WWW.LIT.I-DOCX.RU
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - различные публикации
 

«Шорманов В.К.1, Андреева Ю.В.1, Сухомлинов Ю.А.1, Омельченко В.А.2 ГОУ ВПО «Курский государственный медицинский университет», урск К ЭКЦ УМВД России по Орловской области, Орел ...»

100

для определения производных 3-(трифторметил)­

Шорманов В.К.1, Андреева Ю.В.1, Сухомлинов Ю.А.1, Омельченко В.А.2

ГОУ ВПО «Курский государственный медицинский университет», урск

К

ЭКЦ УМВД России по Орловской области, Орел

Поступила в редакцию 10.11.2015 г .

Изучены особенности хроматографического поведения производных 3-(трифторметил)­

анилина в тонких слоях и колонках гидроксилированных сорбентов в зависимости от полярности

подвижных фаз. Определены параметры, характеризующие условия определения исследуемых веществ методами ТСХ, колоночной хроматографии низкого давления и ВЭЖХ. Разработана методика химико-токсикологического исследования производных 3-(трифторметил)-анилина с применением хроматографических методов анализа .

производные ТСХ, колоночная 3-(трифторметил)-анилина,

Ключевые слова:

хроматография, ВЭЖХ, химико-токсикологическое исследование .

Shormanov V.K.1, Аndreeva Y.V.1, Suhomlinov Y.А.1, Omelchenko V.A.2 Peculiarities of chromatographic behaviour of the derivatives of 3-(trifluoromethyl)-aniline in thin layers and columns of hydroxylated sorbents depending on the polarity of the mobile phases have been studied. Parameters, characterizing the conditions of defining the investigated substances using the TLC methods, column chromatography of low pressure and high pressure liquid chromatography (HPLS) have been determined. Methods for chemico-toxicological investigation of the derivatives of 3-(trifluoromethyl)­ aniline with application of chromatographic analysis methods have been developed .

Keywords: derivatives of 3-(trifluoromethyl)-aniline, TLC, column chromatography, HPLS, chemical-toxicological investigation .

Введение Производные 3-(трифторметил)-анилина являются биологически активными веществами, которые обладают цитостатическим действием .

Один из производных 3-(трифторметил)-анилина – флутамид - широко применяется в медицине в качестве противоопухолевого средства для лечения рака предстательной железы и гирсутизма у женщин [1, 2] .

Шорманов и др. / Сорбционные и хроматографические процессы. 2016. Т. 16. № 1 Многие соединения данной группы обладают токсическими свойствами по отношению к теплокровным организмам [3, 4, 5]. Известны случаи отравления людей флутамидом вследствие его метаболизма, в том числе с летальным исходом [6]. Вопросы химико-токсикологического анализа производных 3-(трифторметил)­ анилина до настоящего времени остаются недостаточно изученными [7]. Для флутамида и других производных 3-(трифторметил)-анилина отсутствует нормативная документация, регламентирующая особенности их определения в биологических объектах химическими методами при экспертизах случаев отравления .

В практике подобных исследований широкое распространение получили различные виды хроматографии. Например, использование жидкостной колоночной хроматографии низкого давления позволяет очищать биообъекты до необходимой чистоты, тонкослойная хроматография является универсальным экспресс-методом и используется для предварительной идентификации токсичных соединений, а для подтверждающей идентификации и количественного определения отравляющих веществ часто применяют метод ВЭЖХ .

Цель настоящего исследования изучение особенностей

– хроматографического определения производных 3-(трифторметил)-анилина в извлечениях из биологического материала .

Эксперимент





Объектами исследования явились производные 3-(трифторметил)-анилина:

флутамид - 2-метил-N-(4-нитро-3-(трифторметил)фенил)-пропанамид (Фл) (LGC Standards, содержание вещества 99%), 4-нитро-3-(трифторметил)-анилина (4-А-3­ ТФМФА) (LGC Standards, содержание вещества 99%), 2-метил-N-(4-амино-3­ (трифторметил)фенил)пропанамид (4-А-3-ТФМФА) (РСО, содержание вещества 97%) и N-(4-ацетамино-3-(трифторметил)фенил)ацетамид (N-4-АА-3-ТФМФАА) (РСО, содержание вещества 99%). Внутренним стандартом являлся анилин (Ан) (ГОСТ 5819-78, содержание вещества 99,5%) .

