утилизации  полиаминов  и  GABA  штаммах  Ecoli .

Возможно,  по  этой  причине  в  независимо  выполненных  работах  Kim  [Kim,  1964]  и В  этой  связи  актуальной  является  задача  идентификации  гена E.coli,  кодирующего ПАТазу,  с  использованием  методов  биоинформатики  и  генетической  инженерии, выделение  нативного  фермента  и  изучение  его  свойств  современными  методами молекулярной биологии .

Цель и задачи работы .

Целью  представленной  работы  являлась  идентификация  гена  Kcoli,  кодирующего ПАТазу,  конструирование  плазмид,  обеспечивающих  достаточно  высокий  уровень продукции  фермента,  а  также  определение  основных  физических  и  кинетических параметров очищенного препарата ПАТазы .

В процессе работы были решены следующие задачи:

•  Идентификация  гена,  кодирующего  ПАТазу,  в хромосоме  штамма (ген •  Изучение Ntr-зависимой регуляции экспрессии гена •  Конструирование  экспрессионных  плазмид,  обеспечивающих  эффективную продукцию ПАТазы как в  виде  "слитого"  белка с his6-tag лидерным пептидом (Ht-YgjG), так и нативного белка •  Разработка  лабораторного  метода  выделения  белка  YgjG  из  растворимой фракции клеточных лизатов рекомбинантного штамма Е.соН;

•  Исследование и  сравнительная  характеристика каталитических  активностей  и некоторых  основных  физических  и  кинетических  параметров  очищенных препаратов Научная новизна и практическая значимость работы .

Впервые • идентифицирован  и  клонирован  ген  кодирующий  путресцин аминотрансферазу в клетках Escherichia coli К12. Изучена его структурная организация и выявлены  регуляторные  последовательности,  обеспечивающие  -  зависимую индукцию экспрессии  в условиях азотного голодания .

Разработана  методика  получения  высокоочищенного  препарата  каталитически активного белка  из биомассы рекомбинантного штамма Е. coli .

Показано,  что  фермент  эффективно  катализирует  путресцин:

аминотрансферазную  реакцию,  а  также  может  использовать  кадаверин  и,  с  меньшей эффективностью,  спермидин  в  качестве  доноров  аминогрупп.  Фермент  термостабилен, активен  только  в  щелочном  диапазоне  значений  рН  и  проявляет  максимум  активности при  рН  9 .

0  и  температуре  70  °С.  Интересной  особенностью  фермента  является  его способность  катализировать  глутамагпируват  аминотрансферазную  реакцию  (GPT,  КФ 2.6.1.2).  Ни  одна  из  известных  к  настоящему  времени  полиамин  аминотрансфераз  не проявляет GPT активности. Субстратная специфичность YgjG и зависимость активности фермента  от  рН  совпадают  с  параметрами  ПАТазы,  выделенной  Kim  [Kim,  1964]  из мутантного по утилизации путресцина штамма Rcoli B6 .

Сравнение  свойств  очищенных  препаратов  YgjG  и  Ht-YgjG,  несущего дополнительную  his6-tag  лидерную  последовательность  на N-конце  белка,  показало, что данная  модификация •  N-концевой  последовательности  влияет  на  субстратную специфичность  и  ферментативную  активность  препарата.  Кроме  того,  элиминация первых  30  аминокислот  YgjG  приводит  практически  к  полной  потере  активности фермента .

Полученные в работе данные могут быть использованы для исследования полиамин аминотрансфераз  других  микроорганизмов  и  для  дальнейшего  изучения  путей метаболизма полиаминов в E.coli .

Апробация работы .

Результаты  работы  были  представлены  на  Пущинской  школе  молодых  ученых (Пущино,  15-19.05.02),  на  Научной  сессии  МИФИ-2003  (Москва,  12-16.01.03),  на  XV зимней  международной  молодежной  научной  школе  «Перспективные  направления физико-химической  биологии и  биотехнологии»  (Москва,  12-19.02.03), на первом FEMS конгрессе  европейских  микробиологов  (1 s t  FEMS  Congress  of  European  Microbiologists, Slovenia, Lubliana, 29.06-03.07.2003) .

Публикации. По результатам исследований опубликовано 5 печатных работ .

Структура и объем диссертации .

Диссертация  состоит  из  Введения,  Обзора  литературы,  Материалов  и  методов, Результатов и обсуждения, Выводов и Списка литературы .

Во  Введении  обоснована  актуальность  работы  и  сформулирована  ее  цель  и практическая  значимость.  В  Обзоре  литературы  рассмотрены  современные представления  об  основных  функциях  полиаминов  in  vivo,  описаны  известные  пути биосинтеза  и  катаболизма  основных  соединений  полиаминов  в  микроорганизмах .

Приведены сведения о полиамин аминотрансферазах, известных к настоящему времени .

В  разделе  Результаты  и  обсуждение  изложены  результаты  исследования  структурной  и функциональной  организации  гена  ygj'G,  приведены  физические  и  кинетические параметры  исследованного  фермента.  В  разделе  Материалы  и  методы  приведены материалы и методики, а также оборудование, использованные при проведении работы .

Диссертация изложена на  109  страницах,  содержит 24  рисунка,  12 таблиц и список цитированной литературы из 179 наименований .

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1.  Идентификация гена, кодирующего ПАТазу, в хромосоме штамма Kcoli K12 Исходя  из  принадлежности  путресцина,  содержащего  дистальную  аминогруппу  в положении углеродной цепи, к классу субстратов для PLP-зависимых аминотрансфераз (АТаз) III группы [Mehta et al., 1993] и литературных данных о Ntr-зависимой экспрессии НАТазы  Exoli  [Snaibe  et  al.,  1985]  был  осуществлен  поиск  гипотетических  открытых рамок  считывания  (ORF)  Exoli:  а)  обладающих  существенной  гомологией  с консенсусной  последовательностью  аминотрансфераз  III  групп  PF00202,  б)  экспрессия которых  индуцируется в условиях азотного голодания.  Проведенный нами анализ  банка данных  аминокислотных  последовательностей  E.coli  K12  [Blattner  et  al.,  1997]  выявил единственную  последовательность,  удовлетворяющую  обоим  критериям  — последовательность  YgjG  (SWISS-PROT  Database  accession  number  размером 496  аминокислотных  остатков  (а.к.о.),  аннотированную  как  предполагаемая  (putative) орнитин  аминотрансфераза  (ОАТаза,  КФ  2.6.1.13).  Найденная  последовательность обладает  существенной  гомологией  и  высокой  степенью  схожести  с консенсусной  последовательностью  трансаминаз  III  группы,  а  индукция соответствующей  мРНК  в  условиях  азотного  голодания,  согласно  данным  DNA-array [Zimmer  et  al.,  2000],  составляет  от  3  до  5  раз.  На  основании  полученных  результатов нами было предположено, что YgjG может обладать ПАТ активностью .

