WWW.LIT.I-DOCX.RU
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - различные публикации
 

Pages:   || 2 |

«Хамама Зина РАЗРАБОТКА, СТАНДАРТИЗАЦИЯ И ИЗУЧЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ПЛЁНКИ СПЕРМИЦИДНОГО ДЕЙСТВИЯ, НА ОСНОВЕ САПОНИНОВ STYRAX OFFICINALIS L. ...»

-- [ Страница 1 ] --

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ АВТОНОМНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ

УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ

РОССИЙСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ ДРУЖБЫ НАРОДОВ

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

На правах рукописи

Хамама Зина

РАЗРАБОТКА, СТАНДАРТИЗАЦИЯ И ИЗУЧЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКОЙ

АКТИВНОСТИ ПЛЁНКИ СПЕРМИЦИДНОГО ДЕЙСТВИЯ, НА ОСНОВЕ

САПОНИНОВ STYRAX OFFICINALIS L .

14.04.01 – технология получения лекарств Диссертация на соискание учёной степени кандидата фармацевтических наук

Научный руководитель:

кандидат фармацевтических наук, доцент Суслина Светлана Николаевна Москва – 2018

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Контрацепция на Ближнем Востоке и в том числе среди сирийских женщин

1.2. Вагинальная система доставки лекарств

1.3. Информация о спермицидах и спермицидных препаратах

1.4. Сапонины- их классификация, химическое строение и свойства……… 30

1.5. Стиракс лекарственный (Styrax officinalis L.), как источник сапонинов. 34 Заключение по главе 1

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы исследования

2.1 .

2.2. Методы исследования

2.2.1. Фармакогностические анализы сырья

Макроскопический анализ сырья

Микроскопический анализ сырья

Микроструктурный анализ сырья

2.2.2. Методы определения показателей качества сырья……………... 46

-Определение размеров частиц

-Определение влажности

общей золы и золы, нераствор

–  –  –

результатов анализа

Заключение по главе 2

ГЛАВА ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ СЫРЬЯ

3:

«ОКОЛОПЛОДНИКИ СТИРАКСА ЛЕКАРСТВЕННОГО» И

РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ КОНТРОЛЯ ЕГО КАЧЕСТВА

–  –  –

ГЛАВА 4: РАЗРАБОТКА МЕТОДИКИ ВЫДЕЛЕНИЯ И ИЗУЧЕНИЕ

ЭКСТРАКТА СТИРАКСА ЛЕКАРСТВЕННОГО ……………................. 88

–  –  –

активности жидкого и сухого экстрактов околоплодников стиракса лекарственного (Styrax officinalis L.) в опытах in vitro……………….. 123 Выводы по главе 4

ГЛАВА РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ И

5 .

КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА СПЕРМИЦИДНОЙ ПЛЕНКИ НА ОСНОВЕ

СУХОГО ЭКСТРКТА СТИРАКСА ЛЕКАРСТВЕННОГО…………...… 126

–  –  –

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ПЕРЕЧЕНЬ УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЯ

Папа Павел в книге «Humanae Vitae» (лат. человеческой жизни), изданной 25 июля 1968 года, писал: «Самое замечательное в развитии всего следует рассматривать большое продвижение человека в доминировании и рациональной организации сил природы до такой степени, что он стремится расширить этот контроль над каждым аспектом своей жизни - над его телом, его умом и эмоциями, над его социальной жизни, и даже над законами, которые регулируют передачу жизни». По его мнению, отказ от большинства форм контроля рождаемости является необходимым. Из-за запрещения всех форм искусственной контрацепции, эта энциклика стала политической спорной .





Контрацепция - это не только защита от нежелательной беременности, но и сохранение здоровья и путь к рождению здорового ребенка. Решение о том, когда иметь детей и иметь ли их, представляется каждой женщине. Благодаря огромному выбору противозачаточных средств, можно иметь безопасную половую жизнь, желанную беременность, и планировать рождение ребенка, будучи кормящей мамой .

В ряде ближневосточных стран сильная правительственная власть оказывает серьезное влияние на распространение знаний о контрацепции. В некоторых странах доминирующая религия отрицательно относится к контрацепции. Другим важным фактором отношения к контрацепции служит экономическая политика правительства в условиях перенаселения или же в условиях экономического спада .

Сирия является одной из стран с высоким уровнем рождаемости. Причины, с одной стороны, заключаются в самих женщинах, а, с другой стороны, в системе здравоохранения .

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования Исторически именно растения являются источником многих фармацевтических субстанций с высокой биологической активностью и достаточной безопасностью их использования по сравнению с синтетическими лекарственными средствами. Несмотря на большое разнообразие растений в Сирии и опыт этномедицины, исследования в этой области немногочисленны .

Имеется очень мало лекарственных препаратов на основе растительных субстанций, хотя их производство сравнительно простое и недорогое .

Вышеизложенное определяет актуальность исследования растительных продуцентов, произрастающих в Сирии, в частности Styrax officinalis L. и использование препарата на его основе в качестве местного контрацептивного средства. Современные натуральные средства местной контрацепции позволяют сохранять здоровье женщин и планировать рождение детей, не нарушая культурных традиций. Использование полученных в работе данных позволит поощрять культивирование лекарственных растений и обеспечит создание новых рабочих мест и будет содействовать медицинскому, социальному и экономическому развитию сирийского общества .

Степень разработанности темы исследования Авторы U. Zehavi, M. Levy, R. Segal (1986) посвятили свою работу «Fungistatic аctivity of Saponin A from Styrax officinalis L. on plant pathogens»

исследованию биологического действия сапонинов Styrax officinalis L.. Однако составы на основе сапонинов стиракса в любом виде до настоящего времени не являлись объектом научных исследований. Также отсутствуют какие-либо фармакогностические данные о БАВ Styrax officinalis L. произрастающим в Сирии .

Цель и задачи исследования Цель работы - фармакогностическое изучение нового вида растительного сырья «стиракса лекарственного околоплодники» и разработка состава и технологии вагинальных спермицидных плёнок с экстрактом стиракса лекарственного (ВСПЭС) .

Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:

1. На основе сравнительного анализа литературных данных и результатов оценки биологической активности тритерпеноидных сапонинов Styrax officinalis L. in silico обосновать актуальность разработки местного спермицидного средства;

2. Изучить состав биологических активных веществ (БАВ) и провести фармакогностическую оценку нового вида сырья "околоплодники стиракса лекарственного";

3. Разработать методику получения сухого экстракта стиракса лекарственного (СЭСЛ) и изучить показатели его качества;

4. Разработать состав и технологию ВСПЭС;

5. Разработать методики стандартизации ВСПЭС и изучить стабильность в процессе хранения;

6. Изучить фармацевтическую доступность комплекса сапонинов in vitro, контрацептивное действие и биологическую безвредность ВСПЭС на лабораторных животных in vivo .

Научная новизна Впервые выявлены диагностические признаки в анатомическом строении тканей плодов стиракса лекарственного на основании макроскопического и микроскопического анализа и получены объективные данные этих признаков в виде оригинальных микрофотографий .

Впервые плоды стиракса лекарственного изучены с помощью сканирующей электронной микроскопии (СЭМ). Результаты этих исследований иллюстрированы оригинальными микрофотографиями .

Впервые разработаны состав и технология вагинальных пленок спермицидного действия содержащих сапонины (ВСПЭС), выделенные из околоплодников стиракса лекарственного (Styrax officinalis L.), произрастающего на территории Сирии .

Выделен целевой фрагмент метаболома плодов стиракса лекарственного, содержащий сумму сапонинов и изучен с использованием МС, ТСХ, ПМР, УФ СФМ .

Впервые выявлена спермицидная активность сухого экстракта из околоплодников стиракса лекарственного, произрастающего в Сирии .

Впервые установлена специфическая активность тритерпеноидных сапонинов из околоплоднков стиракса лекарственного в опытах in silico и проведена компьютерная оценка плейотропного действия на основе зависимостей (структура-активность) .

Теоретическая и практическая значимость исследования Проведенная работа будет содействовать углублению научных исследований по созданию препаратов, в том числе спермицидного действия на основе БАВ стиракса лекарственного и других растений в Сирии .

Подана справка № 017298 по заявке 2018111180 от 29.03.2018 на патент РФ:

«Композиция спермицидного действия для вагинального применения, содержащая тритерпеноидные сапонины из Styrax officinalis L.». Разработанные спермицидные пленки в дальнейшем могут быть внедрены в фармацевтическое производство в Сирии .

Основные положения, выносимые на защиту результаты фармакогностического исследования нового вида ЛРС "околоплодники стиракса лекарственного";

разработка методики выделения и изучение СЭСЛ;

разработка состава, технологии и методик стандартизации ВСПЭС;

результаты комплекса исследований биологической спермицидной и контрацептивной активности ВСПЭС .

Методология и методы исследования Методология работы основана на анализе и обобщении научных данных о сапонинах растительного происхождения, их выделении и препаратах на их основе. Морфологические и анатомические характеристики растительного сырья устанавливались методами микроскопии. Изучение состава полученного сухого экстракта и готовой лекарственной формы проводилось с помощью УФспектрофотометрии, ТСХ, ВЭЖХ. Подлинность и количественное содержание действующих веществ определялось методом ЯМР .

Работа содержит сравнительную экспериментальную оценку модельных составов вагинальных пленок, содержащих СЭСЛ .

Для оценки качества лекарственных пленок использованы современные методы анализа и показатели качества, регламентированные ГФ XIII издания РФ (микробиологическая чистота, pH, влажность и др.). Для определения технологических показателей методики пробоподготовки были модифицированы (время дезинтеграции пленки, время растворения пленки, тест однородности дозирования и высвобождение биологически активных веществ в опытах in vitro) .

Специфическая активность определена в соответствии с приказом МЗ РФ №267 от 19.06.2003 г. «Об утверждении правил лабораторной практики» и ФЗ 61 «О лекарственных средствах» (статья 36) .

Достоверность научных положений и выводов Достоверность полученных результатов подтверждена многократной повторностью экспериментов по выделению суммы сапонинов из околоплодников стиракса лекарственного, разработке составов модельных пленок и технологии их получения с использованием современных физических и физикохимических методов анализа на современном оборудовании, а также статистической обработкой полученных результатов и их сопоставлением с данными литературы .

Апробация результатов исследования Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на III Международной научно-практической конференции «Современная парадигма научного знания: актуальность и перспективы» (г. Mосква, 2015 г.); III Международной научно-практической конференции «Проблемы медицины в современных условиях» (г. Казань, 2016 г.); VII Международной научной конференции «Science4Health 2016» (г.

Москва, 2016 г.); IV Международной научно-практической конференции «Современная парадигма научного знания:

актуальность и перспективы» (г. Москва, 2016 г.); IV Международной научнопрактической конференции «Актуальные проблемы и достижения в медицине» (г .

Самара, 2017 г.); V международной научной конференции «Современные аспекты использования растительного сырья и сырья природного происхождения в медицине» (г. Москва, 2017 г.); VIII международной научной конференции «Science4Health 2017» (г. Москва, 2017 г.); V научно-практической конференции с международным участием «Молодые ученые и фармация ХХI века» ФГБНУ ВИЛАР (г. Москва, 2017 г.); XXV Российском национальном конгрессе «Человек и Лекарство» (г. Москва, 2018 г.); Апробация результатов научной работы проведена на кафедре ОФиБМТ ФГАОУ ВО РУДН от 28 августа 2018, протокол 307-04 №1 .

Личный вклад автора заключается в непосредственном участии на всех этапах исследования: от первого этапа - выбора объекта исследования, постановки реализации задач до статистической обработки, обобщения, анализа и обсуждения полученных результатов в научных публикациях и написании диссертационной работы и автореферата .

Внедрение результатов исследования Результаты работы внедрены в учебный процесс кафедры общей фармацевтической и биомедицинской технологии РУДН (Акт об использовании в учебном процессе от 10.01.18) и (Акт внедрения от 15.01.18). Разработка состава и технологии изготовления лекарственных полимерных пленок с растительным экстрактом внедрены в ЦКП (НОЦ) РУДН (Акт внедрения от 24.01.18) .

Материалы диссертационной работы могут быть использованы в преподавании таких дисциплин, как «Фармацевтическая технология», «Фармакология», «Фармакогнозия», «Биофармация», «Фармацевтическая химия», «Биохимия» .