В качестве аналитических методов рассматривались тонкослойная хроматография (ТСХ), жидкостная колоночная хроматография низкого давления и высокоэффективная жидкостная хроматография (ЖКХНД) (ВЭЖХ) .

Исследовались особенности хроматографического поведения производных 3­ в тонких слоях и колонках сорбентов с (трифторметил)-анилина гидроксилированной поверхностью при использовании моно- и двухкомпонентных подвижных фаз различной полярности. Определение методом ТСХ осуществляли в тонком слое силикагеля СТХ-1А с размером частиц 5-17 мкм (пластины «Сорбфил»

марки ПТСХ-АФ-А-УФ со слоем гидроксилированного сорбента), используя хроматографические камеры с внутренним объёмом около 600 см3, которые предварительно насыщались парами растворителей в течение 30 минут .

Анализируемые вещества наносили на пластины в виде 0,04% ацетоновых растворов (объём наносимой пробы составлял 5-10 мкл). Хроматограммы проявляли в УФ­ свете. Рассчитывали значения абсолютной (Rf) и относительной (по отношению к анилину) (Rs) хроматографической подвижности. Строили графики зависимости значений хроматографической подвижности анализируемых веществ от процентного содержания полярного компонента в двухкомпонентных подвижных фазах. При определении методом ЖКХНД использовали колонку силикагеля L 40/100 мкм размерами 12012 мм (общая масса сорбента 10 г) .

Шорманов и др. / Сорбционные и хроматографические процессы. 2016. Т. 16. № 1

В колонку вводили по 2 см3 0.25% растворов анализируемых веществ в элюентах. Элюат собирали в виде отдельных фракций по 2 см3 .

Присутствие производных 3-(трифторметил)-анилина во фракциях определяли после испарения из них элюента фотометрическим методом (растворяющая среда – этанол).

Учитывая найденные объёмы удерживания (VR) исследуемых веществ и объём удерживания неудерживаемого вещества (Vo), для каждого анализируемого соединения рассчитывали значения времени удерживания (tR), коэффициента ёмкости (k), числа теоретических тарелок (N) по формулам 1-3:

t R = Vr / v (1) k = (VR Vo ) / Vo = ( t R t o ) / t o (2) N = 16( t R / )2 (3) где v -скорость истечения элюента, см /мин; tо – время удерживания несорбируемого вещества, мин; – ширина пика у основания, мин .

Определение методом ВЭЖХ осуществляли на приборе «Милихром-5-3»

(ЗАО «Научприбор», г. Орёл) с УФ – детектором в колонке (1002 мм) гидроксилированного сорбента «Силасорб-600» при температуре 20оС. Скорость подачи подвижной фазы составляла 100 мкл/мин. Оптическую плотность производных 3-(трифторметил)-анилина регистрировали при длине волн 300 нм. По известным формулам рассчитывали значения времени (tR) и объёма удерживания (VR), коэффициента ёмкости (k), числа теоретических тарелок (N) и коэффициента разделения (Rs) .

Для количественного определения производных 3-(трифторметил)-анилина методом ВЭЖХ строили градуировочные графики, отражавшие прямо пропорциональную зависимость площади пика от количества хроматографируемого вещества и рассчитывали их уравнения .

Обсуждение результатов

Результаты хроматографирования производных 3-(трифторметил)-анилина при использовании однокомпонентных подвижных фаз представлены в табл. 1 .

Как свидетельствуют данные табл. 1, при использовании однокомпонентных подвижных фаз не удавалось достичь чёткого разделения производных 3-(трифторметил)-анилина при их совместном присутствии в анализируемой смеси .

В связи с этим была предпринята попытка оптимизации условий хроматографирования с целью оптимизации условий разделения исследуемых соединений путём применения двухкомпонентных элюентов .

Результаты исследования хроматографической подвижности производных 3­ (трифторметил)-анилина с применением нескольких групп двухкомпонентных подвижных фаз, одним из которых являлся растворитель с очень низким значением диэлектрической проницаемости (гексан), а вторым - растворитель с достаточно высокой диэлектрической проницаемостью (ацетон, этилацетат, этанол), представлены на рис. 1-4 .