Кодирующая  YgjG  последовательность  гена  GenBank accession number  gi| 1789454),  размером  1491  п.н.  расположена  на  69,35  минуте  хромосомы  Ecoli ниже аег гена (Рис.  1). Для установления типа ферментативной активности полипептида YgjG  и  проверки  данных  о  Ntr-зависимой  индукции,  1791-п.н.  фрагмент,  включающий последовательности  ygjG  и  aer-ygjG  межгенную  область,  был  получен  ПЦРамплификацией  соответствующего  района  хромосомы  штамма  Escherichia  coli  K12 MG1655  с  использованием  олигонуклеотидов  5'TTGGATCCGATTAATTTGATTTAGATCGCA-3' и 5'-TTCTGCAGCCTGCGGGCGTACGC GTCG  -3'  в  качестве  праймеров  (Рис.  1).  В  результате  амплификации  фрагмент  был фланкирован  сайтами  для  рестриктаз  ВатШ  и  Pstl.  Полученный  ВатШ-Psil  фрагмент был  клонирован  под  контролем  промотора  Pucuvs  в  составе  мультикопийного  вектора pUC18  и  нуклеотидная последовательность  вставки  в  полученной  плазмиде  pUC18-ygjG была секвенирована для подтверждения правильной структуры фрагмента .

Клетки  Ecoli  TGI  были  трансформированы  плазмидой  pUC18-ygjG  и  плазмидой pUC18,  использовавшейся  в  качестве  контроля.  Для  индукции  биосинтеза полипептида YgjG  штаммы культивировали в  следующих условиях:  а)  на богатой  LB  среде (индукция 1 мМ изопропилтиогалактозидом (IPTG), 2 ч); б) на минимальной среде М9, содержащей пролин вместо аммония в качестве единственного  источника азота (в условиях азотного голодания).  Тестирование  аминотрансферазной  активности  в  клеточных  лизатах проводили,  используя  в  качестве  доноров  аминогрупп  следующие  соединения  с дистальными  аминогруппами:  путресцин,  орнитин,  ацетилорнитин  (АсО),  GABA, диаминопропан  (DAP)  и  некоторые  аминокислоты .

  В  качестве  возможных  акцепторов были проверены  пируват,  Продукты реакции трансаминирования кетокислот  анализировали  при  помощи  тонкослойной  хроматографии.  Специфическая аминотрансферазная активность была обнаружена только в случае пары при  щелочных  значениях  рН  в  штамме  TGl(pUC18-ygjG).  При  этом  наблюдалась существенная  индукция  ПАТ  активности  (около  10  раз)  при  росте  TGl(pUC18-ygjG)  в условиях  азотного  голодания  (47 нмоль  по  сравнению  с  ростом  на  богатой среде  (5  нмоль  В  контрольном  штамме  TGl(pUC18)  данная  активность  не детектировалась  ни  на  богатой  среде,  ни  в  условиях  азотного  голодалния  (т.е.  была меньше нижнего предела разрешения методики измерения -1 нмоль  Орнитин аминотрансферазная  (О  AT)  активность,  аннотированная  для  YgjG,  также  не детектировалась ни в одном штамме .

Таким  образом,  на  данном  этапе  нашей  работы  было  установлено,  что амплификация  1,8-т.п.н.  фрагмента,  содержащего  последовательность ygjG,  в  составе мультикопийной  плазмиды  действительно  приводит  к  появлению  специфической ПАТазной  активности,  которая  индуцируется  при  выращивании  клеток  в  условиях лимитации  по  неорганическому  азоту.  В  связи  с  чем,  было  признано  целесообразным дальнейшее  изучение  и  проведение  подробного  анализа  нуклеотидной последовательности  клонированного  1,8-т.п.н.  фрагмента,  содержащего последовательность гена ПАТазы -ygjG (pat) .

2.  Функциональное изучение структурной организации 1,8-т.п.н. фрагмента, содержащего регуляторную область и последовательность гена ПА Тазы 2.1.  Анализ  нуклеотидной  последовательности ygjG  и  aer-ygjG  межцистронного района Как  результат  компьютерного  анализа  нуклеотидной  последовательности  ygjG  и aer-ygjG  межцистронного  района  в  базе  данных NCBI  (National  Center for Biotechnology Information)  приведены  две  предполагаемые  промоторные  последовательности специфичные  для  субъединиц  ДНК-зависимой  РНК-полимеразы  Kcoli, соответственно,  а  также  сайт  связывания  регуляторного  белка  FIS  (Рис.  2).  Следует отметить, что если  промотор локализован в регуляторной области гена, то промотор  -  в  5'  кодирующей  последовательности  ygjG.  В  соответствии  с  этим данными  были  аннотированы  две  рамки  считывания  для  потенциального  продукта трансляции  мРНК  (Рис.  1,  2).  Первая  из  них,  описанная  выше  как  ygjG,  кодирует полипептид  размером  496  а.к.о.,  биосинтез  которого  возможен  только  в  случае инициации  транскрипции  соответствующей  мРНК  с  промотора .

Нуклетотидная  последовательность  ygjG  будет  обозначаться  ниже  как  orf.  Инициация транскрипции  другой  рамки  -  одноименного  гена  (gi|1171884)  размером  1290  п.н .

(обозначенной  нами  как  оrf1),  кодирующей  полипептид  размером  429  а.к.о.  (Р42588), возможна  с  любого  из  промоторов.  Обе  рамки  имеют  классический  стартовый  кодон AUG .

Проведенный  нами  дополнительный  анализ  нуклеотидной  последовательности района,  расположенного  слева  от  предполагаемой  последовательности [Reitzer et al., 2001], выявил потенциальный сайт связывания регуляторного белка IHF и два  сайта  связывания  белка-регулятора Ntr-ответа NRI,  участие  которых,  как  известно, необходимо для обеспечения инициации транскрипции  РНК полимеразой Exoli  в  условиях  азотного  голодания  [Magasanik,  1996].  Нуклеотидные последовательности  предполагаемых  промоторных  последовательностей,  а  также  сайты связывания  регуляторных  белков  и  соответствующие  им  консенсусные последовательности  указаны  на  Рис.2.  Также  при  анализе  нуклеотидной последовательности,  расположенной  справа  от  была  выявлена  еще  одна возможная рамка  считывания,  обозначенная  нами  как  оrf2  (Рис.2).  Эта рамка кодирует полипептид  размером  459  а.к.о.,  экспрессия  которого  возможна  при  инициации транскрипции с каждого из промоторов. Трансляция orf2 должна инициироваться с редко используемого стартового кодона UUG, что, как правило  отражает механизм регуляции скорости биосинтеза белка на трансляционном уровне [Parsons et al, 1988] .