Соответствие диссертации паспорту научной специальности Диссертационное исследование проведено в соответствии с паспортом специальности 14.04.01-технология получения лекарств. Результаты диссертационного исследования соответствуют области исследования специальности, пунктам 3, 4, 6 паспорта специальности "технология получения лекарств" .

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтической науки Диссертационная работа выполнена в рамках Договора № 10 «О создании Научно-образовательного комплекса РУДН–ВИЛАР» от 20.01.2012 г. № темы «Биофармацевтические аспекты создания инновационных 0576-2014-0013 лекарственных средств» .

Публикации По материалам диссертации опубликовано 14 научных работ, в том числе 4 статьи в журналах, входящих в перечень ведущих периодических изданий ВАК РФ, 2 из которых в журналах, рекомендуемых для публикации статей по профилю рассматриваемой диссертации. Получена приоритетная справка № 017298 по заявке 2018111180 от 29.03.2018 «Композиция спермицидного действия для вагинального применения, содержащая тритерпеноидные сапонины из Styrax officinalis L.» .

Объем и структура диссертации Диссертационная работа изложена на 217 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, четырех экспериментальных глав, выводов, списка цитируемой литературы, включающего 158 источников, в том числе 146 иностранных, 11 приложений. Работа содержит 62 рисунка и 46 таблиц .

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Контрацепция на Ближнем Востоке и в том числе в Сирии 1.1 .

Сирийские женщины как часть культуры Ближнего Востока: Уровень рождаемости в арабских странах был одним из самых высоких в мире - в среднем около 39 рождений на тысячу населения в год. Общий коэффициент рождаемости, более 6,5 рождений на одну женщину (Организация Объединенных Наций) [58, 139, 153]. В последнее время в ряде арабских стран рождаемость начала снижаться (Рис. 1.1.) [139] .

Рисунок 1.1 .

Коэффициент рождаемости 1960-2014 (на 1000 населения) в Арабских странах Сирия - сердце Ближнего Востока. Политика Сирийского правительства поощряет ограничение размера семьи [60, 85], но социальные ценности, культурные нормы и религиозные верования выступают против таких ограничений. Тем не менее, воздействие западной идеологии привело к некоторым изменениям в семейной жизни в странах Ближнего Востока [61] .

По данным на декабрь 2010 года, распространенность контрацепции среди женщин репродуктивного возраста, состоящих в браке или в отношениях колеблется, в пределах 50,4% в Северной Африке (44,8% Современные методы контрацепции) и 55,1% в Западной Азии (35,8% Современные методы контрацепции) (рис. 1.2.) [79, 152] .

Рисунок 1.2 .

Процент использования современных методов контрацепции на Ближнем Востоке и в странах Северной Африки среди женщин в возрасте 15-49 лет, которые состоят в браке или в отношениях .

Во всех этих странах оральные контрацептивы, за исключением Египта, наиболее широко используемый современный метод контрацепции, особенно среди младшей возрастной группы. В Египте внутриматочная спираль (ВМС) является наиболее широко используемым современным методом контрацепции Также ВМС используют часть ( 2%) молодых женщин в Сирии, Иордании, Палестины и Ирака. Существует только одна страна, Джибути, где более 2% молодых женщин полагаются на мужской презерватив (Рис. 1.3.) [79] .

Рисунок 1.3 .

Процент использования современных методов контрацепции в странах Ближнего Востока и Северной Африки (в % от всех пользователей контрацепции) .

Контрацепция, используемая в Сирии: По данным литературы [39, 129, 133] в Сирии наблюдался один из самых высоких уровней рождаемости в мире, общий коэффициент рождаемости 3,0 и суммарный коэффициент рождаемости 24,4% в 2012 г. [152]. Коэффициент рождаемости на тысячу населения снизился от 48,2 в 1960 г. до 23,1 в 2014 г. [140]. Некоторые причины высокой рождаемости обусловлены самими женщинами (желание иметь много детей), а некоторые из-за системы здравоохранения (не информирование или предоставление некачественных контрацептивов) [133] .

Исследования показали, что примерно (24%) из опрошенных женщин не используют контрацепцию. Главная причина несогласие мужа, медицинские аспекты, в то время как отказ от контрацепции в связи с религиозными верованиями составляет лишь небольшой процент [13, 133] .

Использование контрацептивов характерно для городских женщин, в частности образованных. Кроме того, 52% женщин из сельских районов выступили против использования контрацептивов [85]. К 2010 году процент женщин, которые озабочены планированием семьи, вырос до 64%. Но есть еще 14,5% женщин, которые хотели бы избежать беременности, но не нашли подходящий метод контрацепции [13] .

Наиболее распространённый метод контрацепции в Сирии это ВМС (40%) и оральные контрацептивы (37%). Календарный метод также играет важную роль в предотвращении беременности, а мужская стерилизация занимает последнее место в списке методов контрацепции [13, 133] .

Некоторых женщин отталкивает использование ВМС из-за стоимости установки и мониторинга в частных клиниках [13]. Одной из причин не использования контрацептивов является их качество и устоявшееся мнение среди женщин о том, что контрацептивы в медицинских центрах некачественные, потому что они импортные. Мужской презерватив еще используется, но в небольшом проценте. Это связано, в первую очередь, с низким качеством презервативов, доступных на местном рынке и, как говорят женщины, отказ мужчин использовать их, а также ложные слухи о том, что это может вызвать инфекции [13] .

Те, кто живет в городах и принадлежит высокому социальноэкономическому уровню имеют возможность выбора поставщика контрацептивов, а также полный доступ к процедурам контрацепции; в то время, как жители сельской местности находятся в невыгодном положении и ограничены в выборе контрацепции, и, соответственно, в планировании семьи [85] .

Вагинальная система доставки лекарств 1.2 .

Изучение особенностей использования контрацептивных средств в Сирии показало, что есть неудовлетворенность в ассортименте и видах контрацептивных препаратов. В Сирии недостаточно вагинальных контрацептивов .

Вагинальные системы позволяют вводить противогрибковые, антибактериальные и спермицидные средства. Вагинальные ЛФ обладают рядом преимуществ, например, поступившие таким образом вещества минуют первый этап метаболизма, не требует дополнительных приспособлений, легко вводятся, экономичны. Но существуют и недостатки такие, как провоцирование зуда, раздражение влагалища, сложность применения и непродолжительное время пребывания в месте введения [25] .

Среди вагинальных контрацептивов имеются: вагинальные таблетки [115], вагинальный крем [158], вагинальная пена [57], вагинальный гель [43], вагинальные суппозитории [114]. Также в качестве средств контрацепции используются дозированные вагинальные формы с контролируемым высвобождением: управляемые вагинальные таблетки с замедленным высвобождением [94], вагинальное кольцо [95, 116], вагинальные микросферы [17], вагинальные наночастицы [59, 151], вагинальные пленки [71, 143] .

Вагинальные пленки:

Вагинальная пленка представляет собой твердую лекарственную форму, при контакте с вагинальной жидкостью быстро растворяется и не вытекает. Эта лекарственная форма была разработана как простой способ контрацепции и гигиены женских половых органов. Для получения качественной пленки требуются: правильно подобранный состав, сложные процессы для изготовления и валидация качества .

Научный прогресс в области полимеров помог создать тонкие и гибкие пленки, чтобы удовлетворить потребности и требования, предъявляемые к ним для использования в качестве системы доставки лекарственных средств [16, 30] .

Вагинальные пленки представляют собой полимерные системы, как правило, в форме квадрата, с гладкой и однородной поверхностью, размером 5-10 см, такие пленки могут быть применены без использования аппликатора. Для облегчения введения во влагалище, они могут складываться [49, 93] (рис. 1.4.) .

Рисунок 1.4 .

Вагинальная пленка (VCF): (а) сложенная пополам, (b) помещается над кончиком пальца и зажимается между соседними, для введения .

В состав влагалищных пленок входят действующие вещества и вспомогательные вещества: растворимые в воде полимеры, пластификаторы, наполнители, красители, и ароматизаторы [69]. Выбранные полимеры должны быть нетоксичны, не раздражать слизистую, полностью растворяться, должны обладают хорошими смачивающими свойствами и прочностью на разрыв; и быть недорогими в изготовлении. Полиакрилаты, полиэтиленгликоль, поливиниловый спирт и производные целлюлозы являются лучшим выбором для формирования вагинальных пленок [50] .

Такие параметры как механическая прочность и время дезинтеграции пленки зависят от типа полимера и его молекулярной массы. Пластификаторы (например, глицерин, полиэтиленгликоль), обеспечивают гибкость и гарантируют необходимые текстурные параметры пленок. Разрыхлители (например, кроскармеллоза натрия, ПВП), увеличивают скорость растворения, когда это требуется [54, 70] .

Получение пленок и их технологические характеристики:

Производство вагинальных пленок, как правило осуществляется методом выливания и состоит из шести этапов. Ниже приведены иллюстрации процесса (рис.1.5.) [93] .

–  –  –

1 - Приготовление массы для получения пленок; 2 - Переливание массу в форму; 3

- Процесс сушки; 4 и 5 - Нарезка отдельных пленок; 6 - Окончательная упаковка .

Изначально этот процесс требует подготовки массы пленки путем растворения или диспергирования лекарственного средства и вспомогательных веществ, в соответствующем растворителе. Этапы смешивания и гомогенизации могут привести к попаданию воздуха в массу, который может быть устранен с помощью центрифугирования или обработки ультразвуком [54, 70]. После получения массы пленки, ее выливают в подходящую форму, которая позволит равномерно распределить массу, а также позволит растворителю быстрее испаряться. Процесс сушки может происходить при комнатной температуре или быть ускорен путем прямого нагревания или вакуума в печи. Когда масса высыхает, можно начать стадию резки [16, 54, 70]. В альтернативном варианте, массу можно заливать непосредственно в индивидуальные формы [74]. Наконец, правильно подобранная упаковка обеспечивает необходимые условия хранения для использования в будущем [50, 69, 70, 156] .

Наиболее важные показатели качества вагинальных пленок это: гибкость (pliability), толщина (thickness), морфология (morphology), прочность (strength), эластичность (elasticity), содержание воды (water content), био-мукоадгезия (Bio/Mucoadhesion), индекс набухания (swelling index), угол контакта (contactangle), дезинтеграция пленки (film disintegration) / (erosion rate), содержание лекарственного средства, тест на однородность содержания (drug content and test content uniformity), высвобождение лекарственного средства (drug release), вязкость (viscosity), pH, исследования совместимости (compatibility studies), исследования стабильности (stability studies) [42, 68, 88, 98, 109] .

Рынок вагинальный пленок .

В европейском патентном ведомстве есть несколько патентов на вагинальные пленки. Это патент авторов Liu, XandKresevic, J. [92] 2009 года на вагинальную биоадгезивную пленку, в состав которой могут входить: эстрогены, антибактериальные препараты, спермициды, прогестины и их комбинации.

В качестве вспомогательных веществ используются: пленкообразующие полимеры:

ПВА, ПЭО, ГПЦ, ГЭЦ, МЦ, и ГПМЦ, коповидон, желатин, мальтодекстрин, ксантановая камедь, гуаровая камедь, полиметакрилатные, повидон, и их смеси;

биоадгезивные полимеры: производные полиакриловой кислоты, производные целлюлозы, вещества природного происхождения (например, хитозан, каррагинан, пектин, альгинат натрия, декстраны, желатин, гиалуроновая кислота и т.д.), а также смеси; другие вспомогательные вещества: глицерин, полиэтиленгликоль, пропиленгликоль, маннитол, сорбитол, дибутилфталат, трибутилцитрата, диметилфталат, пирролидоны, а также их смеси .

Автор Staab, R.J. [127], в 2009 году получил патент на пленку, регулирующую pH во влагалище. Ее рекомендуют применять как контрацептив, антисептик, или гомеопатический препарат. В ее состав входят полимеры / биоадгезивные вещества: ПВА, ПЭО, ГПМЦ, КМЦ и их смеси; а также другие вспомогательные вещества: регулирующие рН например, аскорбиновая кислота (витамин С); пластификатор (глицерин является предпочтительным) .

Jitian, Y. и Huiming, G. [83] в 2008 году получили патент на вагинальную пленку с лактобактериями /Lactobacillus. В качестве полимеров / биоадгезивных веществ, используются: ПВА, хитозан. Также в состав пленки входят другие вспомогательные вещества: эфир жирной кислоты, глицерин. Активным компонентом являются бактерии Lactobacillus. Эти пленки рекомендовано применять для профилактики вагинальных инфекций или восстановления флоры влагалища .