Как свидетельствуют полученные данные, для каждой группы подвижных фаз, являющихся смесями двух каких-либо растворителей, наблюдается зависимость хроматографической подвижности производных 3-(трифторметил)-анилина в тонком слое силикагеля от процентного содержания полярного компонента подвижной фазы: с увеличением содержания полярного компонента величины Rf адсорбатов Шорманов и др. / Сорбционные и хроматографические процессы. 2016. Т. 16. № 1 сначала резко возрастают, а затем, по достижению определённых значений, стабилизируются и в дальнейшем могут несколько снижаться .

–  –  –

Полное разделение всех анализируемых веществ на пластинах «Сорбфил»

удаётся добиться, используя подвижную фазу гексан-ацетон (7:3). Параметры хроматографирования производных 4-нитро-3-(трифторметил)-анилина методом ЖКХНД с применением ряда подвижных фаз (гексана, ацетона, а также смесей этих растворителей в различных объёмных соотношениях) представлены в табл. 2 .

Рис. 1. Определение производных 3-(трифторметил)-анилина методом ТСХ при использовании подвижных фаз ацетон-гексан: 1 – Ан, 2 – Фл, 3 – 4-Н-3-ТФМА, 4 – 4-А-3-ТФМФА, 5 – N-4-AA-3-ТФМФАА Шорманов и др. / Сорбционные и хроматографические процессы. 2016. Т. 16. № 1 Рис. 2. Определение производных 3-(трифторметил)-анилина методом ТСХ при использовании подвижных фаз этилацетат-гексан: 1 – Ан, 2 – Фл, 3 – 4-Н-3­ ТФМА, 4 – 4-А-3-ТФМФА, 5 – N-4-AA-3-ТФМФАА Рис. 3. Определение производных 3-(трифторметил)-анилина методом ТСХ при использовании подвижных фаз этанол-гексан: 1 – Ан, 2 – Фл, 3 – 4-Н-3-ТФМА, 4 – 4-А-3-ТФМФА, 5 – N-4-AA-3-ТФМФАА Рис. 4. Определение производных 3-(трифторметил)-анилина методом ТСХ при использовании подвижных фаз диоксан-1,4-гексан: 1 – Ан, 2 – Фл, 3 – 4-Н-3-ТФМА, 4 – 4-А-3-ТФМФА, 5 – N-4-AA-3-ТФМФАА Шорманов и др. / Сорбционные и хроматографические процессы. 2016. Т. 16. № 1

–  –  –

Как свидетельствуют полученные данные, в качестве универсальной подвижной фазы, позволяющей достичь хороших результатов элюирования всех исследуемых веществ из колонки силикагеля, может быть применена смесь растворителей гексан-ацетон (7:3). Она позволяет при относительно небольшом для ЖКХНД времени удерживания адсорбатов обеспечить их достаточно селективное элюирование как по отношению друг к другу, так и по отношению к группе гидрофобных соэкстрагирующихся веществ биоматериала, присутствующих в первых 6-8 мл элюата. Для хроматографирования производных 3-(трифторметил)­ анилина методом ВЭЖХ применяли подвижную фазу гексан-диоксан­ тетрахлорметан (1:1:1). Параметры хроматографирования объектов исследования методом ВЭЖХ в колонке с сорбентом «Силасорб 600» с использованием подвижной фазы гексан-диоксан-тетрахлометан (1:1:1) представлены в табл. 3 .

Как свидетельствуют данные таблицы, выбранная хроматографическая система обеспечивает достаточную эффективность колонки по отношению к объектам исследования и позволяет разделить анализируемые объекты в случае их совместного присутствия в пробе .

Шорманов и др. / Сорбционные и хроматографические процессы. 2016. Т. 16. № 1

–  –  –

Открываемый минимум производных 3-(трифторметил)-анилина методом ВЭЖХ в предлагаемых условиях составляет 0.01-0.02 мкг в хроматографируемой пробе .

