«Самсонова Наталья Николаевна Клонирование и функциональная характеристика гена ygjG из Escherichia oli 12. cK ...»
На правах рукописи
Самсонова Наталья Николаевна
Клонирование и функциональная характеристика гена ygjG из
Escherichia oli 12 .
cK
03.00.03 - Молекулярная биология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Москва, 2004 г .
Работа выполнена в лаборатории №2 Научно-исследовательского института
Аджиномото-Генетика (ЗАО "АГРИ") .
кандидат химических наук Научный руководитель: Л. Р. Птнцын Официальные оппоненты: доктор биологических наук А. С. Миронов кандидат биологических наук Л. В. Генинг Центр биоинженерии РАН
Ведущая организация:
2004 г. в 1400 часов на заседании Диссертационного Защита состоится совета Д217.013.01 при ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов» по адресу: 11754S, г.Москва, 1-й Дорожный проезд, д.1 .
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУП «Государственный научноисследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов»
Автореферат разослан апреля 2004 г Ученый секретарь Диссертационного Совета кандидат биологических наук В.И.Щербакова
-1ВВЕДЕНИЕ Актуальность проблемы .
Полиамины присутствуют практически во всех видах биологических организмов, от бактерий и вирусов до человека, и участвуют в огромном количестве разнообразных биологических и биохимических реакций, включая синтез ДНК, РНК и белков [Abraham, 1968; Frydman et al., 1992]. Исследование клеток прокариот и эукариот показало, что в различных организмах не только функционируют одинаковые соединения полиаминов (чаще всего это путресцин, спермидин, спермин и, существенно реже, кадаверин), но также универсальны и многие этапы биосинтеза этих поликатионов [Tabor et al., 1985;
Pegg, 1986]. Хотя не вызывает сомнений тот факт, что полиамины выполняют важные физиологические функции и совершенно необходимы для обеспечения нормального клеточного роста, было показано, что избыточное накопление полиаминов в клетке ингибирует синтез белков, вызывает замедление роста, а в некоторых случаях приводит к гибели организма [Не et al., 1993]. Ацетилирование полиаминов по так называемому ацетилазному пути деградации, помогает предотвратить эффект токсичности полиаминов как в про-, так и в эукариотах [Matsui et al., 1982]. Образующиеся при этом ацетилпроизводные полиаминов далее окисляются полиаминооксидазами, деацетилируются, либо экскретируются из клетки [Ignatenko et al., 1996]. У некоторых микроорганизмов охарактеризован также альтернативный аминотрансферазный путь деградации полиаминов .
Наиболее подробно изучен аминотрансферазный путь деградации путресцина в клетках Escherichia coli. Показано, что трансаминирование путресцина, катализируемое путресцин аминотрансферазой (КФ 2.6.1.29), и последующее декарбоксилирование образующегося аминобутиральдегида приводят к образованию (GABA), который в дальнейшем преобразуется в сукцинат, включаясь в цикл Кребса [Snaibe et al., 1985]. Совокупность реакций биосинтеза путресцина из аргинина и его деградации до сукцината образуют так называемый аргинин декарбоксилазный путь деградации аргинина (ADC) Ecoli. Было показано, что все ферменты ADC пути, за исключением аргинин декарбоксилазы, индуцируются в условиях азотного голодания [Snaibe et al .
Вследствие того, что уровень активности ПАТазы даже в индуцирующих условиях азотного голодания чрезвычайно низкий, изучение этого фермента до сих пор проводилось только в мутантных по утилизации полиаминов и GABA штаммах Ecoli .
Возможно, по этой причине в независимо выполненных работах Kim [Kim, 1964] и В этой связи актуальной является задача идентификации гена E.coli, кодирующего ПАТазу, с использованием методов биоинформатики и генетической инженерии, выделение нативного фермента и изучение его свойств современными методами молекулярной биологии .
Цель и задачи работы .
Целью представленной работы являлась идентификация гена Kcoli, кодирующего ПАТазу, конструирование плазмид, обеспечивающих достаточно высокий уровень продукции фермента, а также определение основных физических и кинетических параметров очищенного препарата ПАТазы .
В процессе работы были решены следующие задачи:
• Идентификация гена, кодирующего ПАТазу, в хромосоме штамма (ген • Изучение Ntr-зависимой регуляции экспрессии гена • Конструирование экспрессионных плазмид, обеспечивающих эффективную продукцию ПАТазы как в виде "слитого" белка с his6-tag лидерным пептидом (Ht-YgjG), так и нативного белка • Разработка лабораторного метода выделения белка YgjG из растворимой фракции клеточных лизатов рекомбинантного штамма Е.соН;
• Исследование и сравнительная характеристика каталитических активностей и некоторых основных физических и кинетических параметров очищенных препаратов Научная новизна и практическая значимость работы .
Впервые • идентифицирован и клонирован ген кодирующий путресцин аминотрансферазу в клетках Escherichia coli К12. Изучена его структурная организация и выявлены регуляторные последовательности, обеспечивающие - зависимую индукцию экспрессии в условиях азотного голодания .
Разработана методика получения высокоочищенного препарата каталитически активного белка из биомассы рекомбинантного штамма Е. coli .
Показано, что фермент эффективно катализирует путресцин:
аминотрансферазную реакцию, а также может использовать кадаверин и, с меньшей эффективностью, спермидин в качестве доноров аминогрупп. Фермент термостабилен, активен только в щелочном диапазоне значений рН и проявляет максимум активности при рН 9 .