Рамки  считывания  orfl  и  orf2  имеют  легко  узнаваемые  потенциальные  SD  (ShineDalgamo)  последовательности  (Рис.  2),  расположенные  на  функционально  значимом расстоянии  (5-13  оснований)  от  инициирующего  кодона  [Makrides,  1996],  однако, теоретически каждая из трех рамок считывания может транслироваться in vivo .

Рис.  2.  Нуклеотидная  последовательность  5'-концевой . области  ygjG  и  aer-ygjG межгеипой  области .

Нумерация  нуклеотидов  приведена  относительно  положения  " + 1 "  старта  мРНК выделенного  курсивом  (см.  Раздел  2.3  и  Рис.4).  Анонсированные  последовательности  «и  «-35»  предполагаемого  промотора  выделены  рамкой,  а  возможный  сайт связывания  FIS  подчеркнут  сверху.  Сайты  рестриктаз  подчеркнуты  волнистой  линией .

Последовательности  промотора  и  предполагаемых  сайтов  связывания  и  IHF выделены  жирным  шрифтом,  выше  приведены  соответствующие  консенсусные последовательности.  SD  последовательности  подчеркнуты  сверху.  Три  вероятных стартовых  кодона трансляции  рамок ygjG  iprf),  orfl  и  or/2  выделены  жирным  шрифтом .

Изучение  регуляции  экспрессии  гена  ПАТазы.22. 

Для  экспериментальной  проверки  функциональности  промоторов  были сконструированы  три  «гибридные»  экспрессионные  кассеты,  в  которых  различные участки  фрагмента  ВатHI-AccIII  (Рис.  1)  регуляторной  области  гена  ПАТазы,  были слиты  со  структурной  частью  гена-репортера  lacZ  (Рис  3).  При  этом  в  разных конструкциях эффективность экспрессии гена  определялась:  а)  в  случае кассеты  I,  содержащей  полноразмерный  фрагмент регуляторной  области  ПАТазы ВатHIАссIII,  -  силой  обоих  промоторов;  б)  в  случае  кассеты  II  (фрагмент  BgR-АссIII)  -  только активностью  промотора  в)  в  случае  кассеты  III  (фрагмент  ВатHI-BglI)  -  только активностью  промотора  Экспрессионные  кассеты  были  клонированы  в  составе плазмиды  pBRP  [Ptitsyn  et  al .

,  1990],  полученной  из  pBR322,  путем  замены  EcoRl-Sphl фрагмента  ДНК,  содержащего  промотор  вместе  с  5'-дистальной  частью  гена устойчивости  к  тетрациклину  tetА,  на  соответствующий  фрагмент EcoBl-Sphl  полилинкера плазмиды pUC18. В качестве контрольной плазмиды использовали pBR-OlacZ, полученную при клонировании в векторе pBRP только структурной части гена lacZ .

Клетки  Kcoli  TG1  были  трансформированы  полученными  плазмидами .

Рекомбинантные  штаммы  культивировались  в  различных  (по  содержанию  азота) условиях роста:  на  богатой  LB  среде,  на минимальной  среде М9  и  в  описанных выше условиях азотного голодания .

Измерение  активности  р-галактозидазы  в  лизатах  штаммов  проводили  по стандартной  методике  [МШег,  1972].  Во  всех  четырех  штаммах  при  росте  на  богатой среде  LB,  а  также  в  штамме,  несущем  плазмиду  pBR-lacZ-З  и  контрольную  плазмиду при  росте  во  всех  трех  средах,  уровень экспрессии  был чрезвычайно  низок  (порядка  200  единиц Миллера)  (Таблица  1),  что  свидетельствовало, во-первых,  о  практически  полном  отсутствии  экспрессии  гена  ПАТазы  при  росте  на богатой  среде, и, во-вторых,  об  отсутствии  промоторных последовательностей  в 287-п.н .

фрагменте  BamW-BgR .

В  штамме,  несущем  плазмиду  уровень  экспрессии  lacZ  на стандартной среде М9, а также в условиях азотного голодания, был в 3 — 6 раз выше, чем в  штамме  с  что  соответствует  данным  литературы  о  чрезвычайно  низком уровне  транскрипции  с  промоторов  при  отсутствии  NRI  энхапсера [Magasanik,  1996].  Pla основании  этих результатов  нами  был  сделан вывод о том, что  56п.н.  фрагмент  действительно  содержит  последовательность  промотора, который является основным для экспрессии ПАТазы .

Рост штамма  на бедных средах, особенно в условиях азотного голодания,  сопровождался  существенным  возрастанием  активности  Р-галактозидазы.  По сравнению  со  штаммом  уровень  экспрессии  lacZ  в lacZ-1)  увеличился  в  9  раз  на  М9  среде  и  в  28  раз  на  безазотной  среде  с  пролином.  В случае использования в качестве альтернативного источника азота других аминокислот — аланина,  орнитина  или  аргинина,  увеличение  активности  в  этих штаммах  в  условиях  азотного  голодания  составило  22,5  раза,  если  в  качестве альтернативного  источника  азота  использовался  аргинин  или  орнитин,  и  19,5  раза  в случае использования аланина.  Следовательно,  ВатHI-Bgli  фрагмент чрезвычайно важен для  экспрессии  гена  ПАТазы  в  условиях  роста  на  М9  и  в  условиях  азотного  голодания, что  обусловлено,  по-нашему  мнению,  наличием  в  составе  этого  фрагмента  сайтов связывания  NRI  и,  возможно,  IHF  сайта.  Учитывая  не  характерное  для  Ntr-зависимой регуляции расположение  IHF левее  сайтов NRI,  нельзя исключать вероятность того, что IHF  участвует  не  в  регуляции  гена  ПАТазы,  а  в  регуляции  соседнего  противоположно ориентированного гена aer  [Rebbapragada ct al.,  1997] .

Таким  образом,  результаты  данных  экспериментов  позволяют  сделать  вывод  о том,  что  транскрипция  мРНК  гена  ПАТазы  инициируется  только  промотором  при росте  штаммов  на  минимальной  среде  М9,  достигая  максимума  в  условиях  азотного голодания, и строго репрессируется на богатой LB среде .