Авторами Leon, T. Gabel, P. [87] в 2004 году получен патент на пластичную растворимую пленку. В качестве полимеров / биоадгезивных веществ предлагается использовать: ПВС, метилцеллюлозу, ГПМЦ. Другие вспомогательные вещества, входящие в состав пленки: корригент запаха, смазочный материал (глицерин, гликоль, масла и их комбинации), растворители, консерванты, поверхностно-активные вещества. Эту пленку рекомендовано применять в качестве деозорирующей пленки (vaginal deodorizing film) .

На американском рынке есть одна вагинальная контрацептивная пленка, VCF (Dissolving Vaginal Contraceptive Films), которая содержит 70 мг .

Ноноксинола (Н-9) .

Поскольку вагинальные пленки являются перспективной лекарственной формой, удобной в применении, мы решили разрабатывать новый контрацептив для Сирийского рынка именно в виде вагинальных пленок. В качестве активного компонента необходимо использовать вещество спермицидного действия .

Обзор спермицидных агентов 1.3 .

Перечислить 1-6 по механизму действия .

1.3.1. Спермициды, действующие за счет изменения pН влагалища Один из самых старых подходов для достижения спермицидного действия является изменение рН влагалища. Сперматозоиды подвижны в диапазоне рН между 6,7 и 8,5. Нормальное значение рН для влагалища 3,8-4,2. Это естественная кислая среда, поддерживаемая и создаваемая, молочной кислотой, которая продуцируется вагинальной флорой. Когда сперма попадает во влагалище, его рН возрастает до 6,0 и выше, ввиду буферной активности эякулята (рН 7,2-8,0) [18] .

Хорошо известно, что сперматозоиды очень чувствительны к низким значениям рН, а кислотный раствор может иммобилизовать сперматозоиды в течение нескольких минут. В качестве веществ, снижающий значение рН влагалища используют: сок лимона, муравьиную кислоту и борную кислоту .

Лимонный сок использовался в качестве традиционного интравагинального контрацептива по всему Средиземноморскому региону в течение сотен лет .

Рисунок 1.6. Структура лимонной кислоты

Спермицидные свойства лимонного сока обусловлены высокой концентрацией лимонной кислоты. В исследованиях [45], было показано, что для необратимой иммобилизации 100% сперматозоидов требуется минимальная концентрация (200 мкл/мл) лимонного сока. Объем эякулята, в среднем, у мужчин, редко превышает 5 мл. По меньшей мере, 1,5 мл лимонного сока являлось бы достаточным для получения необходимой концентрации его во влагалище .

Acidform:(Amphora™; Evofem Inc., San Diego, CA, США), препарат

муравьиной кислоты,является одним из нескольких окисляющих агентов которые в настоящее время находятся в стадии разработки [31]. Acidform – спермицидное средство, представляет собой кислотный, буферный, вагинальный препарат, который поддерживает кислый рН влагалища ниже 5,0 при аккумуляции эякулята во влагалище или при попадании инфекции. У женщин, желаемая кислотность может достигаться 3-5 мл ацидоформа. Ввиду того, что единовременный объем эякулята в среднем составляет 3 мл, потребуется менее 1 мл ацидоформа, чтобы буферизовать сперму до pH менее 5,0. Недавно завершена I фаза клинических исследований безопасности ацидоформа, подтверждающая его безопасность. Не было зарегистрировано ни одной жалобы пациентов при применении ацидоформа интравагинально в течение 6 последующих дней, а также не отмечалось раздражения шейки матки или влагалища при осмотре или кольпоскопии [21] .

Acidform- бактерицидное средство, которое демонстрирует in vitro спермицидную и антибактериальную активность против некоторых возбудителей ЗППП, таких как (Neisseria gonorrheoae) и (Chlamydia trachomatis) .

Борная кислота (влагалищные свечи Контрацептин Т НИЖФАРМ ОАО, Россия). В состав Контрацептина-Т входит борная кислота. Также КонтрацептинТ включает в себя противомикробное (оксихинолин) и вяжущее (танин) вещества .

Контрацептин-Т не содержит гормонов [7] .

1.3.2. Синтетические поверхностно-активные вещества Являются наиболее распространенной и доступной группой вагинальных контрацептивов, но несмотря на это, имеют ограничение в использовании .

Неионные поверхностно-активные вещества Ноноксинол (Nonoxynol): Патентекс Овал Н (Мерц Фарма Гмб Х и Ко .

КГаА, Германия), Ноноксинол (Альтфарм, Россия), Тудэй (Bliss GVS pharma Ltd, Индия). В категории не ионных поверхностно-активных веществ октоксинол и ноноксинол являются двумя широко известными ПАВ. Ноноксинол является более мощным спермицидом, чем октоксинол. Ноноксинол (Н-9) разрушает клеточные мембраны шейки сперматозоидов, при дозе 50 мкг / мл иммобилизует движение сперматозоидов в течение одной минуты. Хотя, Н-9 используется в качестве контактного спермицида уже более 30 лет и хорошо переносится .

Однако появились данные, указывающие на то, что частое использование поверхностно-активных спермицидов может вызывать раздражение слизистой влагалища и поражать эпителий .

Одним из самых частых осложнений, вызываемых применением Н-9, является деэпителизация шейки матки и стенок влагалища, хотя возникновение воспалительных изменений отмечено не было [82] .

Катионные поверхностно-активные вещества

Бензалкония хлорид: Фарматекс (Laboratoire Innotech International,

Франция). Фарматекс выпускают в нескольких формах — в виде вагинальных свечей (имеют форму шарика), крема, вагинальных таблеток и тампонов .

Бензалкония хлорид является бактерицидным катионным ПАВ, производным аммония, который купирует подвижность сперматозоидов сразу после контакта со спермой. В течение 4 секунд после контакта бензалкония хлорида со спермой, средняя часть сперматозоида и его головка разрушаются. Слизистая оболочка влагалища при этом не повреждается. Погибшие сперматозоиды механически препятствуют продвижению остальных, сохранивших подвижность. Но даже те сперматозоиды, которые проникли через двойной барьер (химический и механический), встречают третье препятствие в виде свернувшейся от воздействия бензалкония хлорида слизи, в наружном отверстии шейки матки, обычно значительно облегчающей продвижение сперматозоидов собственно в полость матки .

Недостатками бензалкония хлорида являются аллергические реакции, зуд и жжение во влагалище, отмечаемые примерно у 8 % женщин, а также контактный дерматит [3, 12] .

Этоний (Фармак, Украина; Лубныфарм, Украина): Этоний - 1,2-этилен-бисN-диметилкарбдецилоксиметил) аммония дихлорид, ранее известный как антисептик с противогрибковым (в отношении Candida) и антимикробным действием и как ранозаживляющее средство .

В настоящее время этоний используется в качестве антимикробного, противовоспалительного и стимулирующего репаративные процессы средства для лечения трещин сосков, вульвовагинитов, зудящих дерматозов, проктитов и сигмоидитов. В качестве спермицидного средства до настоящего времени этоний не использовался. В результате последующих исследований этония обнаружено спермицидное действие, что открывает возможность использования этого препарата в качестве местного противозачаточного средства отечественного производства. Водные растворы этония в концентрации 0,5% вызывают мгновенную гибель сперматозоидов, при этом отмечается полное отсутствие подвижных, активно подвижных и живых сперматозоидов, что свидетельствует о спермицидной активности 0,5% водных растворов этония [2] .

1.3.3. Спермициды с дополнительной антимикробной активностью Хлоргексидин: Хлоргексидина биглюконат - 1,6 Бис - [5 –(пара-хлорфенил)

- бигуанидо] – гексана биглюконат, относится к поверхностно-активным соединениям. Хлоргексидина биглюконат (ХГБ), адсорбируясь на поверхности клеток, изменяет её осмотическую регуляцию, увеличивает проницаемость мембран, блокирует внутриклеточные ферменты, вызывает осаждение белков и нуклеиновых кислот и является одним из наиболее активных местных антисептических средств (БИОГЕН НПЦ, Россия) .

Значимость ХГБ как спермицидного средства объясняется его эффективностью в отношении возбудителей венерических болезней: трепонем, гонококков, трихомонад. Хлоргексидин проявляет спермицидную активность в дозе 4,81 мг/мл в течение 20 с., однако отмечается гиперчувствительность к хлоргексидину при местном применении [122] .

Низин (доклинические исследования): Низин- антимикробный катионный пептид, состоящий из 34 аминокислот, продуцируемый бактериями Lactococcus lactis .

Низин используется в качестве консерванта пищевых продуктов во всем мире [24]. Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ), а также Американская Ассоциация Продовольствия и лекарственных средств (FDA), присвоили этому пептиду статус GRAS - в целом признан как безопасный. При дозе 300-400 мкг, наблюдается полное обездвиживание сперматозоидов течение 20 сек. Низин не изменяет морфологию эпителиальных клеток влагалища, а также не вызывает никаких гистологических повреждений в эпителии влагалища при интравагинальном введении в течение 14 дней подряд [24] .

Производные зидовудина (доклинические исследования): Зидовудин 3'азидо-3'-дезокситимидин, сам по себе обладает недостаточной спермицидной активностью. Два его новых производных фенил фосфата WHI-05 [5-бром-6метокси-5,6-дигидро-3'-азидотимидин-5'-(п-метоксифенил) метоксиаланил фосфат] и WHI-07 [5-бром-6-метокси-5,6-дигидро-3'-азидотимидин-5'-(пбромфенил) метоксиаланил фосфат], определены как вещества, проявляющие сильную анти-ВИЧ и спермицидную активность .

В отличие от Н-9, спермицидная активность WHI-05 и WHI-07 не связана с цитотоксичностью к эпителиальным клеткам репродуктивных органов [52] .

1.3.4. Разжижающие вещества Высокоэффективное разжижающее свойство представлено ртутью (2,7 мг/мл), нитрофенолом (6,9 мг/мл), нафтила фосфатом натрия и дубильными кислотами. Эти активные вещества обладают способностью мгновенно коагулировать эякулированную сперму, вероятно, посредством денатурирующего влияния на гликопротеины. Тем не менее, индекс безопасности разжижающих агентов в настоящее время слишком мал, чтобы разрешить их использование в фармацевтических препаратах in vivo [122] .

1.3.5. Ионофоры Ионофоры это соединения, которые образуют жирорастворимые комплексы со специфическими катионами и выступают в качестве проводников для транспорта этих катионов через биологическую мембрану. Ионофор кальция, А23187, увеличивает концентрацию внутриклеточного кальция и ингибирует подвижность сперматозоидов человека, в концентрации 20 мкм/мл в течение 120 сек. Тем не менее, местные эффекты ионофоров на ткань влагалища, а также их системные эффекты после всасывания в кровяное русло еще не изучены [56] .

1.3.6. Природные поверхностно-активные вещества: сапонины Сапонины являются естественными поверхностно-активными веществами, они часто встречаются во многих растениях. Сапонины обладают спермицидным действием. Общий липидный бислой, который содержит внешние, внутренние и трансмембранные белки, является основным признаком плазматической мембраны сперматозоидов. Молекулы сапонинов взаимодействуют с липидным бислоем, оказывая влияние на гликопротеины клеточной мембраны и изменяют ионный трансмембранный транспорт, что приводит к изменениям поверхности .

Эти изменения, а именно везикуляция, вакуолизация или распад в области головки могут возникать из-за растяжения, ослабления, разрыва мембраны и окончательного удаления акросомы [48, 105, 117] .

Растения, сапонины которых используются в качестве спермицидных средств:

Acacia auriculiformis (A. Cunn. Ex Benth.): Смеси двух частично изолированных тритерпеноидных сапонинов из порошка семян Acacia auriculiformis (Acaciaside А и В) показали спермицидную активность в концентрации 0,35 мг/мл. Электронно-микроскопическое наблюдение показало, что происходит дезинтеграция плазматической мембраны и полное растворение акросомной части сперматозоида [72, 103] .

Sapindus mukorosii (Gaertn.): синонимы: reetha, рехта: препарат - CONSAP (Hindustan Latex Limited, Индия). Сапонины, выделенные из Sapindus mukorosii, показали самое сильное спермицидное действие. Эти сапонины представляют собой мукоросиевые сапонины Е1, G, X, Y1, Y2, Z1 и Z2. Не было обнаружено никаких морфологических изменений после инкубации сперматозоидов с сапонинами в концентрации 0,5 мг/мл в течение 1 мин, хотя в той же концентрации наблюдалась иммобилизация сперматозоидов. При более высоких концентрациях сапонинов (1-50 мг/мл) сперматозоиды подвергаются заметному разрушению, вакуолизации, везикуляции и эрозии мембраны, покрывающей область головки. Сапонины, выделенные из Sapindus mukorosii были включены в контрацептивный крем под названием CONSAP. Этот крем успешно завершил III этап клинических испытаний в Индии [131, 144] .