Сравнение свойств очищенных препаратов YgjG и Ht-YgjG, несущего дополнительную his6-tag лидерную последовательность на N-конце белка, показало, что данная модификация • N-концевой последовательности влияет на субстратную специфичность и ферментативную активность препарата. Кроме того, элиминация первых 30 аминокислот YgjG приводит практически к полной потере активности фермента .
Полученные в работе данные могут быть использованы для исследования полиамин аминотрансфераз других микроорганизмов и для дальнейшего изучения путей метаболизма полиаминов в E.coli .
Апробация работы .
Результаты работы были представлены на Пущинской школе молодых ученых (Пущино, 15-19.05.02), на Научной сессии МИФИ-2003 (Москва, 12-16.01.03), на XV зимней международной молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 12-19.02.03), на первом FEMS конгрессе европейских микробиологов (1 s t FEMS Congress of European Microbiologists, Slovenia, Lubliana, 29.06-03.07.2003) .
Публикации. По результатам исследований опубликовано 5 печатных работ .
Структура и объем диссертации .
Диссертация состоит из Введения, Обзора литературы, Материалов и методов, Результатов и обсуждения, Выводов и Списка литературы .
Во Введении обоснована актуальность работы и сформулирована ее цель и практическая значимость. В Обзоре литературы рассмотрены современные представления об основных функциях полиаминов in vivo, описаны известные пути биосинтеза и катаболизма основных соединений полиаминов в микроорганизмах .
Приведены сведения о полиамин аминотрансферазах, известных к настоящему времени .
В разделе Результаты и обсуждение изложены результаты исследования структурной и функциональной организации гена ygj'G, приведены физические и кинетические параметры исследованного фермента. В разделе Материалы и методы приведены материалы и методики, а также оборудование, использованные при проведении работы .
Диссертация изложена на 109 страницах, содержит 24 рисунка, 12 таблиц и список цитированной литературы из 179 наименований .
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
1. Идентификация гена, кодирующего ПАТазу, в хромосоме штамма Kcoli K12 Исходя из принадлежности путресцина, содержащего дистальную аминогруппу в положении углеродной цепи, к классу субстратов для PLP-зависимых аминотрансфераз (АТаз) III группы [Mehta et al., 1993] и литературных данных о Ntr-зависимой экспрессии НАТазы Exoli [Snaibe et al., 1985] был осуществлен поиск гипотетических открытых рамок считывания (ORF) Exoli: а) обладающих существенной гомологией с консенсусной последовательностью аминотрансфераз III групп PF00202, б) экспрессия которых индуцируется в условиях азотного голодания. Проведенный нами анализ банка данных аминокислотных последовательностей E.coli K12 [Blattner et al., 1997] выявил единственную последовательность, удовлетворяющую обоим критериям — последовательность YgjG (SWISS-PROT Database accession number размером 496 аминокислотных остатков (а.к.о.), аннотированную как предполагаемая (putative) орнитин аминотрансфераза (ОАТаза, КФ 2.6.1.13). Найденная последовательность обладает существенной гомологией и высокой степенью схожести с консенсусной последовательностью трансаминаз III группы, а индукция соответствующей мРНК в условиях азотного голодания, согласно данным DNA-array [Zimmer et al., 2000], составляет от 3 до 5 раз. На основании полученных результатов нами было предположено, что YgjG может обладать ПАТ активностью .Кодирующая YgjG последовательность гена GenBank accession number gi| 1789454), размером 1491 п.н. расположена на 69,35 минуте хромосомы Ecoli ниже аег гена (Рис. 1). Для установления типа ферментативной активности полипептида YgjG и проверки данных о Ntr-зависимой индукции, 1791-п.н. фрагмент, включающий последовательности ygjG и aer-ygjG межгенную область, был получен ПЦРамплификацией соответствующего района хромосомы штамма Escherichia coli K12 MG1655 с использованием олигонуклеотидов 5'TTGGATCCGATTAATTTGATTTAGATCGCA-3' и 5'-TTCTGCAGCCTGCGGGCGTACGC GTCG -3' в качестве праймеров (Рис. 1). В результате амплификации фрагмент был фланкирован сайтами для рестриктаз ВатШ и Pstl. Полученный ВатШ-Psil фрагмент был клонирован под контролем промотора Pucuvs в составе мультикопийного вектора pUC18 и нуклеотидная последовательность вставки в полученной плазмиде pUC18-ygjG была секвенирована для подтверждения правильной структуры фрагмента .
Клетки Ecoli TGI были трансформированы плазмидой pUC18-ygjG и плазмидой pUC18, использовавшейся в качестве контроля. Для индукции биосинтеза полипептида YgjG штаммы культивировали в следующих условиях: а) на богатой LB среде (индукция 1 мМ изопропилтиогалактозидом (IPTG), 2 ч); б) на минимальной среде М9, содержащей пролин вместо аммония в качестве единственного источника азота (в условиях азотного голодания). Тестирование аминотрансферазной активности в клеточных лизатах проводили, используя в качестве доноров аминогрупп следующие соединения с дистальными аминогруппами: путресцин, орнитин, ацетилорнитин (АсО), GABA, диаминопропан (DAP) и некоторые аминокислоты .