2.3.  Определение старта инициации транскрипции гена ПАТазы Для подтверждения функциональности  промотора было проведено определение положения  старта  транскрипции  мРНК  ПАТазы.  Для  этих  экспериментов  были  выделены препараты  мРНК  штамма  выращенного  на  всех  трех  средах (описанных  в  Разделе  2.2).  В  качестве  контроля  использовали  препарат  мРНК  штамм TGl(pUC18).  Реакции  синтеза  кДНК  проводили,  используя  радиоактивно  меченый олигонуклеотид  комплементарный последовательности  «+88»  -  «+115»  относительно  3'-фланкирующего  нуклеотида промотора,  выделенные  препараты  мРНК  и  рекомбинантную  обратную  транскриптазу Omniscnpt  (Qiagen).  Синтезированные  фрагменты  кДНК  анализировали  в  6%  ПААГ, визуализацию  и  количественную  оценку  радиоактивных  сигналов  проводили  с использованием  мультифункционального сканера Typhoon  9210  (Amersham-Pharmacia)  и программы  ImageQuant  (V  5 0).  Анализ  данных  (Рис.  4)  позволил  идентифицировать  в качестве  возможного  первого  основания  мРНК  —  гуанозин  (G),  локализованный  на расстоянии  10  нуклеотидов  относительно  3'-фланкирующего  нуклеотида  промотора .

Соответствующий  кДНК  транскрипт  детектировался  только  для  препаратов  РНК, полученных  из  клеток,  выращенных  на  стандартной  М9  среде  и  в  условиях  азотного голодания,  причем  количественное  соотношение  транскриптов  в  этих  препаратах составило  1:4, соответственно .

–  –  –

Таким  образом,  полученные  результаты  подтверждают  факт  инициации транскрипции  мРНК  только  с  промотора,  что  соответствует результатам  эксперимента  с  использованием  гена-репортера  lacZ  (Таблица  1)  и результатам  измерения  активности  ПАТазы  в  клетках  штамма  TGl(pUC18-ygjG)  при различных  условиях  выращивания  (см.  Раздел  1)  Следует  также  отметить,  что  наши эксперименты  показывают  некорректность  анонсирования  ORF  ygjG  (gl789454,  Ь3073) как гена размером  1491  п н, кодирующего полипептид размером 496 а к.о. (SWISS-PROT Database,  Q8XAN1).  Анонсированный  для  этой ORF  промотор  также  не функционирует при  выращивании  клеток  ни  на богатой  LB  среде,  ни  на минимальной среде М9, ни в условиях азотного голодания .

2.4.  Анализ продуктов трансляции orfl и ог/2 Как уже  было  отмечено  выше,  установление  факта  инициации  транскрипции  гена ygjG  с  промотора  ограничивает  выбор  ORF,  кодирующей  активную  ПАТазу  только двумя альтернативными вариантами - orfl или orfl .

 Для анализа продуктов трансляции orfl  и  orfl  мы  воспользовались  общепринятым  для  подобного  рода  исследований подходом:  конструированием  экспрессионных  плазмид,  обеспечивающих  биосинтез полипептидов,  кодируемых  этими  рамками  считывания,  в  виде  гибридных  белков «слитых»  с  лидерным  пептидом  Последовательности  обеих  рамок  считывания были  ГЩР  амплифицированы  с  использованием  "прямых"  праймеров  5'CCGATATCATGAAAGCACTTAACCGAGAG-31  для  и  5'orfl  CCGATATCTTGAACAGGTTACCTTCGAG-31  для  orfl,  "обратного"  праймера  5'TTCTGCAGCCTGCGGGCGTACGCGTCG-3'  и  плазмиды  pUC18-ygjG.  Полученные фрагменты были клонированы в составе вектора  (Novagen, США). При этом последовательности  orfl  и  orfl  были  слиты  с  his6-tag  лидерной последовательностью вектора с сохранением рамки считывания (Рис 5) .

Рис. 5. Структура регуляторных областей экспрессионных плазмид pET15b-Ht-ORFl и pET15b-Ht-ORF2 .

Показаны  основные  структурные  элементы  экспрессионной  кассеты  вектора поздний  фаговый  промотор  фага  Т7  (Т7),  участок  связывания  рибосом  гена  10  фага  Т7 лидерпый  пептид  Приведена  первичная  структура  ДНК  областей сопряжения  трансляционных  рамок  orfl  и  orfl  и  лидерного  пептида  а также  Nконцевые аминокислотные последовательности белков Ht-ORFl и Ht-ORF2 .

Клетки BL21(DE3) трансформировали полученными  плазмидами pET15b-Ht-ORFl, pET15b-Ht-ORF2  и  контрольной  плазмидой  рЕТ15Ь.  Биосинтез  целевых  белков  в рекомбинантных  штаммах  индуцировали  добавлением  1  мМ  IPTG  и  тестировали полученные  лизаты  штаммов  на  присутствие  активности  ПАТазы.  ПАТ  активность  в штаммах  составила  0,05  и 2,16  мкмоль  В  контрольном  штамме  BL21(DE3)[pET15b]  ПАТ  активность  не детектировалась.  Электорофоретический  анализ  белков  из  клеточных  лизатов  штаммов показал,  что  спустя  два  часа  после  индукции  синтеза  слитых  белков  их  удельное содержание  в  растворимой  фракции  клеточных  белков  составило  2,4  %  для  Ht-ORFl  и 8,5 % для Ht-ORF2 соответственно (Рис.6) .

–  –  –

Для  сравнения  удельных  активностей  Ht-ORFl  и  Ht-ORF2  были  получены очищенные препараты  слитых белков.  Наличие  полигистидиновых последовательностей в N-концевой части гибридных белков Ht-ORFl  и Ht-ORF2 позволило использовать для их  эффективной  очистки  IMAC  хроматографию  (immobilized-metal-affinity chromatography).  Выход  полипептида  Ht-ORF2  составил  около  80%.  Было  получено  4,5 мг  препарата,  содержащего,  по  результатам  сканирования  SDS-электрофорезного  геля, до  95%  целевого  белка  (Рис.  6).  Напротив,  выход  препарата  Ht-ORFl  составил  менее 20%,  что,  по  нашему  мнению,  было  вызвано  протеолитической  деградацией рекомбинантного  белка  как  на  стадии  его  биосинтеза,  так  и  в  процессе  его  очистки .

Содержание  целевого  белка  Ht-ORFl  в  полученном  препарате  по  результатам сканирования  SDS-электрофорезного  геля  (Рис.  6)  не  превышало  65%.  Молекулярные массы выделенных полипептидов Ht-ORFl  (48 kDа) и Ht-ORF2 (52 kDа) соответствовали сумме  расчетных значений лидерного пептида - 2,1 Ша, соответственно .