Molluga pentaphylla (Linn.): Тритерпеноидный сапонин Моллугогенол-А продемонстрировал спермицидную активность в концентрации 300 мкг/мл .

Электронная микроскопия показала фрагментацию или потерю плазматической мембраны, везикуляцию периакросомальной мембраны и растворения органелл в целом, демонстрируя дегенерацию сперматозоидов [112, 125] .

Другие растения, содержащие сапонины, обладающие спермицидной активностью: Phytolacca dodecadra (L’ Herit), Calendula officinalis (L.), Acacia caesia (L.), Acacia concinna (Willd.), Trigonella foenum-graecum (L.), Chenopodium album (L.) and Cestrum parqui (L’ Herit) [122] .

Gossypium species L. Препарат Госсипол (Shaanxi Sinuote Biotech Co., Ltd, Китай: порошок) (TimTec, США: порошок): Госсипол-дизесквитерпен альдегид, выделенный из семян хлопчатника (Gossypium species L.), заявляется как спермицидный агент. Концентрация, необходимая для иммобилизации 100% сперматозоидов в течение 20 с., составляет 40 мг/мл. Госсипол ингибирует подвижность сперматозоидов, блокируя образование и потребление АТФ. Он воздействует на митохондрии, подавляя потребление кислорода, ингибируя активность пируватдегидрогеназы и АТФазы. Госсипол был оценен в качестве местного спермицида. Тем не менее, эти исследования, как представляется, не были продолжены, и госсипол продается на рынке в качестве лекарственного сырья [73] .

Многие БАВ показали высокую спермицидную эффективность, но до сих пор они не прошли достаточные клинические испытания, например БАВ из таких растении как: Aloe barbadensis, Azadirachta indica, Allium sativum, Curcuma longa, Stephania hernandifolia и Achyranthes aspera, экстракт семян Carica papaya, комплексные растительные препараты Праним (Praneem polyherbal cream - Индия, Национальный институт иммунологии), и также парабены (метилпарабен, этилпарабен, пропилпарабен и бутилпарабен), цинка ацетат, гели-микроэмульсии [122] .

1.4. Сапонины - их классификация, химическое строение и свойства Роль сапонинов в природе: Сапонины присутствует в растениях и других организмах. Они известны своей множественной фармакологической активностью [104, 132, 145, 149]. Название происxодит от латинского сапо (sаpо)

– мыло [35], что характеризует поверxностно-активные свойства этих веществ и иx способность образовывать пену [46, 63, 101, 102] .

Химическая структура: Сапонины являются гликозидами с высокой молекулярной массой и состоят из полициклической агликоновой части, соединенной с одним или несколькими сахарными остатками обычно это (Dглюкоза, D-галактоза, D-ксилоза, L-арабиноза, L-рамноза, L-фруктоза, Dглюкуроновая и D-галактуроновая кислоты). Агликон - часть, которая также называется сапогенин, представляет собой либо тритерпен (С30) (а), либо стероид (С27) (б) либо стероидный алкалоид (с) [14, 78, 81, 118] .

Б A c Рисунок 1.7. Химические структуры агликонов сапонинов a- тритeрпeн, б- стероид, c- cтeрoидный aлкaлoид

Физико-химические свойства сапонинов:

Физические свойства: Сапонины - бесцветные или желтовато-белые аморфные вещества. В кристаллическом состоянии выделены гликозиды, имеющие в углеводной цепи до 4 моносахаридов. Сапонины обладают жгучим раздражающим вкусом и вызывают раздражение слизистой, покраснение глаз и аллергию. Вещества оптически активны .

Растворимость в воде как стероидных, так и тритерпеновых сапонинов, зависит от числа сахарных остатков: при 4 и более - хорошо растворимы в воде;

при 2 - 4 - плохо растворимы в воде, но хорошо в метаноле, а также в (60-70%) спиртах даже при низких температурах, а в больших концентрациях этих спиртов (80-95%) – только при нагревании, а при охлаждении они выпадают в осадок .

Нерастворимы в эфире, бензоле, ацетоне, хлороформе и других органических растворителях. Свободные сапогенины не растворяются в воде и хорошо растворимы в органических растворителях .

В зависимости от рН водных растворов сапонины подразделяется на:

Нейтральные - стероидные и тетрациклические тритерпеновые сапонины;

Кислые - пентациклические тритерпеновые сапонины. Их кислотность обусловлена наличием карбоксильных (-СООН) групп в структуре агликона и присутствием уроновых кислот в сахарных остатках [9, 10] .

Химические свойства: Сапонины гидролизуются под влиянием ферментов и кислот. Производные мевалоновой и глицинритиновой кислот гидролизуются под воздействием щелочей. При взаимодействии с кислотными реагентами (SbСl 3, SbСl5, FеС1з, конц. H2SО4) образуют окрашенные продукты. Кислые сапонины образуют нерастворимые комплексы с солями тяжелых металлов (Ва, РЬ) .

Сапонины способны образовывать комплексы с белками, стеринами, липидами, фенольными соединениями [29, 134]. В составе комплексов сапонины не обладают гемолитической и поверхностной активностью [53, 128, 148] .

Сапонины, имеющие в своей основе стероидное ядро, вступают в специфическую реакцию Либермана-Бурхарда [9, 10] .

Пенное число: Это наименьшая концентрация извлечения из 1 г. сырья, при встряхивании которого в течение 15 с. образуется пена, устойчивая в течение 15 мин .

Гемолитический индекс -наименьшая концентрация извлечения из 1 г .

сырья или раствора чистого сапонина, которая вызывает гемолиз эритроцитов, содержащихся в 1 мл 2% раствора дефибринированной крови барана. Извлечение сапонинов и разведение проводят изотоническим раствором. Готовится серия разведений и определяется наименьшая концентрация. При работе с кровью других животных параллельно ставят контроль со стандартным сапонином (0,02 % раствор дигитонина). Результаты выражаются соотношением массы сырья (1 г.) к разведению. Напр. 1 : 5000, 1 : 20000 и т.д .

Извлечение и анализ сапонинов: Методы экстракции сапонинов из свежего и из высушенного сырья отличаются. Процесс экстракции из высушенного сырья является сложным и состоит из диализа, растворения и диффузии, протекающих одновременно .

Сапонины образуют не растворимые в воде молекулярные комплексы со стеринами, липидами, дубильными веществами, белками. Эти комплексы разрушаются при нагревании с хлороформом. Поэтому перед выделением сапонинов из сырья, его рекомендуют предварительно экстрагировать хлороформом в аппарате Сокслета в течение 2 часов. Процесс выделения сапонинов состоит из нескольких стадий: экстракция сапонинов из сырья, очистка полученного извлечения, разделение на индивидуальные компоненты .

Экстрагируют сапонины полярными растворителями: метанолом и спиртом различной концентрации, водой, 0,9%-ным раствором натрия хлорида. Иногда сырье перед экстракцией обрабатывают петролейным эфиром, четыреххлористым углеродом, диэтиловым эфиром для разрушения нерастворимых в полярных растворителях комплексов сапонинов со стеринами, белками, фенольными соединениями. Очистку полученных извлечений проводят различными способами, это зависит от структуры сапонинов .

Полярные сапонины плохо растворимы в этиловом и метиловом спиртах, выпадают в осадок при охлаждении, длительном стоянии спиртового экстракта или при добавлении этанола .

Гликозиды с небольшой углеводной цепочкой обычно плохо растворимы в воде и выпадают в осадок при разбавлении спиртовых экстрактов водой .

Кислые тритерпеновые сапонины растворимы в водных растворах щелочей и выпадают в осадок при подкислении. Также, из спиртовых растворов тритерпеновые сапонины можно осаждать диэтиловым эфиром, ацетоном, этилацетатом, иногда бутиловым и изоамиловым спиртами .

Полученные сапонины очищают от полярных сопутствующих веществ:

моно- и олигосахаридов, фенольных соединений, органических кислот и др .

повторным переосаждением [5, 8] .

Значительное распространение нашли хроматографические методы очистки суммы сапонинов. Гликозиды, содержащие свободные карбоксильные группы, могут быть отделены от сопутствующих веществ, в том числе и от минеральных примесей, с помощью ионообменной хроматографии. Хроматографическую очистку суммы сапонинов проводят на оксиде алюминия, силикагеле, активированном угле [4] .

Распространение в природе: Сапонины достоверно обнаружены в представителях примерно 40 семейств растений. Более широко распространены тритерпеновые сапонины. Чаще всего они встречаются у растений сем .

Саrуоphуllасеае, Fаbасеае (солодка, астрагал шерстисто цветковый) [64], Аrаliасеае (женьшень, аралия маньчжурская) [27, 41, 86, 91], Hippосаstаnсеае (каштан конский), Pоlуgоnасеае (сенега), Rоsасеае (лапчатка прямостоячая, кровохлебка лекарственная), (календула лекарственная), Аstеrасеае (Синюха голубая) [20, 34, 99], (Ортосифон Polemoniceae Lamiceae тычиночный), Polygalceae (Истод тонколистый), Papilonaceae (Астрагал шерстистоцветковый) и др. Стероидные сапонины чаще встречаются у растений сем. Diоsсоrеасеае (диоскорея ниппонская, диоскорея дельтовидная) [15, 22, 28], Аgаvасеае (агавы, юкки), Liliасеае (ландыш), Sсrоphulаriасеае (наперстянки), Zуgоphуllасеае (якорцы стелющиеся) [38, 75, 113] и др. [5, 8, 55, 100, 126] .

1.5. Стиракс лекарственный (Styrax officinalis L.), как источник сапонинов Систематика Отдел: Magnoliophyta Семейство: Styracaceae Класс: Magnoliopsida Род: Styrax Порядок: Styracales Вид: officinalis L .

Народные названия: Франция: Aliboufier, Италия: Storace, Англия: Storax, Германия: Styrax, Россия: Стирах, Арабские страны: Abhar; Istark; Hoz; Lbna;

maiha [130, 138] .

Семейство стираксовое насчитывает 11 родов и около 180 видов. Они наиболее широко представлены в Восточной и Юго-Восточной Азии, особенно в Китае. Самым известным представителем этого семейства является род стиракса, более распространенный и насчитывающий около 130 видов. Многие виды стиракса служат источником ароматной бензойной смолы, применяемой в медицине и косметологии [67, 47, 106] .

Вид - стиракс лекарственный (Styrax officinalis L.):Стиракс лекарственный широко распространен в таких странах Средиземноморья как Италия, Греция, Турция, Сирия и Палестина [33, 67, 142] и на юго-востоке Франции [51, 62, 89]. В калифорнийских регионах Styrax officinalis L. раньше не выделялся как подвид, но исследования доказали, что стиракс лекарственный калифорнийский является отдельным подвидом [66, 65] .

Описание. Невысокое дерево (от 4 до 6 метров). Листья простые, круглой или овальной формы, белые, опушенны с нижней стороны волосками. Дерево цветет в конце весны (с апреля по июнь). Цветы маленькие белые. Число лепестков 5 - 8. Чашечка зеленая, венчик белый. Размер цветка 20 мм. Число тычинок 8-16. Большое количество нектара в цветах привлекает к ним насекомых .

Поэтому дерево известно, как медоносное. Плоды созревают с сентября по ноябрь [135, 130]. Сначала они зеленые, а потом желтеют. Плод стиракса покрыт волосками и имеет форму шара диаметром в 15 мм с заостренной вершиной .

Внутри плода одно коричневое семя, которое окутано зеленой пульпой, очень горькой на вкус [80, 96, 138] .

В литературе есть данные о том, что пульпа плодов является токсичной для рыбы, мышей [26, 76] и улиток [40, 97, 123, 137]. Также плоды использовались при изготовлении яда для. Водно-спиртовые экстракты стиракса лекарственного токсичны в больших дозах и показали противоопухолевую активность [142, 141, 150] (Рис. 1.8.) .

Рисунок 1.8. Стиракс лекарственный (Styrax officinalis L.)