Уравнения градуировочных графиков для количественного определения объектов исследования методом ВЭЖХ имеют следующий вид:

S=188.44872C+3.34841 (для флутамида), S=104.69749C+3.12406 (для 4-нитро-3-(трифторметил)-анилина), S=1.12213C-0.07952 (для 2-метил-N-(4-амино-3-(трифторметил)фенил)пропанамид), S=19.42119C+0.13169 (для N-(4-ацетамино-3-(трифторметил)-фенил)ацетамида) .

где S–площадь пика, С– содержание вещества в хроматографируемой пробе, мкг .

Относительная ошибка определения рассматриваемых веществ методом ВЭЖХ в субстанциях не превышает 1.50% (n=6; P=0.95) .

Результаты, полученные при изучении хроматографических свойств производных 3-(трифторметил)-анилина в тонких слоях и колонках сорбентов, явились основой для разработки схем очистки, идентификации и количественного определения объектов исследования в биологическом материале с применением методов ЖКХНД, ТСХ и ВЭЖХ .

Методика определения производных в 3-(трифторметил)-анилина биологическом материале. При разработке методики готовили модельные смеси различных количеств анализируемых веществ (1.25-50.0 мг) с мелкоизмельчённой (размер частиц 0.2-0.5 см) тканью печени, герметично закрывали и выдерживали при комнатной температуре в течение 1.5 часа .

По истечении указанного времени к 25 г модельной смеси, содержащей определённое количество того или иного анализируемого соединения, прибавляли 50 г ацетона и выдерживали 45 минут при периодическом перемешивании .

Извлечение отделяли от частиц биоматериала декантацией, а операцию настаивания повторяли в вышеописанных условиях. Отдельные извлечения объединяли, фильтровали через стеклянный фильтр диаметром 3.6 см предварительно промытом изолирующим агентом. Порции фильтрата и промывной жидкости объединяли и упаривали в токе воздуха при температуре 18-22°С до сухого остатка. Остаток растворяли в 2-3 см3 смеси растворителей гексан-ацетон (7:3) и вносили раствор в колонку силикагеля L 40/100 мкм (12012 мм). После полного вхождения раствора в слой сорбента хроматографировали, используя элюент гексан-ацетон (7:3). Элюат собирали фракциями по 2 см3. Фракции, содержащие то или иное анализируемое вещество, объединяли, испаряли в токе воздуха при температуре 18-22°С. Остаток растворяли в 5 см3 диоксана (исходный раствор) .

Предварительная идентификация методом ТСХ. 0.3 см3 исходного раствора

Шорманов и др. / Сорбционные и хроматографические процессы. 2016. Т. 16. № 1

подвижную фазу гексан-ацетон (7:3). Хроматограммы проявляли в УФ-свете .

Исследуемые вещества идентифицировали по величине Rf .

Подтверждающая идентификация и количественное определение методом ВЭЖХ. 1 см3 исходного раствора вносили в мерную колбу вместимостью 25 см3, туда же прибавляли по 1 см3 тетрахлорметана и гексана, после чего доводили до метки смесью растворителей гексан-диоксан-тетрахлорметан (1:1:1). 2-16 мкл полученного раствора вводили в хроматограф. Хроматографировали, используя подвижную фазу гексан-диоксан-тетрахлорметан (1:1:1). Скорость подачи подвижной фазы - 100 мкл/мин. Оптическую плотность производных 3­ (трифторметил)-анилина регистрировали при 300 нм. Вещества идентифицировали на основе характерного значения времени (объёма) удерживания. Количественное содержание того или иного вещества рассчитывали по площади хроматографического пика, используя уравнение градуировочного графика .

Результаты определения представлены в табл. 4 .

–  –  –

Как свидетельствуют полученные данные, при изменении содержания веществ в биологическом материале в интервале концентраций 1.25-50.0 мг при постоянной массе навески трупной печени (25 г) изменение среднего значения степени извлечения незначительно и не превышает 2.5%. Это позволяет предположить, что анализируемые соединения с веществами биологических тканей не образует достаточно прочных связей .

Шорманов и др. / Сорбционные и хроматографические процессы. 2016. Т. 16. № 1

На хроматограммах, полученных при определении производных 3­ (трифторметил)-анилина методом ВЭЖХ, после их изолирования по разработанной методике из биологического материала, в сравнении с хроматограммами веществ­ стандартов, не обнаруживались дополнительные пики или заметное увеличение фонового поглощения. Параметры хроматографирования соединений, извлечённых из печени, совпадали с соответствующими параметрами стандартных веществ. Это позволяет сделать выводы о достаточной эффективности предлагаемой схемы очистки, основой которой является ЖКХНД .