Анализ ПАТ активности очищенных препаратов  Ht-ORFl  и  Ht-ORF2, показал, что удельная  активность  Ht-ORF2  составляет  11,7  мкмоль  в  то  время  как активность Ht-ORFl  - только 0,2 мкмоль  По-видимому, элиминация первых 30 N-концевых  аминокислот  практически  инактивирует  фермент.  Полученный  результат функционального  анализа  продуктов  трансляции  Ht-ORFl  и  Ht-ORF2  свидетельствует  о том,  что  оrf2  является  истинной  рамкой  гена ygj'G,  кодирующей  биологически  активный белок  YgjG  (ПАТазу)  размером  459  а.к.о .

3.  Характеристика каталитической  активности YgjG  (ПАТазы) E.colL Любые  модификации  аминокислотной  последовательности  белка  могут  оказывать влияние на его биологическую активность. Такое влияние, однако, проявляется не всегда, или  может  быть  выражено  слабо.  Согласно  результатам,  полученным  нами  при функциональном  анализе  продуктов  трансляции  orfl  и  ог/2,  N-концевая  кодирующая последовательность  ПАТазы  имеет  решающее  значение  в  процессе  формирования каталитически  активного  белка  (факт  интенсивного  протеолиза  Ht-ORFl  также  можно рассматривать  как  косвенное  свидетельство  в  пользу  этой  гипотезы).  Поэтому,  чтобы охарактеризовать  каталитическую  активность  YgjG,  а  также  проверить  соответствие синтезирующегося  in  vivo  белка  ПАТазы  продукту  трансляции  orfl,  мы  сочли необходимым  выделить  нативный  препарат  YgjG .

3.1. Экспрессия и разработка метода выделения белка YgjG С  этой  целью  нами  была  реализована  схема  экспрессии  активной  ПАТазы  на мультикопийном  плазмидном  векторе,  с  заменой  NtrC-регулируемого  промотора  на сильный  промотор  фага  Т7.  Для  эффективной  экспрессии  YgjG  фрагмент  плазмиды pUC18-ygjG,  первичная  структура  которого  включала  в  себя  последовательность  orfl  (a также  и  более  короткую  последовательность  orfl)  вместе  с  предполагаемым  сайтом связывания  рибосом,  был  ПЦР-амплифицирован  с  использованием  праймеров ACTTCTAGACCTCCGGAGCATATTTTGAAC-3f  и  5'TTCTGCAGCCTGCGGGCGTACGCGTCG-3'  и  клонирован  в  составе  плазмидного вектора  рЕТ22Ь(+)  (Рис.  7).  Анализ  ПАТ  активности  в  клеточном  лизате  штамма BL21(DE3)  трансформированного  полученной  плазмидой  pET22b-ORF2  показал,  что спустя  два  часа  после  индукции  синтеза  ПАТазы  ее  активность  составляла  порядка  340 нмоль Разработанная  нами  процедура  очистки  YgjG  из  растворимой  фракции  тотального клеточного  белка  штамма  BL21(DE3)[pET22b-ORF2]  включала  стадии фракционирования,  в  растворе-  обогащения  при  высокотемпературной инкубации  и  три  хроматографических  стадии  очистки  (Таблица  2) .

  Все  этапы  очистки проводили  при  4  °С.  Присутствие  10  цМ  PLP  в  буферных  растворах  на  всех  этапах очистки  способствовало  сохранению  ПАТ  активности  фермента.  Высокий  уровень термостабильности  YgjG  (см.  ниже)  позволил  ввести  этап  очистки  с  помощью термоинкубации  при  60°С.  Хроматографическая  очистка  препарата  на  ДЕАЕ-сефарозе  и гидроксилапатите  (ГАП)  позволили  достичь  9 5 %  чистоты  YgjG  (Рис.  8)  с  выходом  36% .

Удельная  ПАТ  активностью  очищенного  препарата  YgjG  составила  14,1  мкмоль мин -1 мг' 1 (Таблица 2).  Полученный  препарат был достаточно стабилен, сохраняя 90% активности  в течение двух  суток при +4 °С либо в течение 2  месяцев при  -70 °С .

Молекулярная  масса  выделенного  белка  YgjG  по  данным  SDS-электрофореза составила  около  50  kDa,  что  согласуется  с  расчетным  значением  и  подтверждает сделанное  нами  ранее  заключение  о  том,  что  каталитически  активный  препарат  YgjG (ПАТаза) является  продуктом трансляции orf2 .

Молекулярная  масса  препарата  нативного  YgjG,  определенная  с  помощью  гельфильтрации  на колонке  Сефакрил  S-300,  составила  что  свидетельствует  о тетрамерной  структуре  белка в растворе при нейтральном рН .

3 2.  Характеристика  субстратной  специфичности  и  основных  физических  и кинетических параметров препаратов Ht-YgjG и YgjG С  целью  определения  влияния  N-концевой  гексагистидиновой  последовательности на  биологическую  активность  нативного  белка  YgjG  мы  сочли  интересным  провести параллельное  исследование  субстратной  специфичности,  основных  физических  и кинетических  параметров  как  нативного  белка  YgjG так  и  его  производного - Ht-YgjG .

Определение  субстратной  специфичности  очищенных  препаратов  Ht-YgjG  и  YgjG проводили,  используя  в  качестве  доноров  аминогрупп  следующие  соединения  с дистальными  аминогруппами:  путресцин,  кадаверин,  спермидин,  спермин,  агматин,  Lорнитин,  ацетилорнитин,  GABA,  DAP,  Р-аланин,  а  также  основные  L-аминокислоты.  В качестве  возможных  акцепторов  были  проверены фенилпируват, Было  показано,  что  оба  фермента  проявляют  схожую  субстратную  специфичность (Таблица  3).  Для  обоих  ферментов  максимальные  значения  активности  достигались  при использовании  в  качестве  акцептора  аминогрупп  -  а  в  качестве  доноров аминогрупп  -  путресцина  (100%)  или  кадаверина  (95-97%).  Полученный  результат показывает,  что  YgjG,  также  как  и  ПАТаза,  выделенная  Kim  [Kim,  1964]  из  мутантного штамма  E.coli,  является  диамин  аминотрансферазой.  Гораздо  менее  эффективно  в качестве  донора  аминогрупп  препараты  YgjG  и  Ht-YgjG  используют  спермидин  (27Практически  не  активны  в  качестве  доноров  L-аланин,  агматин  и  L-орнитин  (1Ферментативная  активность  не  обнаруживалась  в  присутствии  таких  полиаминов как  спермин  и  DAP.  GABA;  ацетилорнитин  и  орнитин  также  не  активны  в реакциях,  катализируемых  YgjG  и  Ht-YgjG .