В литературе существуют противоречивые данные о смоле стиракса лекарственного. Polunin et al. (1965) и Y. Vardar et al. (1973) сообщали, что стиракс лекарственный известен своей смолой с древних времен, ее использовали римляне, египтяне и финикийцы в качестве благовония и лекарства. Однако в настоящее время смола стиракса используется только в римско-католических Церквях в Европе [110, 147]. Dalal Ibrahim et al. (2011) установили, что смола, которая выделяется из ствола, применяется для лечения инфекций кожи и входит в состав лекарственных средств от кашля [80]. А другие ученые придерживаются противоположного мнения: Adel Mohammed et al. (2007) считает, что стиракс не имеет смолы [96]. В работе Ибн аль-Байтара (1197-1248 гг.) говорится, что стиракс в Сирии называется (Abhar, Al-istark и Al-maiha), и что это дерево вообще не имеет камеди или смолы [37]. В статье Vincent Blondel (2016) об использовании стиракса написано: «мне кажется, что aliboufiers / Styrax officinalis L. не имеют смолу» [130] .

В русской литературе можно встретить название “стиракс”, но оно указывает на другие виды стиракса или продукцию на их основе.

Род стиракс насчитывает более 130 видов, три из которых служат основой для производства растительного фиксатора запахов в парфюмерной промышленности России:

Styrax tonkinensis, Styrax benzoin и Styrax benzoides. При повреждении их коры выделяется ароматическая камедь. Все вышеперечисленные виды получили одно и то же название стиракс [6] .

Химические исследования частей растений:

1. Содержание тритерпеновых сапонинов в околоплоднике:

В ходе изучения околоплодников стиракса, были выделены тритерпеновые сапонины [155, 120, 121]. Сапогенин стиракса было 21-бензоил барингтогенол С (21-benzoy barringtogenol C) [23, 120]. В 2002 году Yayla et al. опубликовал исследование о выделении и идентификации сапонинов-стиракса (A, B, C и дезацилсапонин стиракса) из околоплодников стиракса лекарственного. Их структура была изучена с помощью ЯМР и масс-спектрометрии [155] .

Сапонин стиракса А является аморфным порошком с эмпирической формулой C61H96O27. Химическое название сапонина А (22-O-ацетил- 21- O- тиглил-3- Oрамнопиранозил(12)- глактопиранозил (12)]-[-DD- глюкопиранозил(14)]--D- глюкуронопиранозилбарингтогенол C) .

Сапонин стиракса B был выделен в виде аморфного порошка. Сапонин В имеет на 22 массовые единицы больше, чем сапонин А. Эмпирическая формула Сапонина В - C63H94O27. Химическое название сапонина B (22-Oацетил бензоил - рамнопиранозил(12)--DO- -3-O-[- галактопиранозил(12)]-[-D- глюкопиранозил (14)]--Dглюкуронопиранозилбарингтогенол C) .

Сапонин стиракса С имеет эмпирическую формулу C62H98O27 и химическое название (22-O- ацетил-21-O-(2- гексеноил)-3-O-[- - рамнопиранозил(12)D-галактопиранозил(12)]-[-D- глюкопиранозил (14)]--Dглюкуронопиранозилбарингтогенол C) [155] .

Рисунок 1.9 .

Структурные формулы сапонинов стиракса (A, B, C) и дезацилсапонин стиракса [155] Сапонин А является очень сильным пенообразователем, он обладает высокой гемолитической активностью в концентрации равной 1,42 мкг/мл (50% эритроцитов человека гемолизируется). Сапонин B не имеет гемолитической активности в тест-системах in vivo [120, 119] .

2. Состав эфирного масла листьев, стеблей и цветков стиракса лекарственного:

Эфирное масло содержит терпеноиды, которые были получены из листьев (42,2%), из стеблей (41,2%) и из цветков (48,7%). Основные компоненты эфирного масла листьев: (Е)-2-гексенала 17,6%, линалоол 11,9% и гераниал 5,5% .

Линалоол является основным компонентом (26,4%) в эфирном масле цветков .

Также там содержатся: тридеканал (9,8%) и додекане (9,6%); в то время как терпинеол (17%) и эвгенол (9,9%) являются основными компонентами эфирного масла стеблей [135, 136] .

В состав эфирного масла листьев стиракса лекарственного входят: (Е)-2гексенал, гексанол, а-пинен, 6-метил-5-гептен 1, (Е)-2-гептенол, октанал, (Е, Е)гептадиен, лимонен, бензиловый спирт, октанол, транс-линалоол оксид, 2,3октадиенон, линалоол, нонанал, 2-фенилэтанол, этилбензоат и другие [135, 136, 111]. Результаты ГХ показали, что (Е)-2-гексенал, октанол и гераниол были основными компонентами в этом эфирном масле [135] .

3. Химический состав эндокарпия:

Из эндокарпа были выделены пять компонентов: американин А, эгонололиат, эгонол-2'''-метил бутаноат, эгинолгентиобисайд и гомоэгонолгентиобисайд [107, 90, 108, 154] .

4. Липофильная фракция семян стиракса лекарственного:

Hocking (1955), Zeybek (1963), Kayacik (1966) andBaytop (1967) сообщили, что в стираксе лекарственном очень высокий уровень содержания масла в семенах [32, 77, 84]. Жирное масло стиракса - это вязкая жидкость, желтоватого цвета, без запаха, со специфическим вкусом. Это масло можно использовать в мыловаренной промышленности и на некоторых пищевых производствах. Тем не менее, из-за низкого йодного числа его нельзя использовать в индустрии красителей [147]. Характеристики масла стиракса: число омыления 182; йодное число 72; кислотное число 2,43; показатель преломления 1,48 [146, 147] .

В работе Yayla Y. и Anil H., вместе с четырьмя компонентами, известными ранее, были изолированы два новых бензофуранов компонента [154] .

Характеристика и активность БАВ стиракса лекарственного (Styraxofficinalis L.):

1- Противогрибковая активность сапонина А стиракса лекарственного исследована на растительных патогенах Была изучена противогрибковая активность сапонина А из стиракса и производного из него сапонина (В) на нескольких патогенах растений. Сапонины продемонстрировали активность против Триходермы зеленой (Trichoderma viride), Фузариума (Fusarium oxysporum), Аспергилла чёрного (Aspargillus niger) и (Rhizopus mucco). Но в тестируемой концентрации у сапонина В была низкая активность только на Триходермы зеленой (Trichoderma viride) [157] .

2- Эффективность против свекловичного блошиного жука (Chaetocnem эффективность экстракта черешков и листьев стиракса

atibialis):

лекарственного была проверена в тесте против свекловичного жука (Chaetocnem atibialis) (Illiger) в течение 2008 и 2009 годов, результаты показали, что экстракт стиракса лекарственного, который содержит бензоин и формальдегид, проявляют среднюю эффективность (31,35%) [19, 36, 124] .

ЗАКЛЮЧЕНИЕ ПО ГЛАВЕ 1

Анализ литературы по проблеме использования контрацепции в Сирии и странах Ближнего Востока показал, что большая часть женщин полагается на традиционные методы такие, как прерывание полового акта, отказ от сексуальных отношений во время овуляции и в период лактации. Высокий процент женщин в Сирии, неудовлетворенных методами контрацепции, свидетельствует о необходимости совершенствования лекарственной помощи, в частности, разработке препаратов для местного применения, соответствующих реальным потребностям женщин и пожеланию мужей .

Одной из современных лекарственных форм для вагинального применения являются пленки. Анализ литературы показал, что данная лекарственная форма только начинает завоевывать рынок средств для контрацепции. В фармакопеях всех стран отсутствует информация о вагинальной лекарственном форме - пленки .

Поэтому разработка состава и технологии получения вагинальных пленок является актуальной .

Были изучены данные литературы о свойствах сапонинов. Многие авторы показали, что эти соединения обладают спермицидной активностью. В Государственном реестре лекарственных средств РФ и за рубежом отсутствуют спермицидные препараты, содержащие сапонинов стиракса лекарственного .

Поскольку данное растение произрастает на территории Сирии, и по данным литературы содержит сумму сапонинов в околоплодниках, мы выбрали его в качестве объекта нашего исследования. Околоплодники стиракса лекарственного

- перспективный вид сырья – отечественный источник сапонинов для производства местных контрацептивных средств .

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Экспериментальные исследования проведены на базе кафедры общей фармацевтической и биомедицинской технологии и ЦКП ФГБАОУ «Российский университет дружбы народов» Министерства образования и науки Российской Федерации .

Дизайн диссертационного исследования представлен в блок-схеме на рисунке 2.1 .

–  –  –

Рисунок 2.1 .

Дизайн диссертационного исследования .

2.1. Материалы исследования Объектом исследования являлось растительное сырье - околоплодники дикорастущего многолетнего кустарника или невысокого дерева стиракса лекарственного Styrax officinalis L., собранные в Сирии с августа по октябрь в 2014-2016 гг. в качестве источника активных фармацевтических субстанций (АФС) .

Идентификация растительного материала была проведена профессором Юсефом АЛ-Амори (Yousef AL-Amori), отдел ботаники, фармацевтического факультета, Университет аль-Баас – Сирия, а также профессором Рамезом Рустом (Ramez Roustom), отдел фармакологии, генеральный директор фармацевтической компании LEM Ltd Сирия. Сертификат анализа – таксономическая идентификация растительного материала (Приложение № 1) .

В экспериментальной работе использовались околоплодники Styrax officinalis L., измельчали свежее сырье на электрической мясорубке Nova Meat Grinder (Китай), а сухое на аналитической мельнице Ika (Германия). Сушку сырья проводили воздушно–теневым способом (ГФ XIII, Общие методы анализа) номинальная скорость вращения 28000 об/мин. при температуре 25°С, полезный объем макс. 80мл. Измельченные сухие частицы просеивали через ряд 5 сит с различным размером отверстий от 2,50 мм до 0,25 мм. Использованные сита отвечают требованиям ТУ 23.2.2068-89 .

В работе использовали стандартный образец - Purified Quillaia Saponin HRS (EP standart), производства (Sigma-Aldrich, Германия) .

Вспомогательные вещества (ВВ): полимер акриловой кислоты Carbopol™ 980 NF, Carbopol™ ETD 2020 NF (Lubrizol, США), Метилцеллюлоза (МЦ-100) (Benecel A15C Pharm, Великобритания), полиэтиленгликоль ПЭГ-1500, ПЭГ-400, ПЭГ-6000 (Dow Chemical, Германия), Спирт поливиниловый (ПВС) Mowiol ® 6-98 (Sigma-Aldrich, Германия ) .

–  –  –

2.2. Методы исследования 2.2.1. Фармакогностический анализ сырья Макроскопический анализ сырья стиракса лекарственного выполняли визуально. Фотографии делали с помощью цифрового фотоаппарата CasioExlim 16,1 Мп, зум 5x (оптический), 4x (цифровой), 4,6-23,0 mm, 1:3,2-6,5.Размеры определяли с помощью линейки или сантиметровой ленты используя методику ГФ XIII.Фотографии обрабатывали в программе AdobePhotoshop CS6 .

Микроскопический анализ цельного сырья проводили согласно статье ОФС.1.5.3.0003.15 «Техника микроскопического и микрохимического исследования лекарственного растительного сырья и лекарственных растительных препаратов» ГФ XIII изд. на микроскопе Ломо, МИКМЕД (Россия) .

Были приготовлены поверхностные, продольные и поперечные срезы семян, семенной кожуры и околоплодников Styrax officinalis L .

Изготовлению микропрепаратов предшествовал этап размачивания, состоящий из помещения исследуемых растительных образцов на сутки в воду, затем в смесь глицерин : вода : этанол (1 : 1 : 1) на 3 суток .

Микропрепарат экзокарпа получали, отрезая с помощью скальпеля или лезвия узкие лоскуты околоплодника, шириной около 2 мм, движением от верхушки к основанию плода, после чего осторожно снимали тонкий слой экзокарпа, как можно полнее отделяя его от ткани мезокарпа. Полученные срезы быстро переносили на предметное стекло и добавляли каплю воды или раствора хлоралгидрата, осторожно расправляли препаровальными иглами и накрывали покровным стеклом .

Микропрепараты мезокарпа готовили с помощью препаровальной иглы и пинцета. Кусочки мякоти плода помещали на предметное стекло в каплю раствора хлоралгидрата или воды, осторожно прижимали препаровальной иглой, после чего накрывали покровным стеклом .