Таким образом, на данном этапе нашей работы было установлено, что амплификация 1,8-т.п.н. фрагмента, содержащего последовательность ygjG, в составе мультикопийной плазмиды действительно приводит к появлению специфической ПАТазной активности, которая индуцируется при выращивании клеток в условиях лимитации по неорганическому азоту. В связи с чем, было признано целесообразным дальнейшее изучение и проведение подробного анализа нуклеотидной последовательности клонированного 1,8-т.п.н. фрагмента, содержащего последовательность гена ПАТазы -ygjG (pat) .
2. Функциональное изучение структурной организации 1,8-т.п.н. фрагмента, содержащего регуляторную область и последовательность гена ПА Тазы 2.1. Анализ нуклеотидной последовательности ygjG и aer-ygjG межцистронного района Как результат компьютерного анализа нуклеотидной последовательности ygjG и aer-ygjG межцистронного района в базе данных NCBI (National Center for Biotechnology Information) приведены две предполагаемые промоторные последовательности специфичные для субъединиц ДНК-зависимой РНК-полимеразы Kcoli, соответственно, а также сайт связывания регуляторного белка FIS (Рис. 2). Следует отметить, что если промотор локализован в регуляторной области гена, то промотор - в 5' кодирующей последовательности ygjG. В соответствии с этим данными были аннотированы две рамки считывания для потенциального продукта трансляции мРНК (Рис. 1, 2). Первая из них, описанная выше как ygjG, кодирует полипептид размером 496 а.к.о., биосинтез которого возможен только в случае инициации транскрипции соответствующей мРНК с промотора .
Нуклетотидная последовательность ygjG будет обозначаться ниже как orf. Инициация транскрипции другой рамки - одноименного гена (gi|1171884) размером 1290 п.н .
(обозначенной нами как оrf1), кодирующей полипептид размером 429 а.к.о. (Р42588), возможна с любого из промоторов. Обе рамки имеют классический стартовый кодон AUG .
Проведенный нами дополнительный анализ нуклеотидной последовательности района, расположенного слева от предполагаемой последовательности [Reitzer et al., 2001], выявил потенциальный сайт связывания регуляторного белка IHF и два сайта связывания белка-регулятора Ntr-ответа NRI, участие которых, как известно, необходимо для обеспечения инициации транскрипции РНК полимеразой Exoli в условиях азотного голодания [Magasanik, 1996]. Нуклеотидные последовательности предполагаемых промоторных последовательностей, а также сайты связывания регуляторных белков и соответствующие им консенсусные последовательности указаны на Рис.2. Также при анализе нуклеотидной последовательности, расположенной справа от была выявлена еще одна возможная рамка считывания, обозначенная нами как оrf2 (Рис.2). Эта рамка кодирует полипептид размером 459 а.к.о., экспрессия которого возможна при инициации транскрипции с каждого из промоторов. Трансляция orf2 должна инициироваться с редко используемого стартового кодона UUG, что, как правило отражает механизм регуляции скорости биосинтеза белка на трансляционном уровне [Parsons et al, 1988] .
Рамки считывания orfl и orf2 имеют легко узнаваемые потенциальные SD (ShineDalgamo) последовательности (Рис. 2), расположенные на функционально значимом расстоянии (5-13 оснований) от инициирующего кодона [Makrides, 1996], однако, теоретически каждая из трех рамок считывания может транслироваться in vivo .
Рис. 2. Нуклеотидная последовательность 5'-концевой . области ygjG и aer-ygjG межгеипой области .
Нумерация нуклеотидов приведена относительно положения " + 1 " старта мРНК выделенного курсивом (см. Раздел 2.3 и Рис.4). Анонсированные последовательности «и «-35» предполагаемого промотора выделены рамкой, а возможный сайт связывания FIS подчеркнут сверху. Сайты рестриктаз подчеркнуты волнистой линией .
Последовательности промотора и предполагаемых сайтов связывания и IHF выделены жирным шрифтом, выше приведены соответствующие консенсусные последовательности. SD последовательности подчеркнуты сверху. Три вероятных стартовых кодона трансляции рамок ygjG iprf), orfl и or/2 выделены жирным шрифтом .
Изучение регуляции экспрессии гена ПАТазы.22.
Для экспериментальной проверки функциональности промоторов были сконструированы три «гибридные» экспрессионные кассеты, в которых различные участки фрагмента ВатHI-AccIII (Рис. 1) регуляторной области гена ПАТазы, были слиты со структурной частью гена-репортера lacZ (Рис 3). При этом в разных конструкциях эффективность экспрессии гена определялась: а) в случае кассеты I, содержащей полноразмерный фрагмент регуляторной области ПАТазы ВатHIАссIII, - силой обоих промоторов; б) в случае кассеты II (фрагмент BgR-АссIII) - только активностью промотора в) в случае кассеты III (фрагмент ВатHI-BglI) - только активностью промотора Экспрессионные кассеты были клонированы в составе плазмиды pBRP [Ptitsyn et al .
Клетки Kcoli TG1 были трансформированы полученными плазмидами .
Рекомбинантные штаммы культивировались в различных (по содержанию азота) условиях роста: на богатой LB среде, на минимальной среде М9 и в описанных выше условиях азотного голодания .
Измерение активности р-галактозидазы в лизатах штаммов проводили по стандартной методике [МШег, 1972]. Во всех четырех штаммах при росте на богатой среде LB, а также в штамме, несущем плазмиду pBR-lacZ-З и контрольную плазмиду при росте во всех трех средах, уровень экспрессии был чрезвычайно низок (порядка 200 единиц Миллера) (Таблица 1), что свидетельствовало, во-первых, о практически полном отсутствии экспрессии гена ПАТазы при росте на богатой среде, и, во-вторых, об отсутствии промоторных последовательностей в 287-п.н .