Следует  отметить,  что  YgjG  также  достаточно  эффективно  катализировал  перенос аминогруппы  глутамата  на  пируват,  проявляя  тем  самым  глутамат:пируват аминотрансферазную  (GPT)  активность.  GPT активность препарата Ht-YgjG значительно ниже.  Ни  одна  из  известных  к  настоящему  времени  аминотрансфераз  III  группы  не проявляет  GPT  активности,  хотя  присутствие  вРТазы  (КФ  2.6.1.2),  способной катализировать  синтез  L-аланина  в  грубых  экстрактах  клеток  Exoli,  ранее  было обнаружено  [Reitzer,  1996].  Фрагмент  ДНК,  который,  как  полагали,  содержит  ген  aJaB, кодирующий GPTa3y, был клонирован на мультикопийном векторе  [Wang,  1987].  Однако приведенные  в  работе  данные  рестрикционного  анализа  клонированного  фрагмента [Wang,  1987]  не  совпадают  с  рестриктной  картой  гена ygjG,  что  свидетельствует  о  том, что  авторами  был  клонирован  отличающийся  от нашего  фрагмент  хромосомы  Exoli .

Таблица  3.  Субстратная  специфичность  очищенных  препаратов  Ht-YgjG  и  YgjG  • с различными донорами и акцепторами аминогрупп .

Способность  кетокислот  выступать  в  качестве  акцепторов  аминогрупп исследовали  с  использованием  путресцина  в  качестве  донора  аминогрупп.  Было показано,  что  YgjG  и  Ht-YgjG  осуществляют  перенос  аминогруппы  на  пируват  и кетобутират.  Однако,  эффективность  этого  процесса  существенно  ниже,  чем  в  случае КГ.  Такие  кетокислоты,  как  фенилпируват,  а-кетоизовалериат,  и были полностью инертны в качестве акцепторов .

Сравнение  основных  физических  параметров  препаратов  YgjG  и  Ht-YgjG  (Рис.  9) показало,  что  оба  белка  активны  в  диапазоне  щелочных  значений  рН  и  проявляют максимальную  активность  при  активность  препаратов  значительно снижается  (в  5  -  6  раз).  Эти  результаты  достаточно  хорошо  согласуются  с  данными  Kim [Kim,  1964],  полученными  для  препарата  ПАТазы,  выделенного  из  мутантного  по утилизации  путресцина  штамма  Exoli  В  (способного  использовать  путресцин  в  качестве единственного  источника  азота  и  углерода).  Однако  согласно  другим  данным,  оптимум активности  препарата  ПАТазы,  выделенного  из  мутантного  по  утилизации  GABA  и путресцина  штамма  E.coli  К-12,  наблюдался  при  рН  7.2  [Prieto-Santos  et  al.,  1986] .

Возможно,  это  несоответствие  вызвано  существованием  отличного  от  YgjG  фермента, также катализирующего ПАТ реакцию с максимальной активностью при рН 7.2 .

Изучение  температурных  зависимостей  ПАТ  активностей  очищенных  препаратов YgjG  и  Ht-YgjG  показало,  что  максимум  активности  для  Ht-YgjG  наблюдается  при  60  °С, а  для  YgjG  -  при  70  °С  (Рис.  9,Б).  При  физиологических  значениях  температур  (в диапазоне  20  -  40°С)  удельные  активности  обоих  препаратов  практически  совпадали .

При  высоких  температурах,  80  -  90°С,  активности  препаратов  снижаются  (до  30-40%  от максимальной).  Также  было  показано,  что  падение  активности  рекомбинантного препарата  Ht-YgjG  за  50  мин.  инкубации  при  80  *С  составляет  16%,  а  для  препарата нативного  белка  —  только  5%,  что  свидетельствует  о  достаточно  высокой термостабильности  изучаемых  препаратов.  При  этом  препарат  YgjG  более  стабилен  при высоких  температурах,  чем  Ht-YgjG,  содержащий  N-концевую  гексагистидиновую последовательность .

–  –  –

Для  определения  кинетических  параметров  ПАТ  реакции,  протекающей  по механизму  с  замещением  фермента  ("пинг-понг-би-би"  механизм)  были. исследованы зависимости  начальных  скоростей  реакции  от  концентрации  одного  из  субстратов  при насыщающей  концентрации  второго  субстрата  [Корниш-Боуден,  1979].  Для  каждой  из исследованных  пар  сопряженных  субстратов  с  помощью  регрессионного  анализа экспериментальных  данных  определялись,  кажущиеся  значения  параметров  и После  чего,  на  основе  известных  теоретических  зависимостей  [Корниш-Боуден, 1979],  рассчитывались  значения  максимальной  начальной  скорости  реакции  и констант  Михаэлиса  для  соответствующих  субстратов .

  Значения  каталитической константы  (числа  оборотов  фермента)  были  определены  на  основании  расчетных значений  и  белка.  Полученные  кинетические  параметры ПАТ  реакции,  катализируемой  препаратами  YgjG  и  Ht-YgjG  представлены  в  Таблице  4 .

Для нативного  белка дополнительно  были  определены кинетические  параметры реакции трансаминирования кадаверина и спермидина .

Таблица 4. Основные кинетические параметры* Ht-YgjG и YgjG .

Анализ значений  для  трех  основных  доноров  YgjG  -  путресцина,  кадаверина и  спермидина,  показывает,  что  путресцин  является  наиболее  предпочтительным субстратом,  и  свидетельствует  о  том,  что  белок  действительно  является  путресцин:

аминотраисферазой.  Кадаверин  также  может  служить  донором  аминогрупп,  хотя сродство  YgjG  к этому  субстрату в  три раза ниже,  чем  к  путресцину,  а отношение в четыре раза ниже. Для  спермидина соответствующие параметры  на порядок ниже .

Сравнение  кинетических  параметров  YgjG  и  Ht-YgjG,  показывает,  что  хотя значения  для  них  достаточно  близки,  сродство  к  субстратам  у  YgjG  примерно  в  два раза выше. При этом, значения  для  путресцина  также  отличаются  в  два раза,  а  для практически  совпадают.  На  основании  приведенных  данных  можно  заключить,  что наличие  дополнительного  N-концевого  пептида  в  Ht-YgjG,  не  сильно  сказываясь  на физических  свойствах  белка,  изменяет  его  кинетические  параметры  по  сравнению  с YgjG.  Выше  мы  отмечали,  что  элиминация  первых  30  N-концевых  аминокислот практически  инактивируст  фермент (см.  Раздел  2.4).  Следовательно,  N-концевая  область YgjG  существенна для  его  ферментативной  активности .