Для изготовления микропрепарата из семенной кожуры необходимо иметь под рукой нож или ножницы, пинцет и препаровальные иглы. Поскольку семенная кожура стиракса остаётся очень твердой даже после недели вымачивания в растворе (глицерин : вода : этанол) (1:1:1), невозможно делать срезы, поэтому при помощи ножа или ножниц отламывали маленькие кусочки которые помещали в каплю воды или раствора хлоралгидрата .

Наличие крахмала определяли обрабатывая микропрепататы раствором Люголя .

Обнаружение жирных масел проводили под микроскопом по реакции окрашивания с раствором Судана III: готовые срезы помещали в 2 -3 капли раствора Судана III, накрывали покровным стеклом и нагревали .

Микроскопический анализ анатомических особенностей плодов стиракса лекарственного проводили с помощью микроскопа «Ломо, МИКМЕД – 1» с объективами х 3,2; х 9; х 40; и окуляром 10х. Микрофотосъемка проводилась с помощью цифрового фотоаппарата Canon powershot A85 – Ai AF (zoomlens 3xmm, 4,0 mega pixels) на микроскопе с различными объективами .

Фотографии обрабатывали в программе Adobe Photoshop CS6 .

Изучение анатомии высушенных плодов стиракса лекарственного В Государственной фармакопее издания описана техника XIII микроспопического анализа ЛРС методом оптической микроскопии (ОМ). Для более подробного и углубленного изучения анатомических особенностей в строении плодов стиракса лекарственного мы, помимо оптической микроскопии использовали сканирующую электронную микроскопию (СЭМ) .

В настоящее время, в НД на ЛРС, принято приводить в качестве материала микрофотографии [1]. Анализ научной литературы и нормативной документации по ЛРС показывает, что фотографии имеют большую практическую ценность и, что, немаловажно, должны в обязательном порядке быть снабжены информацией об использованных объективах и окулярах, т.е. об увеличениях [11]. При умножении увеличения объектива на увеличение окуляра рассчитывается общее увеличение, оно и подписывается на все публикуемые рисунки и фотографии .

Также с применением цифровых фотоаппаратов нужно обязательно учесть увеличение объектива фотоаппарата для расчета окончательного значения увеличения. Для удобства масштабирования и интерпретации полученных нами фотографий мы размещали на них масштабную линейку. С ее помощью можно легко провести определение размеров анатомических признаков .

Микроструктурный анализ (Электронная микроскопия) Исследование проводили в ЦКП (НОЦ) РУДН на сканирующем электронном микроскопе JEOL JSM – 6490LV при 30kV, детекторе SEM, размере электронного пучка 30, в высоком вакууме. Благодарим канд. фарм. наук Хомик А.С. за помощь и содействие проведенных исследований .

Образцы перед проведении съемки покрывались слоем платины (24 нм) (50 сек при 40 мА) в автоматическом коутере JEOL (JFC – 1600) .

2.2.2. Методы определения показателей качества сырья

• Размеры частиц измельченного растительного сырья (околоплодников стиракса) определяли, с помощью набора сит с отверстиями размером: 2,5; 2; 1;

0,5; 0,25 мм и диаметром 14 см. Просев осуществляли с помощью автоматического вибропривода в течении 5 минут .

• Определение влажности Анализ проводился согласно ОФС.1.5.3.0007.15. Для определения влажности измельченных высушенных околоплодников стиракса лекарственного был использован влагомер термографический инфракрасный (Аквилон АВ-50) .

• Общая зола и зола нерастворимая в хлористоводородной кислоте На основании общих фармакопейных статей ОФС.1.2.2.2.0013.15 и ОФС.1.5.3.0005.15 ГФ XIII, проводили определение общей золы измельченных (до размера частиц не более 2 мм) и с использованием около 5,0000 г высушенных околоплодниках стиракса (точная навеска). Определение золы нерастворимой в хлористоводородной кислоте проводили на остатке после определения золы общей с использованием беззольного фильтра (Белая лента, МЕЛИОР XXI, масса золы одного фильтра не более 0,00029 г.) .

• Определение коэффициента поглощения воды/экстрагента и расходного коэффициента растительного сырья высушенных околоплодников стиракса лекарственного Определение проводили согласно ОФС.1.5.3.0012.15. Для определения коэффициента поглощения различных экстрагентов, около 10,0 г (точная навеска) измельченных высушенных околоплодников заливали экстрагентом: водой очищенной/ метанолом/ спиртом 96% с отношением сырьё:экстрагент (1:10). В соответствии с ОФС.1.4.1.0018.15 «Настои и отвары» и с ОФС.1.4.1.0019.15 «Настойки». Полученные извлечения фильтровали и отжимали оставшееся сырье Коэффициент эктрагент-поглощения: кэп = в перфорированном стакане, после чего измеряли объем полученного извлечения .

–  –  –

где: V1– объем эктрагента, мл; V2– объем извлечения, который был получен после отжатия сырья, мл; a – навеска сырья, г .

• Определение содержания экстрактивных веществ в сырье околоплодники стиракса лекарственного Для определения содержания суммы биологически активных и балластных веществ в сырье околоплодники стиракса лекарственного, использовали согласно ОФС.1.5.3.0006.15 метод 2 – многократную экстракцию .

Методика: Около 6,0 г (точная навеска) высушенных (с определенной влажностью W%) измельченных (с размерами частиц не более 1 мм) околоплодников стиракса лекарственного, помещают в колбу вместимостью 250 мл, 30 мл метанола растворителя. Колбу взвешивают и проводят первичную мацерацию сырья в течении 1 ч, после чего присоединяют обратный холодильник и нагревают на водяной бане в течение 2 ч. После охлаждения взвешивали колбу с содержимым и восполняли растворителем потерю в массе. Затем взбалтывают колбу и фильтруют содержимое через бумажный фильтр. Эту процедуру повторяют 3 раза, каждый раз прибавляя фильтрат обратно в колбу. Фильтраты объединяют, отбирают 10,0 мл и высушивают пробы досуха при температуре 100 °С, затем охлаждают в течение 30 мин в эксикаторе и взвешивают сухой остаток (m) .

Содержание экстрактивных веществ в сухом сырье околоплодников

–  –  –

2.2.3. Методика выделения и очистки суммы сапонинов из околоплодников стиракса лекарственного Выделение суммы сапонинов осуществлялось с использованием циркуляционной экстракции в аппарате Сокслета .

Около 60,0г (точная навеска) измельченного сырья помещали в патрон из фильтровальной бумаги, и экстрагировали метанолом (400 мл) в течение 10 ч. Затем экстракт упаривали на роторном испарителе Heidolph® Laboratory 4002 control (337 мБар, температура 40 ± 5°С) до получения густого экстракта. Затем, густой экстракт очищали этилацетатом и н-бутанолом. Густой экстракт обрабатывали этилацетатом (1:10 вес / объем) в течение 6 часов при перемешивании, полученную смесь фильтровали. Этилацетат удаляли с помощью роторного испарителя (температура 40°С, 240 мБар). Остаток обрабатывали н-бутанолом 10% в пропорции (1:30 вес / объем) в течение 3 часов при перемешивании. Затем после удаления слоя нбутанола проводили переосаждение сапонинов при подкислении концентрированным раствором хлористоводородной кислоты до pH = 1,0. Осадок сапонинов отделяли фильтрацией с последующей сушкой [Брежнева Т. А., 2003] .

2.2.4. Определение растворимости сухого экстракта (групп БАВ) Для изучения растворимости БАВ (суммы сапонинов) сухого экстракта околоплодников стиракса лекарственного использовали полярные и неполярные органические растворители такие как вода очищенная, метанол, спирт этиловый, глицерин, пропиленгликоль, ацетон, диметилсульфоксид, полиэтиленгликоль-400, хлороформ, н-бутанол. Проводили изучение растворимости по методике ГФ XIII (ОФС 1.2.1.0005.15), с постепенным добавлением растворителя в соотношении 1:1, 1:10, 1:30, 1:100 и 1:1000 .

2.2.5. Определение технологических характеристик сырья Определение степени сыпучести сухого экстракта Степень сыпучести порошка зависит от дисперсности, формы частиц и остаточной влажности. Мы определяли эту комплексную технологическую характеристику по двум критериям: сыпучесть и насыпной объем. Определение степени сыпучести порошка сухого экстракта околоплодников стиракса лекарственного проводили по методике ГФ XIII (ОФС 1.4.2.0016.15) на аппарате ERWEKA Granulate Flow Testers GT (Германия) в лаборатории ЦКП (НОЦ) РУДН. Навеску порошка массой 50 г, полученную путем экстракции суммы БАВ стиракса лекарственного, помещали без уплотнения в воронку аппарата Erweka GT с закрытым выходным отверстием (10, 15, 25 мм). Затем открывали выходное отверстие воронки и определяли время, за которое весь образец пройдет через отверстие воронки. Процесс повторили 3 раза .

Определение насыпного объема проводили по методике ГФ XIII (ОФС 1.4.2.0016.15) на аппарате ERWEKA SVM 101/201 Tapped Density Tester (Германия) в лаборатории ЦКП (НОЦ) РУДН. В сухой цилиндр помещали (без уплотнения) навеску 33,39 г порошка сухого экстракта стиракса лекарственного и определили насыпной объем V0 мл, который был равен 78 мл. Затем производили 10, 500 и 1250 соскоков цилиндра и фиксировали объемы после уплотнения V 10, V500, V1250.

Полученные результаты можно использовать для вычисления показателей:

–  –  –

Р0 .

2.2.6. Качественное определения сапонинов в СЭСЛ Для подтверждения наличия сапонинов в сумме экстрагируемых веществ, проводились реакции идентификации .

1. Качественная реакция, основанная на физических свойствах сапонинов Реакция пенообразования: довольно характерная реакция, так как других веществ, обладающих способностью к пенообразованию кроме сапонинов, в растениях не встречается. Методика: по 0,5 мл водного раствора экстракта околоплодников стиракса лекарственного помещают в две пробирки (мерные, с одинаковым диаметром). В одну из пробирок помещают 5 мл раствора кислоты хлористоводородной 0,1М, в другую - 5 мл раствора натрия гидроксида 0,1М. Обе пробирки интенсивно встряхивают в течение 1 мин. Проводят измерение высоты столбика пены в обеих пробирках [8, 9] .

2. Качественная реакция, основанная на биологических свойствах сапонинов - Рeaкция гeмoлизa. Методика: 0,2 г сухого экстракта стиракса лекарственного растворяют в 5 мл изoтoнического рacтвoра нaтрия xлoридa, добавляют полученный раствор к 1 мл взвecи дeфибринирoвaннoй крoви. В контрольную пробирку к 1 мл взвecи дeфибринирoвaннoй крoви добавляют 5 мл изoтoничecкого рacтвoра нaтрия xлoридa [8, 9] .

Раствор для гемолиза готовится следующим образом: полученная от добровольца кровь обрабатывается раствором антикоагулянта – натрия стеарата 3,2% (Vacuette, greiner bio-one), подвергается центрифугированию, после чего сливается надосадочная жидкость – плазма. Далее добавляют физиологический раствор и пробирку аккуратно переворачивают несколько раз таким образом, чтобы не допустить механического разрушения. Затем полученную смесь центрифугируют (2500-3000 об / мин в течение примерно 1-2 минут) и производят замену физиологического раствора на чистый, так как предыдущий содержит белки, лейкоциты и другие компоненты крови. Процедуру повторяют до момента, пока надосадочная жидкость не станет прозрачной и чистой .

3. Качественные реакции, основанные на химических свойствах сапонинов К 0,2 г. сухого экстракта СЭСЛ прибавляют 1 мл хлороформа и 5 капель концентрированной серной кислоты. Появиться желтое окрашивание, постепенно переходящее в красное окрашивание (тритерпеновые сапонины) [ТУ 9377-075Другие качественные реакции, основанные на химических свойствах сапонинов (Цветные реакции) мы проводили с реактивами: раствором кислоты серной концентрированной, раствором ванилина и кислоты серной концентрированной при нагревании (реакция Санье), хлороформом с кислотой серной концентрированной (реакция Сальковского) [8, 9] .

2.2.7. Методика количественного определения сапонинов в сухом экстракте – 1Н ЯМР На основании ГФ ХIII (ОФС.1.2.1.1.0007.15), количественная спектроскопия Н ЯМР считается надёжный методом определения содержания ЛС в отсутствие стандартного образца с использованием сигналов введенного в аналит любого калибровочного соединения в известной концентрации .