фрагменте BamW-BgR .
В штамме, несущем плазмиду уровень экспрессии lacZ на стандартной среде М9, а также в условиях азотного голодания, был в 3 — 6 раз выше, чем в штамме с что соответствует данным литературы о чрезвычайно низком уровне транскрипции с промоторов при отсутствии NRI энхапсера [Magasanik, 1996]. Pla основании этих результатов нами был сделан вывод о том, что 56п.н. фрагмент действительно содержит последовательность промотора, который является основным для экспрессии ПАТазы .
Рост штамма на бедных средах, особенно в условиях азотного голодания, сопровождался существенным возрастанием активности Р-галактозидазы. По сравнению со штаммом уровень экспрессии lacZ в lacZ-1) увеличился в 9 раз на М9 среде и в 28 раз на безазотной среде с пролином. В случае использования в качестве альтернативного источника азота других аминокислот — аланина, орнитина или аргинина, увеличение активности в этих штаммах в условиях азотного голодания составило 22,5 раза, если в качестве альтернативного источника азота использовался аргинин или орнитин, и 19,5 раза в случае использования аланина. Следовательно, ВатHI-Bgli фрагмент чрезвычайно важен для экспрессии гена ПАТазы в условиях роста на М9 и в условиях азотного голодания, что обусловлено, по-нашему мнению, наличием в составе этого фрагмента сайтов связывания NRI и, возможно, IHF сайта. Учитывая не характерное для Ntr-зависимой регуляции расположение IHF левее сайтов NRI, нельзя исключать вероятность того, что IHF участвует не в регуляции гена ПАТазы, а в регуляции соседнего противоположно ориентированного гена aer [Rebbapragada ct al., 1997] .
Таким образом, результаты данных экспериментов позволяют сделать вывод о том, что транскрипция мРНК гена ПАТазы инициируется только промотором при росте штаммов на минимальной среде М9, достигая максимума в условиях азотного голодания, и строго репрессируется на богатой LB среде .
2.3. Определение старта инициации транскрипции гена ПАТазы Для подтверждения функциональности промотора было проведено определение положения старта транскрипции мРНК ПАТазы. Для этих экспериментов были выделены препараты мРНК штамма выращенного на всех трех средах (описанных в Разделе 2.2). В качестве контроля использовали препарат мРНК штамм TGl(pUC18). Реакции синтеза кДНК проводили, используя радиоактивно меченый олигонуклеотид комплементарный последовательности «+88» - «+115» относительно 3'-фланкирующего нуклеотида промотора, выделенные препараты мРНК и рекомбинантную обратную транскриптазу Omniscnpt (Qiagen). Синтезированные фрагменты кДНК анализировали в 6% ПААГ, визуализацию и количественную оценку радиоактивных сигналов проводили с использованием мультифункционального сканера Typhoon 9210 (Amersham-Pharmacia) и программы ImageQuant (V 5 0). Анализ данных (Рис. 4) позволил идентифицировать в качестве возможного первого основания мРНК — гуанозин (G), локализованный на расстоянии 10 нуклеотидов относительно 3'-фланкирующего нуклеотида промотора .
Соответствующий кДНК транскрипт детектировался только для препаратов РНК, полученных из клеток, выращенных на стандартной М9 среде и в условиях азотного голодания, причем количественное соотношение транскриптов в этих препаратах составило 1:4, соответственно .
Таким образом, полученные результаты подтверждают факт инициации транскрипции мРНК только с промотора, что соответствует результатам эксперимента с использованием гена-репортера lacZ (Таблица 1) и результатам измерения активности ПАТазы в клетках штамма TGl(pUC18-ygjG) при различных условиях выращивания (см. Раздел 1) Следует также отметить, что наши эксперименты показывают некорректность анонсирования ORF ygjG (gl789454, Ь3073) как гена размером 1491 п н, кодирующего полипептид размером 496 а к.о. (SWISS-PROT Database, Q8XAN1). Анонсированный для этой ORF промотор также не функционирует при выращивании клеток ни на богатой LB среде, ни на минимальной среде М9, ни в условиях азотного голодания .
2.4. Анализ продуктов трансляции orfl и ог/2 Как уже было отмечено выше, установление факта инициации транскрипции гена ygjG с промотора ограничивает выбор ORF, кодирующей активную ПАТазу только двумя альтернативными вариантами - orfl или orfl .
Рис. 5. Структура регуляторных областей экспрессионных плазмид pET15b-Ht-ORFl и pET15b-Ht-ORF2 .
Показаны основные структурные элементы экспрессионной кассеты вектора поздний фаговый промотор фага Т7 (Т7), участок связывания рибосом гена 10 фага Т7 лидерпый пептид Приведена первичная структура ДНК областей сопряжения трансляционных рамок orfl и orfl и лидерного пептида а также Nконцевые аминокислотные последовательности белков Ht-ORFl и Ht-ORF2 .