Определенные  значения  кинетических  параметров  препарата YgjG могут  показаться достаточно  высокими,  однако  известно  что  для  многих ферментов,  принадлежащих  к  подгруппе  III  PLP-зависимых  аминотрансфераз,  значения характеризуются  как  микромолярными,  так  и  миллимолярными  величинами (например  -  2,5  мМ  для  и  0,48  мМ  для  ацетилорнитина  в  случае  ацетилорнитинАТазы  Е.coli) .

4.  Влияние аллельного состояния гена  на утилизацию путресцина Согласно  литературным  данным  большинство  штаммов  Rcoli,  в  том  числе  и широко  используемый  лабораторный  штамм  Rcoli  К12  MG1655  [Tabor  et  al,  1985;

Tkachenko  et  al,  1996],  не  способны  использовать  путресцин  в  качестве  альтернативного источника  азота.  При  изучении  путей  деградации  путресцина  в  E.coli,  как  правило, использовались  мутантные  штаммы,  утилизирующие  путресцин  [Dover  et  al,  1972;

Snaibe  et  al,  1985].  Нами  был  получен  штамм  MG1655  способный  расти  на путресцине  в  качестве  единственного  источника  азота  (Рис.1 ОД)  и  стабильно наследующий  этот фенотип.  Мутация  была  картирована  в районе  80  мин хромосомы при  помощи  in  vivo  клонирования  фрагментов  хромосомальной  ДНК  на  фагмиде [Groismanetal,  1986] .

С  целью  изучения  влияния  аллельного  состояния  гена  ygjG  на  фенотип  клеток Rcoli  мы  инактивировали  ygjG  на  хромосоме  штамма  путем  замены нативного  аллеля  ygj'G  на  ПЦР  фрагмент,  содержащий  ген  cat  антибиотической устойчивости  к  хлорамфениколу  при  помощи  Red  рекомбиназы  фага  [Datsenko  et  al, 2000].  Таким  образом,  был  получен  штамм  MG1655  ygjG.  Делеция  ygj'G  не  является летальной  для  клеток,  что  соответствует  литературным  данным  [Schneider  et  al,  2002] .

Анализ  кривых  роста  штаммов  MG165 5  ygjGnMG1655  на  безазотной  среде  М9 с  путресцином  показал  (Рис. 10,А),  что  элиминация  ygjG  приводит  к  неспособности штамма утилизировать  путресцин .

Рис 10.  Кривые  роста  штаммов  Kcoli  на  среде  с  путресцином  в  качестве единственного источника азота Влияние  амплификации  гена ygj'G  на  способность  Е coli  утилизировать  путресцин определяли  на  примере  штамма  трансформированного  плазмидой Наличие  природной  регуляторной  области  перед  геном  ygjG  в  составе плазмиды  pUC18-ygjG,  обеспечивало  индукцию  экспрессии  ygj'G  в  условиях  азотного голодания  (см.  Раздел  1),  в  результате  чего  полученный  штамм  приобрел  способность утилизировать  путресцин  (Рис.10,Б).  Однако  рост  штамма  ygjG  [pUC18ygjG]  на  безазотной  среде  М9,  содержащей  путресцин  в  качестве  единственного источника  азота,  был  очень  медленным  (время  удвоения  около  36  ч).  Трансформация исходного  штамма  плазмидой  pUC18-ygjG  также  привела  к  увеличению времени  удвоения  штамма  на  среде  с  путресцином  с  4,5  ч.  до  29  ч.  При  этом  время удвоения  трансформированного  контрольной  плазмидой  pUC18,  попрежнему,  составляло  4,5  ч,  что  свидетельствует  об  ингибирующем  эффекте  от  введения мультикопийной  плазмиды  pUC18-ygjG,  вызванном,  по-видимому,  высокой  дозой  гена ygjG  и,  как  следствие,  синтезом  значительного  количества  продукта  переаминирования путресцина -  который,  как  известно,  токсичен  для  клеток  Kcoli  [Cooper  et a l,  1980] .

Таким  образом,  на  основании  описанных  выше  результатов  элиминации  и амплификации ygjG,  можно  заключить,  что  кодируемый  этим  геном  фермент  -  ПАТаза «отвечает»  в  клетках  Ecoli  за  утилизацию  путресцина  в  качестве  альтернативного источника азота .

5.  Поиск  гомологов  белка  YgjG Изучение  основных  кинетических  параметров  YgjG  подтвердило  (см.  Раздел  3.2), что  фермент  является  ПАТазой,  катализируя  путресцин:а-КГ  аминотрансферазную реакцию.  Согласно  литературным  данным,  в  настоящее  время  обнаружена  единственная ПАТаза,  также  использующая  а-КГ  в  качестве  акцептора  -  ПАТаза  Klebsiella pneumoniae [Friedrich  et al.,  1979].  Однако  ни  аминокислотная  последовательность,  ни кинетические параметры  этого  фермента  не  охарактеризованы.  Другие  известные  полиамин аминотрансферазы  Pseudomonas  aeruginosa  [Lu  et  al.,  2002]  и  Arthrobacter  sp.  TMP-1 [Yorifuji  et  al.,  1997]  используют  в  качестве  акцептора  пиру ват.  Единственной  путресцин аминотрансферазой с секвенированной в настоящее время последовательностью является фермент  из  Pseudomonas  aeruginosa,  кодируемый  геном  spuC.  Однако,  несмотря  на схожую  ферментативную  активность,  число  идентичных  аминокислотных  остатков  и консервативных  замен  в  аминокислотных  последовательностях  SpuC  (PA0299)  и  YgjG составляет только 27 % и 43  %,  соответственно .

При  проведении  анализа  генома  Kcoli  K12  [Blattner  et  al,  1997]  были  выявлены шесть  белков  гомологичных  YgjG .

  Это  ферменты,  принадлежащие  группе  III  АТаз  с изученными каталитическими активностями, что позволяет с высокой долей вероятности утверждать,  что  YgjG  -  единственная  ПАТаза  в  геноме  Kcoli.  Паралогами  YgjG являются  АсОАТазы,  кодируемые  генами  argD  (gi| 1789759)  и  cstC  (gi| 1788044), GABAATa3bi, кодируемые goaG  (gi|1787560) и gabT (gi\ 1789016),  ОАРАТаза (gi|1786991) и  глутамат-1 -полуальдегид  АТаза  (gi| 1786349).  Число  идентичных  аминокислотных остатков  и  консервативных  замен  в  аминокислотных  последовательностях  этих  белков составляет  -  36/54%,  34/49%,  34/53%,  34/52%,  33/51%  и  29/47%,  соответственно,  что характерно  для  АТаз .