–  –  –

количественного определения сапонинов в сухом экстракте. Исследование проводились на приборах 1Н ЯМР - спектрометр (JEOL, Япония) «Jeol JNM-ECA 600» и «Jeol JNM-ECS 400», на базе Центра коллективного пользования ЦКП (НОЦ) РУДН. Благодарим Ивлева В. А. за помощь в количественном определении .

Методика: Проведен анализ сухого экстракта стиракса лекарственного на содержание сапонинов методом количественной спектроскопии ЯМР1Н. К точной навеске 46,3 мг сухого экстракта стиракса лекарственного (СЭСЛ) добавляют 1 мл DMSO-d6, встряхивают в течение 1 минуты, центрифугируют в течение 5 минут при 14000 об/мин. Раствор переносят в стандартную ампулу для ЯМР d=5 мм. Регистрируют спектр 1Н ЯМР при следующих условиях: 90 импульс, смещение 5 м.д., развертка 15 м.д., 32 К точек на спектр, 32 повторений, задержка между импульсами 40 с .

Определение содержания сапонинов проводят сравнением интегральной интенсивности откалиброванного по остаточному содержанию протонсодержащего изотопа DMSO-d6, и сигналов сапонинов, описанных в статье Y. Yayla et al. (2002 г.) (Таб. 2.2.). Условия регистрации спектра ЯМР 1Н сапонинов образца были такими же, как и для стандартного образца в статье .

Таблица 2.2 .

– Результаты 1Н ЯМР сапонинов стиракса А, В, С и дезацилсапонин - Y. Yayla 2002 г .

Для сапонина В был выбран сигнал при 5.94 м.д., для сапонинов А и С выбрана совокупность сигналов в области 5.70-5.8 м.д и 5.41 м.д. Сигналов дезацилсапонина, не перекрывающихся другими сигналами, не обнаружено .

Для количественного определения измерют интегральную интенсивность сигналов сапонинов стиракса.

Процентное содержание каждого сапонина в испытуемом образце в пересчете на сухое вещество (X, % масс) вычисляют по формуле:

X, % масс= 100 (S' /S'0) (M a0 /M0 a) [100/(100 – W)], где S' – нормированное значение интегральной интенсивности сигнала определяемого вещества;

S'0 – нормированное значение интегральной интенсивности сигнала стандарта;

M – молекулярная масса определяемого вещества;

M0 – молекулярная масса;

a – навеска испытуемого образца;

a0 – навеска вещества-стандарта;

W – содержание влаги, % .

2.2.7.1. Валидация методики количественного определения сапонинов в сухом экстракте – ЯМР 1Н Проводимое нами исследование требует разработки новых методик контроля качества полученной лекарственной субстанции, обязательным требованием к которым является их валидация .

Проведенная валидация демонстрирует, что методика количественного определения сапонинов в сухом экстракте с помощью 1Н ЯМР- спектроскопии пригодна и соответствует заложенным критериям приемлемости .

Валидацию проводили по следующими аналитическими параметрам:

Специфичность (Specificity) Способность методики однозначно оценивать активные вещества (сапонины стиракса) в присутствии других компонентов, которые могут присутствовать в образце .

Критерии приемлемости и их оценка:

1- Примесные соединения:

А) Должны отсутствовать пики, которые мешают определению анализируемых веществ. Оценка критерия: на хроматограмме – ЯМР1Н суммы сапонинов стиракса нет никаких сигналов, мешающих определению пиков сапонинов стиракса А, В, С .

Б) На 1Н ЯМР спектре образца сапонинов не должно быть пиков, принадлежащих растворителю и имеющих такие же сигналы (м.д.) .

Оценка критериев была достигнута при использовании сухого экстракта сапонинов и DMSO-d6 в качестве растворителя для подготовки образцов для Н ЯМР .

2) Содержание основных веществ: интенсивность сигналов спектра ЯМР 1Н испытуемого образца, должна соответствовать интенсивности сигналов стандартного спектра ЯМР1Н .

Оценка критерия: на 1Н ЯМР спектре образца сапонинов, сигналы в области 5,41-5,74 м.д. и при 5,73 м.д. соответствуют сапонинам стиракса 1(А) и 3 (С). Сигналы при 5,94 м.д. соответствуют сапонину стиракса 2 (В). Условия регистрации стандартного спектра ЯМР1Н (Y.Yayla et al. / Fitoterapia 73 (2002) 320-326) были такими же, как и для наших образцов (1Н ЯМР-спектрометры, 500 MHz и 125 MHz, растворитель DMSO-d6) .

Сходимость/повторяемость (convergence) Критерий сходимости характеризует прецизионность методики при ее выполнении в одних и тех же условиях с одним и тем же аналитиком в течение небольшого промежутка времени. В течение одного дня, один лаборантисследователь проводил 5 измерений количественного содержания сапонинов в экстракте для одного и того же образца с помощью ЯМР-1Н .

Критерии приемлемости и их оценка Относительное стандартное отклонение (Sr%) при оценке сходимости полученных результатов определения содержания сапонинов стиракса в сухом экстракте должно быть 5 % (=0,05) .

Результаты определения количественного содержания сапонинов стиракса и их статистической обработки представлены в таблице 2.3 .

Таблица 2.3 .

– Математическая обработка результатов измерений и испытания сходимости методики

–  –  –

2,669 1,587 0,291 0,705 0,019 0,067

–  –  –

Воспроизводимость (Reproducibility) Воспроизводимость результатов анализов отражает близость результатов измерений, выполняемых в различных условиях по данной методике. Например, в различное время, в различных местах или на различных приборах .

Для определения воспроизводимости нашей методики проводили анализ количественного определения сапонинов стиракса из одного и того же образца на двух разных ЯМР-спектрометрах, «Jeol JNM-ECA 600» и «Jeol JNM-ECS 400» .

Критерии приемлемости и их оценки Относительное стандартное отклонение (Sr%) при оценке воспроизводимости полученных результатов определения содержания сапонинов стиракса в сухом экстракте должно быть 5 % (=0,05) .

Результаты определения количественного содержания сапонинов стиракса на двух разных ЯМР-спектрометрах и их статистическая обработка представлены в таблице 2.5 .

–  –  –

Вышеуказанные тесты подтверждают достоверность данной методики для количественного определения сапонинов в сухом экстракте с помощью ЯМР-1Н .

2.2.8. Исследование биологической активности БАВ и полученных от них препаратов Исследование специфической активности сапонинов околоплодников стиракса лекарственного в опытах in silico Разработка методов оценки безопасности и эффективности на основе технологий биоинформатики и компьютерного конструирования лекарств считается одним из перспективных направлений медицинской науки. В связи с этим мы выбрали этот метод для предварительной характеристики сапонинов из стиракса лекарственного на этапе обоснования разработки ЛП .

Использован комплекс программного обеспечения, находящегося в свободном доступе в сети Интернет. Одним из основных сайтов является база данных PDB (Protein Data Bank), сайт, который содержит банк данных кристаллических форм многих белков и соединений (ферменты, нуклеиновые кислоты и др.) .

Компьютерные программы, использованные в исследованиях 1- Создание действующих химических структурных формул сапонинов стиракса /Drawing the chemical structures of styrax saponins Программа Marvin Sketch 17.1.23.0 (http://www.Chemaxon.com/) • 2- Прогнозирование биологической активности созданных химических структур сапонинов стиракса / Prediction of activity for chemical structure of styrax saponins

Программа PASS (Prediction of activity spectra of substances):

• Использовался свободно доступный веб-ресурс PASS Online на сайте http://www.way2drug.com/ для предсказания спектров биологической активности органических соединений на основе анализа связей структура–активность, со средней точностью свыше 95% .

Исследование специфической активности экстрактов стиракса лекарственного в опытах in vitro А- Изучение спермицидного действия суммы сапонинов сухого экстракта околоплодников стиракса лекарственного Материалы исследования: эякуляты, полученные у 12 мужчин с нормозооспермией в возрасте около 30 лет. Концентрацию спермиев, число подвижных спермиев, число активно подвижных спермиев, время переживания спермиев, рН оценивали согласно лабораторному руководству ВОЗ для обследования и обработки спермы человека, пятое издание (WHO laboratory manual, 2010 г.) до и после эквилибрации спермы с водными растворами сапонинов .

Методика: Образцы семени сжижают при 37 °С в течение 30 минут, затем сперму анализируют с помощью цитоморфологического метода в камере Makler для подсчета сперматозоидов (Jiangsu Joymed TechCo., Шанхай, Китай) на световом микроскопе при 200. В основании камеры имеется отверстие с

–  –  –

После исследования нативных образцов спермиев, добавляют водные растворы различных концентраций сапонинов стиракса в хлориде натрия 0,9% (физиологическом растворе). Сперма и исследуемые растворы сапонинов используются в равных объемах. Оценивают результаты активности водных растворов сапонинов стиракса моментально после их добавления к спермам, затем через 30 и 60 с, далее через 10, 15 и 30 мин после инкубации. В контроле используют физиологический раствор (хлорида натрия 0,9%). Результаты обработали с помощью программы Statistica MS Exsel .

Б - изучения антимикробной активности сухого экстрактов околоплодников стиракса лекарственного Styrax officinalis L .

в опытах in vitro Изучение бактериостатической и фунгистатической активности Эксперименты проведены в лаборатории микробиологических исследований ФГБНУ ВИЛАР, благодарим зав. лабораторией микробиологических исследований ВИЛАР, к.б.н. Фатееву Т.В. за помощь в исследованиях .

При изучении бактериостатической и фунгистатической активности в опытах in vitro использовали метод двукратных серийных разведений препаратов в жидких питательных средах .

Микроорганизмы:

В качестве тест-микроорганизмов использовали патогенные грамположительные бактерии Staphylococcus aureus 209-P (АТСС 6538), грамотрицательные бактерии Escherichia coli ATCC 25922, Proteus vulgaris ATCC 6896 и Pseudomonas aeruginosa АТСС 9027, дрожжеподобные грибы Candida albicansАТСС 10231 и мицелиальные грибы Microsporum canis 252 .

Среды:

При определении бактериостатической активности исследуемых образцов использовали мясо-пептонный бульон (МПБ). При определении фунгистатической активности жидкую среду Сабуро .

Методики экспериментов:

1)-Определение бактериостатической активности С целью изучения жидких экстрактов готовят ряд опытных пробирок с 2 мл среды (МПБ). В 1-ю пробирку добавляют 2 мл изучаемого образца экстракта, изначально разведенного 1:2, и получая таким образом исходное разведение 1:4 .

Затем, путем последовательного разведения исследуемого экстракта в питательной среде в 2 раза готовят ряд убывающих разведений .

При изучении сухого экстракта навеску препарата около 32 мг (точная навеска) взвешивали на торсионных весах, переносят в стерильную пробирку и стерилизуют в течение 1 часа 96% спиртом (субстанция должна быть полностью покрыта спиртом). Затем в эту пробирку добавляют соответствующую питательную среду в количестве 4,0 мл, необходимую для создания исходной концентрации препарата – 8000 мкг/мл. В остальные пробирки добавляют по 2 мл питательной среды и затем, путем двукратных разведений, готовят ряды убывающих концентраций препарата (опытные пробирки). Последняя пробирка с чистой средой (без добавления экстракта) служит контролем. После этого все пробирки (опытные и контрольные) засевают культурами микроорганизмов .

Взвеси грамположительных и грамотрицательных бактерий готовят в изотоническом растворе натрия хлорида по бактериальному стандарту мутности ОСО 42-28-85-2014 (10 МЕ) (109 микробных тел/мл). Из первой пробирки, содержащей 109 микробных тел/мл, путем десятикратных разведений в изотоническом растворе натрия хлорида готовят ряд убывающих концентраций микроорганизмов: 108, 107 106, 105, 104. Затем, в каждую опытную пробирку, вносят по 0,2 мл взвеси, содержащей 104 микробных тел/мл (рабочая микробная нагрузка). Посевы инкубируют в термостате при температуре 37°С в течение 24 часов. Опыты проводят в трех повторностях .

2)- Определение фунгистатической активности С целью изучения жидких экстрактов готовили ряд опытных пробирок с 2 мл среды (Сабуро) и в 1-ю пробирку добавляли 2 мл изучаемого экстракта, изначально разведенного 1:2, и получая таким образом исходное разведение 1:4 .

Затем, путем последовательного разведения экстракта в питательной среде в 2 раза готовили ряд убывающих разведений .