Клетки BL21(DE3) трансформировали полученными плазмидами pET15b-Ht-ORFl, pET15b-Ht-ORF2 и контрольной плазмидой рЕТ15Ь. Биосинтез целевых белков в рекомбинантных штаммах индуцировали добавлением 1 мМ IPTG и тестировали полученные лизаты штаммов на присутствие активности ПАТазы. ПАТ активность в штаммах составила 0,05 и 2,16 мкмоль В контрольном штамме BL21(DE3)[pET15b] ПАТ активность не детектировалась. Электорофоретический анализ белков из клеточных лизатов штаммов показал, что спустя два часа после индукции синтеза слитых белков их удельное содержание в растворимой фракции клеточных белков составило 2,4 % для Ht-ORFl и 8,5 % для Ht-ORF2 соответственно (Рис.6) .
Для сравнения удельных активностей Ht-ORFl и Ht-ORF2 были получены очищенные препараты слитых белков. Наличие полигистидиновых последовательностей в N-концевой части гибридных белков Ht-ORFl и Ht-ORF2 позволило использовать для их эффективной очистки IMAC хроматографию (immobilized-metal-affinity chromatography). Выход полипептида Ht-ORF2 составил около 80%. Было получено 4,5 мг препарата, содержащего, по результатам сканирования SDS-электрофорезного геля, до 95% целевого белка (Рис. 6). Напротив, выход препарата Ht-ORFl составил менее 20%, что, по нашему мнению, было вызвано протеолитической деградацией рекомбинантного белка как на стадии его биосинтеза, так и в процессе его очистки .
Содержание целевого белка Ht-ORFl в полученном препарате по результатам сканирования SDS-электрофорезного геля (Рис. 6) не превышало 65%. Молекулярные массы выделенных полипептидов Ht-ORFl (48 kDа) и Ht-ORF2 (52 kDа) соответствовали сумме расчетных значений лидерного пептида - 2,1 Ша, соответственно .
Анализ ПАТ активности очищенных препаратов Ht-ORFl и Ht-ORF2, показал, что удельная активность Ht-ORF2 составляет 11,7 мкмоль в то время как активность Ht-ORFl - только 0,2 мкмоль По-видимому, элиминация первых 30 N-концевых аминокислот практически инактивирует фермент. Полученный результат функционального анализа продуктов трансляции Ht-ORFl и Ht-ORF2 свидетельствует о том, что оrf2 является истинной рамкой гена ygj'G, кодирующей биологически активный белок YgjG (ПАТазу) размером 459 а.к.о .
3. Характеристика каталитической активности YgjG (ПАТазы) E.colL Любые модификации аминокислотной последовательности белка могут оказывать влияние на его биологическую активность. Такое влияние, однако, проявляется не всегда, или может быть выражено слабо. Согласно результатам, полученным нами при функциональном анализе продуктов трансляции orfl и ог/2, N-концевая кодирующая последовательность ПАТазы имеет решающее значение в процессе формирования каталитически активного белка (факт интенсивного протеолиза Ht-ORFl также можно рассматривать как косвенное свидетельство в пользу этой гипотезы). Поэтому, чтобы охарактеризовать каталитическую активность YgjG, а также проверить соответствие синтезирующегося in vivo белка ПАТазы продукту трансляции orfl, мы сочли необходимым выделить нативный препарат YgjG .
3.1. Экспрессия и разработка метода выделения белка YgjG С этой целью нами была реализована схема экспрессии активной ПАТазы на мультикопийном плазмидном векторе, с заменой NtrC-регулируемого промотора на сильный промотор фага Т7. Для эффективной экспрессии YgjG фрагмент плазмиды pUC18-ygjG, первичная структура которого включала в себя последовательность orfl (a также и более короткую последовательность orfl) вместе с предполагаемым сайтом связывания рибосом, был ПЦР-амплифицирован с использованием праймеров ACTTCTAGACCTCCGGAGCATATTTTGAAC-3f и 5'TTCTGCAGCCTGCGGGCGTACGCGTCG-3' и клонирован в составе плазмидного вектора рЕТ22Ь(+) (Рис. 7). Анализ ПАТ активности в клеточном лизате штамма BL21(DE3) трансформированного полученной плазмидой pET22b-ORF2 показал, что спустя два часа после индукции синтеза ПАТазы ее активность составляла порядка 340 нмоль Разработанная нами процедура очистки YgjG из растворимой фракции тотального клеточного белка штамма BL21(DE3)[pET22b-ORF2] включала стадии фракционирования, в растворе- обогащения при высокотемпературной инкубации и три хроматографических стадии очистки (Таблица 2) .
Удельная ПАТ активностью очищенного препарата YgjG составила 14,1 мкмоль мин -1 мг' 1 (Таблица 2). Полученный препарат был достаточно стабилен, сохраняя 90% активности в течение двух суток при +4 °С либо в течение 2 месяцев при -70 °С .
Молекулярная масса выделенного белка YgjG по данным SDS-электрофореза составила около 50 kDa, что согласуется с расчетным значением и подтверждает сделанное нами ранее заключение о том, что каталитически активный препарат YgjG (ПАТаза) является продуктом трансляции orf2 .
Молекулярная масса препарата нативного YgjG, определенная с помощью гельфильтрации на колонке Сефакрил S-300, составила что свидетельствует о тетрамерной структуре белка в растворе при нейтральном рН .
3 2. Характеристика субстратной специфичности и основных физических и кинетических параметров препаратов Ht-YgjG и YgjG С целью определения влияния N-концевой гексагистидиновой последовательности на биологическую активность нативного белка YgjG мы сочли интересным провести параллельное исследование субстратной специфичности, основных физических и кинетических параметров как нативного белка YgjG так и его производного - Ht-YgjG .