Среда  ортологов  YgjG  с  установленными  каталитическими  активностями максимальной  гомологией  обладает  ОАТаза  Bacillus  subtilis  RocD  (gi| 16081086).  Число идентичных  аминокислотных  остатков  и  консервативных  замен  в  аминотрансферазах YgjG  и  RocD  составляет соответственно  33  и  56%.  Существенной гомологией  с ПАТазой Exoli  обладают  также  OAT  (gi|11968102)  AcOAT  (gi|6324432) Rattus  norvegicus,  Saccharomyces  cerevisiae,  OAT  (gi|3319072)  Human,  OAT  (gi|23485730)  Plasmodium yoelii, DAPAT  (gi|2340815,  32/51)  Acinetobacter  baumannii  и  последовательности  АТаз  1П  группы из  других  организмов.  Множественное  выравнивание  гомологичных  YgjG  полипептидов выявило  в  составе  YgjG  наличие  консервативных  последовательностей  (Рис.  11)  и позволило  локализовать  четыре  инвариантных  аминокислотных  остатка  (Gly-245,  AspLys-ЗОО  и  Arg-426),  отвечающих  за  связывание  с  субстратами  и  коферментом  PLP .

Интересно,  что  YgjG  обладает  наиболее  протяженной  N-концевой  последовательностью, что,  по  нашему  мнению,  также  свидетельствует  о  существенной  роли  N-концевой структуры для  каталитической  активности этого  фермента .

Представляется  целесообразным  выделить  в  геномах  других  штаммов  E.coli  и родственных  микроорганизмов  гипотетические  последовательности,  имеющие  около  94идентичных  а.к.о.  с  YgjG.  Это  496  а.к.о.  последовательности,  кодируемые одноименными  генами  ygjG  -  (gi|15803614)  и  (gi|26249659)  штаммов  Exoli  0157:117 EDL933  и  CFT073,  соответственно.  Три  429  а.к.о.  последовательности:  Salmonella enterica  serovar  Typhi  СП 8  STY3396  (gi| 16504294),  Salmonella  typhimurium  LT2  oat (gi|16421775)  и  YgjG  (gi|30064418)  штамма  Shigella  flexneri  2a  str.2457T.  А  также последовательность  размером  496  а.к.о.,  кодируемая  геном  ygjG  (gi|24114370)  другого штамма Shigella  flexneri  2a -  str.301. По-видимому, для  этих  последовательностей,  как  и  в случае  исследованной  нами  ПАТазы  Exoli  К12,  имеет  место  ошибочная  локализация ORF  и  истинной  каталитически  активной  рамкой  в  каждом  случае  является  полипептид размером  459  а.к.о.,  обладающий  ПАТ  активностью.  В  составе  геномов  не  родственных Exoli  организмов  также  были  обнаружены  гомологичные  YgjG  гипотетические последовательности,  что  свидетельствует  о  важной  роли  путресцин-аминотрансферазы  в клеточном  метаболизме  азота  и  обуславливает  целесообразность  более  подробного изучения этих  ферментов .

ВЫВОДЫ

1.  Клонирован  ген  ygjG  Kcoli  K12  MG1655  и  показано,  что  аннотированная  как орнитин  аминотрансфераза  ORF  ygj'G  кодирует  ПАТазу  -  белок,  обладающий путресцин:  аминотрансферазной  активностью  и  эффективно катализирующий  реакцию  переаминирования  кадаверина .

2.  Показано,  что  -зависимая  экспрессия  ygjG  индуцируется  в  условиях  азотного голодания.  Определен  старт  транскрипции  мРНК  ygjG  и  стартовый  кодон  (UUG) трансляции  YgjG .

3.  Сконструированы  рекомбинантные  плазмиды,  обеспечивающие  эффективную продукцию  YgjG  как  в  виде  слитого  с  лидером  полипептида  (Ht-YgjG)  так  и  в виде  нативного  белка.  Разработан  метод  выделения  и  очистки  нативного  белка  и получены  высокоочищенные  препараты  YgjG  и  Ht-YgjG .

4.  Исследованы  субстратная  специфичность  обоих  белков  и  их  основные кинетические  параметры  в  реакциях  трансаминирования  с  использованием  путресцина, кадаверина  и  спермидина  в  качестве  доноров  и  в  качестве  акцептора аминогрупп.  Определены  рН  и  температурная  зависимости  ферментативной  активности ПАТазы  YgjG .

Результаты диссертации изложены в следующих публикациях:

Samsonova  N.N.,  Smirnov  S.V.,  Altman  I.B.,  Ptitsyn  L.R.  «Molecular  cloning  and 1.  characterization of Escherichia coli K12ygjG gene» //BMC Microbiology, 3:2, (2003) .

2.  Samsonova  N.N.,  Smirnov  S.V.,  Altman  I.B.,  Ptitsyn  L.R.  «Characterization  of Escherichia  coli  YgjG  protein  as  putrescine:2-oxoglutarate  aminotransferase  with  broad substrate specificities» //FEMS  Letters,  v.  222(S),  p.346,  (2003) .

3.  Самсонова Н.Н., Смирнов С В., Альтман И.Б., Птицын Л.Р. «Идентификация гена Escherichia  coli  К12,  кодирующего  путресцин  аминотрансферазу»  //XV  зимняя международная  молодежная  научная  школа  «Перспективные  направления  физикохимической  биологии  и  биотехнологии».  Тез.  докл.  и  стенд,  сообщений,  с.31,  Москва, (2003) .

4.  Самсонова Н.Н., Смирнов С В., Альтман И.Б., Птицын Л.Р. «Идентификация гена Escherichia  coli  K12,  кодирующего  путресцин  аминотрансферазу»  //Научная  сессии МИФИ-2003. Сборник научных трудов, том 5, с.32-33, Москва, (2003) .

5.  Самсонова  Н.Н.,  Смирнов  СВ.,  Альтман  И.Б.,  Птицын  Л.Р.  «Изучение  регуляции транскрипции  и  функциональная  характеристика  продукта  трансляции  гена ygjG  Exoli  К12»

//6-я Путинская школа конференция молодых ученых. Тез. докл., с.315, Москва, (2002) .

Принято к исполнению 26/04/2004  Заказ №  160 Исполнено 27/04/2004  Тираж: 100 экз .

–  –  –