Заключение

Разработанная методика позволяет идентифицировать и определить в модельных смесях с тканью печени 87-91% анализируемых веществ от первоначально внесённого их количества с достаточными для подобного рода исследований воспроизводимостью и правильностью. Открываемый минимум рассматриваемых соединений методами ТСХ и ВЭЖХ составляет соответственно 0,4-0,6 и 0,2-0,4 мг в 100 г биологического материала .

–  –  –

Шорманов Владимир Камбулатович – Shormanov Vladimir K. – Doctor of д.фарм.н., профессор кафедры pharmaceutical science, professor of department of фармацевтической, токсикологической и pharmaceutical, toxicological and analytical аналитической химии Курского chemistry, Kursk State Medical University, Kursk, государственного медицинского университета, e-mail: R-WLADIMIR@yandex.ru Курск

–  –  –




Похожие работы:

«СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ БИОЛОГИЯ, 2017, том 52, 2, с. 274-281 УДК 636.1:591.463.1:57.086.8 doi: 10.15389/agrobiology.2017.2.274rus СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ УЛЬТРАСТРУКТУРЫ СПЕРМАТОЗОИДОВ В ЭПИДИДИМАЛЬНОЙ, ЭЯКУЛИРОВАННОЙ И КРИОКОНСЕРВИРОВАННОЙ СПЕРМЕ ЖЕРЕБЦОВ М.М. АТРОЩЕНКО1, В.В. КАЛАШНИКОВ1, Е.Е. БРАГИ...»

«A C TA U N I V E R S I TAT I S L O D Z I E N S I S FOLIA LINGUISTICA ROSSICA 12, 2016 http://dx.doi.org/10.18778/1731-8025.12.07 Елена Иванян Самарский государственный социально-педагогический университет (Самара, Россия) ПРОБЛЕМЫ ЛИНГВОЭКОЛОГИИ РУССКОЙ РЕ...»

«Тема 5. Ф Фотоэлем менты тр ретьего поколени Рын ия. нок и эн нергоресу урсы России ( часа) (2 Фо отоэлементы трет тьего пок коления Фо отоэлемен нты трет тьего по околения – это устройст тва, обе еспечиваю ющие высокий коэф...»

«1. Пояснительная записка Место учебного предмета в учебном плане 1.1. Рабочая программа составлена на основе Федерального компонента Государственного стандарта основного общего образования, Примерной программы основного общего образования по биологии, а также Программы основного общего образования по биологии. V IX классы. Авторы В.В. Пасечник,...»

«Номинация "Пьесы малого формата Три одноактные пьесы: "Овцеволк", "Цветы юности в море зла", "Надежда". Дмитрий Нилин ОВЦЕВОЛК Фантастическая комедия в одном действии Действующие лица: В и н т и к (Рудек Винтик) – служащий какого-то аппарата. П е в и ц а – артистка одного из провинциальных театр...»

«БИОЛОГИЯ УДК 631 ВЛИЯНИЕ ЗАГРЯЗНЕНИЯ КАДМИЕМ НА ФЕРМЕНТАТИВНУЮ АКТИВНОСТЬ ЧЕРНОЗЕМА ОБЫКНОВЕННОГО © Е. И. Новоселова*, С. А. Башкатов Башкирский государственный университет Россия, Республика Башкортостан, 450076 г. Уфа, ул...»

«ХИМИЯ РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ. 2004. №4. С. 25–28. УДК 615.322:614.7:577.4 ОЦЕНКА ПЕРСПЕКТИВНОСТИ НЕКОТОРЫХ ВИДОВ ЛЕКАРСТВЕННОГО РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ С ТОЧКИ ЗРЕНИЯ ИХ ЭКОЛОГИЧЕСКОЙ ЧИСТОТЫ Н.Э. Коломиец, И.А. Туева, О.А. Мальцева, С.Е. Дмитрук, Г.И. Калинкина* © Сибирский г...»






 
2018 www.lit.i-docx.ru - «Бесплатная электронная библиотека - различные публикации»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.