Определение субстратной специфичности очищенных препаратов Ht-YgjG и YgjG проводили, используя в качестве доноров аминогрупп следующие соединения с дистальными аминогруппами: путресцин, кадаверин, спермидин, спермин, агматин, Lорнитин, ацетилорнитин, GABA, DAP, Р-аланин, а также основные L-аминокислоты. В качестве возможных акцепторов были проверены фенилпируват, Было показано, что оба фермента проявляют схожую субстратную специфичность (Таблица 3). Для обоих ферментов максимальные значения активности достигались при использовании в качестве акцептора аминогрупп - а в качестве доноров аминогрупп - путресцина (100%) или кадаверина (95-97%). Полученный результат показывает, что YgjG, также как и ПАТаза, выделенная Kim [Kim, 1964] из мутантного штамма E.coli, является диамин аминотрансферазой. Гораздо менее эффективно в качестве донора аминогрупп препараты YgjG и Ht-YgjG используют спермидин (27Практически не активны в качестве доноров L-аланин, агматин и L-орнитин (1Ферментативная активность не обнаруживалась в присутствии таких полиаминов как спермин и DAP. GABA; ацетилорнитин и орнитин также не активны в реакциях, катализируемых YgjG и Ht-YgjG .
Следует отметить, что YgjG также достаточно эффективно катализировал перенос аминогруппы глутамата на пируват, проявляя тем самым глутамат:пируват аминотрансферазную (GPT) активность. GPT активность препарата Ht-YgjG значительно ниже. Ни одна из известных к настоящему времени аминотрансфераз III группы не проявляет GPT активности, хотя присутствие вРТазы (КФ 2.6.1.2), способной катализировать синтез L-аланина в грубых экстрактах клеток Exoli, ранее было обнаружено [Reitzer, 1996]. Фрагмент ДНК, который, как полагали, содержит ген aJaB, кодирующий GPTa3y, был клонирован на мультикопийном векторе [Wang, 1987]. Однако приведенные в работе данные рестрикционного анализа клонированного фрагмента [Wang, 1987] не совпадают с рестриктной картой гена ygjG, что свидетельствует о том, что авторами был клонирован отличающийся от нашего фрагмент хромосомы Exoli .
Таблица 3. Субстратная специфичность очищенных препаратов Ht-YgjG и YgjG • с различными донорами и акцепторами аминогрупп .
Способность кетокислот выступать в качестве акцепторов аминогрупп исследовали с использованием путресцина в качестве донора аминогрупп. Было показано, что YgjG и Ht-YgjG осуществляют перенос аминогруппы на пируват и кетобутират. Однако, эффективность этого процесса существенно ниже, чем в случае КГ. Такие кетокислоты, как фенилпируват, а-кетоизовалериат, и были полностью инертны в качестве акцепторов .
Сравнение основных физических параметров препаратов YgjG и Ht-YgjG (Рис. 9) показало, что оба белка активны в диапазоне щелочных значений рН и проявляют максимальную активность при активность препаратов значительно снижается (в 5 - 6 раз). Эти результаты достаточно хорошо согласуются с данными Kim [Kim, 1964], полученными для препарата ПАТазы, выделенного из мутантного по утилизации путресцина штамма Exoli В (способного использовать путресцин в качестве единственного источника азота и углерода). Однако согласно другим данным, оптимум активности препарата ПАТазы, выделенного из мутантного по утилизации GABA и путресцина штамма E.coli К-12, наблюдался при рН 7.2 [Prieto-Santos et al., 1986] .
Возможно, это несоответствие вызвано существованием отличного от YgjG фермента, также катализирующего ПАТ реакцию с максимальной активностью при рН 7.2 .
Изучение температурных зависимостей ПАТ активностей очищенных препаратов YgjG и Ht-YgjG показало, что максимум активности для Ht-YgjG наблюдается при 60 °С, а для YgjG - при 70 °С (Рис. 9,Б). При физиологических значениях температур (в диапазоне 20 - 40°С) удельные активности обоих препаратов практически совпадали .
При высоких температурах, 80 - 90°С, активности препаратов снижаются (до 30-40% от максимальной). Также было показано, что падение активности рекомбинантного препарата Ht-YgjG за 50 мин. инкубации при 80 *С составляет 16%, а для препарата нативного белка — только 5%, что свидетельствует о достаточно высокой термостабильности изучаемых препаратов. При этом препарат YgjG более стабилен при высоких температурах, чем Ht-YgjG, содержащий N-концевую гексагистидиновую последовательность .
Для определения кинетических параметров ПАТ реакции, протекающей по механизму с замещением фермента ("пинг-понг-би-би" механизм) были. исследованы зависимости начальных скоростей реакции от концентрации одного из субстратов при насыщающей концентрации второго субстрата [Корниш-Боуден, 1979]. Для каждой из исследованных пар сопряженных субстратов с помощью регрессионного анализа экспериментальных данных определялись, кажущиеся значения параметров и После чего, на основе известных теоретических зависимостей [Корниш-Боуден, 1979], рассчитывались значения максимальной начальной скорости реакции и констант Михаэлиса для соответствующих субстратов .
Для нативного белка дополнительно были определены кинетические параметры реакции трансаминирования кадаверина и спермидина .
Таблица 4. Основные кинетические параметры* Ht-YgjG и YgjG .
Анализ значений для трех основных доноров YgjG - путресцина, кадаверина и спермидина, показывает, что путресцин является наиболее предпочтительным субстратом, и свидетельствует о том, что белок действительно является путресцин:
аминотраисферазой. Кадаверин также может служить донором аминогрупп, хотя сродство YgjG к этому субстрату в три раза ниже, чем к путресцину, а отношение в четыре раза ниже. Для спермидина соответствующие параметры на порядок ниже .
Сравнение кинетических параметров YgjG и Ht-YgjG, показывает, что хотя значения для них достаточно близки, сродство к субстратам у YgjG примерно в два раза выше. При этом, значения для путресцина также отличаются в два раза, а для практически совпадают. На основании приведенных данных можно заключить, что наличие дополнительного N-концевого пептида в Ht-YgjG, не сильно сказываясь на физических свойствах белка, изменяет его кинетические параметры по сравнению с YgjG. Выше мы отмечали, что элиминация первых 30 N-концевых аминокислот практически инактивируст фермент (см. Раздел 2.4). Следовательно, N-концевая область YgjG существенна для его ферментативной активности .
Определенные значения кинетических параметров препарата YgjG могут показаться достаточно высокими, однако известно что для многих ферментов, принадлежащих к подгруппе III PLP-зависимых аминотрансфераз, значения характеризуются как микромолярными, так и миллимолярными величинами (например - 2,5 мМ для и 0,48 мМ для ацетилорнитина в случае ацетилорнитинАТазы Е.coli) .
4. Влияние аллельного состояния гена на утилизацию путресцина Согласно литературным данным большинство штаммов Rcoli, в том числе и широко используемый лабораторный штамм Rcoli К12 MG1655 [Tabor et al, 1985;
Tkachenko et al, 1996], не способны использовать путресцин в качестве альтернативного источника азота. При изучении путей деградации путресцина в E.coli, как правило, использовались мутантные штаммы, утилизирующие путресцин [Dover et al, 1972;
Snaibe et al, 1985]. Нами был получен штамм MG1655 способный расти на путресцине в качестве единственного источника азота (Рис.1 ОД) и стабильно наследующий этот фенотип. Мутация была картирована в районе 80 мин хромосомы при помощи in vivo клонирования фрагментов хромосомальной ДНК на фагмиде [Groismanetal, 1986] .
С целью изучения влияния аллельного состояния гена ygjG на фенотип клеток Rcoli мы инактивировали ygjG на хромосоме штамма путем замены нативного аллеля ygj'G на ПЦР фрагмент, содержащий ген cat антибиотической устойчивости к хлорамфениколу при помощи Red рекомбиназы фага [Datsenko et al, 2000]. Таким образом, был получен штамм MG1655 ygjG. Делеция ygj'G не является летальной для клеток, что соответствует литературным данным [Schneider et al, 2002] .
Анализ кривых роста штаммов MG165 5 ygjGnMG1655 на безазотной среде М9 с путресцином показал (Рис. 10,А), что элиминация ygjG приводит к неспособности штамма утилизировать путресцин .
Рис 10. Кривые роста штаммов Kcoli на среде с путресцином в качестве единственного источника азота Влияние амплификации гена ygj'G на способность Е coli утилизировать путресцин определяли на примере штамма трансформированного плазмидой Наличие природной регуляторной области перед геном ygjG в составе плазмиды pUC18-ygjG, обеспечивало индукцию экспрессии ygj'G в условиях азотного голодания (см. Раздел 1), в результате чего полученный штамм приобрел способность утилизировать путресцин (Рис.10,Б). Однако рост штамма ygjG [pUC18ygjG] на безазотной среде М9, содержащей путресцин в качестве единственного источника азота, был очень медленным (время удвоения около 36 ч). Трансформация исходного штамма плазмидой pUC18-ygjG также привела к увеличению времени удвоения штамма на среде с путресцином с 4,5 ч. до 29 ч. При этом время удвоения трансформированного контрольной плазмидой pUC18, попрежнему, составляло 4,5 ч, что свидетельствует об ингибирующем эффекте от введения мультикопийной плазмиды pUC18-ygjG, вызванном, по-видимому, высокой дозой гена ygjG и, как следствие, синтезом значительного количества продукта переаминирования путресцина - который, как известно, токсичен для клеток Kcoli [Cooper et a l, 1980] .
Таким образом, на основании описанных выше результатов элиминации и амплификации ygjG, можно заключить, что кодируемый этим геном фермент - ПАТаза «отвечает» в клетках Ecoli за утилизацию путресцина в качестве альтернативного источника азота .
5. Поиск гомологов белка YgjG Изучение основных кинетических параметров YgjG подтвердило (см. Раздел 3.2), что фермент является ПАТазой, катализируя путресцин:а-КГ аминотрансферазную реакцию. Согласно литературным данным, в настоящее время обнаружена единственная ПАТаза, также использующая а-КГ в качестве акцептора - ПАТаза Klebsiella pneumoniae [Friedrich et al., 1979]. Однако ни аминокислотная последовательность, ни кинетические параметры этого фермента не охарактеризованы. Другие известные полиамин аминотрансферазы Pseudomonas aeruginosa [Lu et al., 2002] и Arthrobacter sp. TMP-1 [Yorifuji et al., 1997] используют в качестве акцептора пиру ват. Единственной путресцин аминотрансферазой с секвенированной в настоящее время последовательностью является фермент из Pseudomonas aeruginosa, кодируемый геном spuC. Однако, несмотря на схожую ферментативную активность, число идентичных аминокислотных остатков и консервативных замен в аминокислотных последовательностях SpuC (PA0299) и YgjG составляет только 27 % и 43 %, соответственно .
При проведении анализа генома Kcoli K12 [Blattner et al, 1997] были выявлены шесть белков гомологичных YgjG .
Среда ортологов YgjG с установленными каталитическими активностями максимальной гомологией обладает ОАТаза Bacillus subtilis RocD (gi| 16081086). Число идентичных аминокислотных остатков и консервативных замен в аминотрансферазах YgjG и RocD составляет соответственно 33 и 56%. Существенной гомологией с ПАТазой Exoli обладают также OAT (gi|11968102) AcOAT (gi|6324432) Rattus norvegicus, Saccharomyces cerevisiae, OAT (gi|3319072) Human, OAT (gi|23485730) Plasmodium yoelii, DAPAT (gi|2340815, 32/51) Acinetobacter baumannii и последовательности АТаз 1П группы из других организмов. Множественное выравнивание гомологичных YgjG полипептидов выявило в составе YgjG наличие консервативных последовательностей (Рис. 11) и позволило локализовать четыре инвариантных аминокислотных остатка (Gly-245, AspLys-ЗОО и Arg-426), отвечающих за связывание с субстратами и коферментом PLP .
Интересно, что YgjG обладает наиболее протяженной N-концевой последовательностью, что, по нашему мнению, также свидетельствует о существенной роли N-концевой структуры для каталитической активности этого фермента .
Представляется целесообразным выделить в геномах других штаммов E.coli и родственных микроорганизмов гипотетические последовательности, имеющие около 94идентичных а.к.о. с YgjG. Это 496 а.к.о. последовательности, кодируемые одноименными генами ygjG - (gi|15803614) и (gi|26249659) штаммов Exoli 0157:117 EDL933 и CFT073, соответственно. Три 429 а.к.о. последовательности: Salmonella enterica serovar Typhi СП 8 STY3396 (gi| 16504294), Salmonella typhimurium LT2 oat (gi|16421775) и YgjG (gi|30064418) штамма Shigella flexneri 2a str.2457T. А также последовательность размером 496 а.к.о., кодируемая геном ygjG (gi|24114370) другого штамма Shigella flexneri 2a - str.301. По-видимому, для этих последовательностей, как и в случае исследованной нами ПАТазы Exoli К12, имеет место ошибочная локализация ORF и истинной каталитически активной рамкой в каждом случае является полипептид размером 459 а.к.о., обладающий ПАТ активностью. В составе геномов не родственных Exoli организмов также были обнаружены гомологичные YgjG гипотетические последовательности, что свидетельствует о важной роли путресцин-аминотрансферазы в клеточном метаболизме азота и обуславливает целесообразность более подробного изучения этих ферментов .
ВЫВОДЫ
1. Клонирован ген ygjG Kcoli K12 MG1655 и показано, что аннотированная как орнитин аминотрансфераза ORF ygj'G кодирует ПАТазу - белок, обладающий путресцин: аминотрансферазной активностью и эффективно катализирующий реакцию переаминирования кадаверина .
2. Показано, что -зависимая экспрессия ygjG индуцируется в условиях азотного голодания. Определен старт транскрипции мРНК ygjG и стартовый кодон (UUG) трансляции YgjG .
3. Сконструированы рекомбинантные плазмиды, обеспечивающие эффективную продукцию YgjG как в виде слитого с лидером полипептида (Ht-YgjG) так и в виде нативного белка. Разработан метод выделения и очистки нативного белка и получены высокоочищенные препараты YgjG и Ht-YgjG .
4. Исследованы субстратная специфичность обоих белков и их основные кинетические параметры в реакциях трансаминирования с использованием путресцина, кадаверина и спермидина в качестве доноров и в качестве акцептора аминогрупп. Определены рН и температурная зависимости ферментативной активности ПАТазы YgjG .
Результаты диссертации изложены в следующих публикациях:
Samsonova N.N., Smirnov S.V., Altman I.B., Ptitsyn L.R. «Molecular cloning and 1. characterization of Escherichia coli K12ygjG gene» //BMC Microbiology, 3:2, (2003) .
2. Samsonova N.N., Smirnov S.V., Altman I.B., Ptitsyn L.R. «Characterization of Escherichia coli YgjG protein as putrescine:2-oxoglutarate aminotransferase with broad substrate specificities» //FEMS Letters, v. 222(S), p.346, (2003) .
3. Самсонова Н.Н., Смирнов С В., Альтман И.Б., Птицын Л.Р. «Идентификация гена Escherichia coli К12, кодирующего путресцин аминотрансферазу» //XV зимняя международная молодежная научная школа «Перспективные направления физикохимической биологии и биотехнологии». Тез. докл. и стенд, сообщений, с.31, Москва, (2003) .
4. Самсонова Н.Н., Смирнов С В., Альтман И.Б., Птицын Л.Р. «Идентификация гена Escherichia coli K12, кодирующего путресцин аминотрансферазу» //Научная сессии МИФИ-2003. Сборник научных трудов, том 5, с.32-33, Москва, (2003) .
5. Самсонова Н.Н., Смирнов СВ., Альтман И.Б., Птицын Л.Р. «Изучение регуляции транскрипции и функциональная характеристика продукта трансляции гена ygjG Exoli К12»
//6-я Путинская школа конференция молодых ученых. Тез. докл., с.315, Москва, (2002) .
Принято к исполнению 26/04/2004 Заказ № 160 Исполнено 27/04/2004 Тираж: 100 экз .