Методика: При изучении сухого экстракта навеску препарата около 32 мг (точная навеска) взвешивают на торсионных весах, переносят в стерильную пробирку и стерилизовали в течение 1 часа 96% спиртом (чтобы субстанция была полностью покрыта спиртом). Затем в эту пробирку добавляют соответствующую питательную среду в количестве 4,0 мл, необходимым для создания исходной концентрации препарата – 8000 мкг/мл. В остальные пробирки добавляют по 2 мл питательной среды и затем, путем двукратных разведений, готовят ряды убывающих концентраций препарата (опытные пробирки). Последняя пробирка с чистой средой (без добавления экстракта) служит контролем. После этого все пробирки (опытные и контрольные) засевают культурами микроорганизмов .

Взвесь грибов готовят в изотоническом растворе натрия хлорида по бактериальному стандарту мутности ОСО 42-28-85-2014 (10 МЕ) (109 микробных тел/мл), затем полученную взвесь разводят изотоническим раствором натрия хлорида в 20 раз. В опытные и контрольные пробирки засевают по 0,2 мл полученной взвеси.

Посевы инкубируют при температуре 30-32°С:

дрожжеподобные грибы – в течение 48 часов, мицелиальные грибы в течение 10

– 14 суток. Опыты проводят в трех повторностях .

Бактериостатический и фунгистатический эффект определяли по минимальному, подавляющему рост бактерий и грибов разведением экстракта, при котором визуально не наблюдали роста микроорганизмов .

Исследование специфической активности и биологической безвредности лекарственных форм в опытах in vivo А- Изучение контрацептивного действия лекарственного средства на основе сапонинов из околоплодников стиракса лекарственного На базе Центра коллективного пользования (Научно-образовательный центр) (ЦКП (НОЦ)) РУДН и вивария РУДН, проведено изучение контрацептивного действия и биологической безвредности (отсутствие местнораздражающего действия) образцов лекарственных препаратов на основе сухого экстракта околоплодников стиракса лекарственного. Благодарим к.в.н .

Карамян А. С. за помощь в работе .

Эксперименты выполнялись на крысах .

Условия содержания животных: стандартные условия вивария, размещение группами в промаркированных клетках с регулярно заменяемым подстилом, со свободным доступом к воде и пище, в условиях стандартизованного светового и температурного режимов .

Каждая группа состоит из 10 особей (5 самцов, 5 самок) .

Экспериментальная группа (опыт) состоит из 15-ти особей (5 самцов, 10 самок) .

Выбор доз осуществлялся, согласно результатам изучения спермицидной активности средства в опытах in vitro .

Вид: Белые крысы Источник: ООО «КролИнфо»

Масса тела к началу: 180-200 г Возраст: 30-32 нед .

Количество: 50 Пол: самцы, самки Длительность карантина (акклиматизационного периода) для всех животных составляла 14 дней. В течение карантина проводили ежедневный осмотр каждого животного (поведение и общее состояние), дважды в день животных наблюдали в клетках (заболеваемость и смертность). Перед началом исследования животные, отвечающие критериям включения в эксперимент, были распределены на группы с помощью метода рандомизации. Животные, не соответствующие критериям, были исключены из исследования в течение карантина .

Клетки с животными были помещены в отдельные комнаты .

Световой режим: 12 часов — свет, 12 часов — темнота. Температура воздуха поддерживалась в пределах 19–25°C, относительная влажность — 50–70 %. Температура и влажность воздуха регистрировались ежедневно. При изменении погодных условий контролировался воздухообмен в помещении с помощью анемометра и путем измерения содержания в воздухе углекислого газа и аммиака. Был установлен режим проветривания, обеспечивающий около 15 объемов помещения в час, концентрацию CO2 не более

0.15 объемных %, аммиака — не более 0.001 мг/л .

В течение исследования каждое животное осматривалось ежедневно .

Осмотр включал в себя оценку общего поведения и общего состояния животных .

При введении препарата осмотр проводился примерно через 1 час после введения .

Было изучено контрацептивное действие удобного для введения полуфабриката- геля ВСПЭС с 1,5 % содержанием СЭСЛ в опытах in vivo на 45 половозрелых крысах (25 самок и 20 самцов) массой 200 ± 50 г., Возраст: 8 месяцев.

Животные самки были распределены на 4 группы (Животные распределялись по группам случайным образом методом рандомизации):

1. контроль I (5 самок): интактные животные (без введения препаратов);

2. контроль (5 самок): экспериментальные животные, которым II вводили вагинально основу геля «Плацебо-гель»;

3. подопытная группа с препаратом - сравнения (5 самок): экспериментальные животные, которым вводили вагинальный крем Фарматекс® (лаборатория ИннотекФранция);

4. подопытная группа (10 самок): экспериментальные животные, которым вводили вагинально 1,5 % гель сапонинов стиракса .

При изучении контрацептивного действия in vivo на крысах препараты вводили самкам интравагинально перед помещением их с самцами в количестве 1 мл препарата с помощью зонда (катетера ректального, Ассомедика, Беларусь) и инсулинового шприца (BD Micro-Fine Plus) 1,0 мл (одна самка крысы с пятью самцами крыс в каждой клетке) в течение 15 дней. При отсутствии коитуса через 1 часа введение препаратов повторялось .

Для полного подтверждения беременности или ее отсутствия ориентировались на ожидаемый срок беременности крыс и только при отсутствии впоследствии родов (по истечению срока) делали заключение о контрацептивном действии препаратов .

Б- Исследование биологической безвредности ВСПЭС в опытах in vivo (отсутствие местнораздражающего действия) Для исследования местнораздражающего действия ВСПЭС, у животных в группе контроля II «гелевая основа» и подопытной группе до и после эксперимента, и перед каждым нанесением разрабатываемой лекарственной формы (гель с 1,5 % содержанием сухого экстракта стиракса лекарственного) и гелевая основа обследовали для выявления раздражений, гиперемий или любых возможных повреждений, кожных инфекций .

Результаты данного изучения представлены в главе 6 .

2.2.9. Изучение стабильности лекарственных форм Одним из обязательных требований при разработке новых лекарственных форм является исследование их стабильности при хранении. За это время не должны образовываться токсичные продукты разложения или изменяться физикохимические свойства лекарственного вещества или лекарственного препарата .

Исследования стабильности вагинальных пленок, содержащих сумму сапонинов, выделенных из околоплодников стиракса лекарственного в процессе хранения проводились по показателям: описание, растворимость, подлинность, рН, количественное содержание суммы БАВ, микробиологическая чистота и масса содержимого упаковки .

Хранение вагинальных пленок, содержащих суммы сапонинов из околоплодников стиракса лекарственного, осуществляли при температуре 15С и относительной влажности окружающего воздуха 60±5%в термостате ТССПУ (Россия) .

Микробиологическое исследование лекарственной формы Для исследования микробиологической чистоты лекарственной формы (пленки) при интравагинальном применении использовали требования ГФ XIII, ОФС 1.2.4.0002.15 «Микробиологическая чистота» категории 2: общее число на 1 пленке допускается не более 100 колониеобразующей единицы суммарно

–  –  –

2.2.10. Математические методыи статистическая обработка результатов анализа Результаты обработатывали с помощью программы StatisticaMSExsel .

– число измерений;

n

–  –  –

ЗАКЛЮЧЕНИЕ ПО ГЛАВЕ 2

1. Сапонины стиракса лекарственного изучались современными методами .

2. Для разработки и изучения лекарственных форм спермицидного действия в качестве активной фармацевтической субстанции выбрана сумма сапонинов стиракса лекарственного сухого экстракта .

3. Вспомогательные вещества для разработки новых дозированных лекарственных форм с сапонинами стиракса представлены различными ингредиентами, разрешенными для фармацевтического использования и выпускаемые предприятиями фармацевтической отрасли .

4. В работе использованы современные методики анализа при разработке лекарственных форм и всестороннее изучении активности in silico, in vitro и in vivo .

ГЛАВА 3. ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ СЫРЬЯ

«ОКОЛОПЛОДНИКИ СТИРАКСА ЛЕКАРСТВЕННОГО» И РАЗРАБОТКА

МЕТОДИК КОНТРОЛЯ ЕГО КАЧЕСТВА

Ввиду того, что создание контрацептивных средств для Сирийских женщин из отечественного сырья является актуальным, дальнейшей нашей задачей было фармакогностическое изучение сырья, составление разделов НД на новый вид сырья и последующее выделение из него суммы сапонинов .

Прежде чем заниматься разработкой технологии лекарственного препарата необходимо получить активную субстанцию. А если активная субстанция – сумма БАВ выделенных из лекарственного растительного сырья, то прежде всего необходимо стандартизовать сырье, разработать нормативную документацию .

НД на ЛРС состоит из трех больших разделов: Подлинность, Определение основных БАВ и Испытания .

Разработка раздела «Подлинность» на сырье: «Стиракса 3.1 .

лекарственного околоплодники»

Раздел Подлинность состоит из 2-х подразделов: Внешние признаки и микроскопические признаки. Чтобы составить описание стиракса лекарственного в соответствии с этими разделами было проведено изучение морфологических и анатомических особенностей высушенных плодов .

3.1.1. Изучение морфологии высушенных плодов стиракса В современной ботанической литературе отсутствует описание высушенных плодов стиракса лекарственного. В соответствии с рекомендациями ГФ XIII, при изучении мы обращали внимание на форму плодов, размеры, цвет, характер поверхности и запах .

Плоды стиракса были собраны с августа по октябрь 2015 года с растений, произрастающих в окрестностях города Латакия в Сирии .

Высушенные плоды (рисунок 3.1.) - многосемянные ягоды шарообразной формы разного размера. Апекальный конец плода чаще всего заострен (рисунок 3.3, Б). Место прикрепления плода к укороченному побегу (дистальный конец) более округлый. Размеры плодов: диаметр от 7 до 25мм. Поверхность покрыта желтовато-коричневыми звездчатыми волосками или мелкими чешуйками .

Окраска плодов варьирует: от светло-коричневого до светлого сероватогозеленого .

Рисунок. 3.1. Внешний вид высушенных плодов .

Апекальные концы зрелых плодов открываются, показывая семена. На дереве плоды открываются до тех пор, пока семена не выпадут на землю .

Различные степени открытия зрелых плодов, собранных одновременно с одного дерева показаны на рисунке 3.2 .

–  –  –

Рисунок. 3.3. Место прикрепления плода к ветке – проксимальный конец плода (А). Проксимальный (слева) и дистальный конец-верхушка плода (справа) (В) Высохшие плоды стиракса жёсткие, разламываются трудно. Один плод может содержать 1 или 2, иногда 3 крупных яйцевидных семени (рисунок 3.4) .

Рисунок. 3.4. Вид высушенного плода Среди тканей околоплодника чётко различаются несколько слоев (рисунок 3.5.): светло-коричневая с сероватым оттенком иногда зеленоватая наружная часть плода – экзокарп; желтовато-коричневая, светлая, блестящая внутренняя часть плода – эндокарп; и прозрачный желтоватый слой мезокарпа между ними (рисунок 3.5.) .

Экзокарп – наружная часть плода шероховатая, покрыта складками, пупырышками, мелкими чешуйками и густо опушена волосками. Цвет варьируется от светло-коричневого до землисто-серого и зеленовато-серого .

Эндокарп – внутренняя часть плода (рисунок 3.5.) представляет собой достаточно плотный, светло-коричневый рыже-коричневый или бежевый слой, отслаивающийся как от семени, так и от высохшей мякоти мезокарпа .

–  –  –

Во фрагментах околоплодника после разрушения плода присутствуют темно-зеленые или светло-желтые ткани экзо - и мезокарпа, а также ткани светлокоричневого или желтого цвета (плотные), отслаивающиеся от других частей околоплодника и семени – эндокарп (рисунок.3.6) .

Рисунок. 3.6. Вид высушенных плодов стиракса лекарственного после их разрушения При изучении морфологии семян стиракса лекарственного, установлено, что форма семян овально-яйцевидная или шаровидная, иногда удлиненная .

Поверхность гладкая, блестящая или матовая, от светло-коричневого до бордовокоричневого цвета (рисунок 3.7). Диаметр от 5 до 15 мм .

Рисунок. 3.7. Образцы типичных семян из изученного образца плодов На рисунке (3.8, А) видны характерные полосы, которые расходятся во все стороны от верхушки семени. На рисунке (3.8, Б) виден рубчик – место прикрепления семени к внутренней стенке околоплодника .

Рисунок. 3.8. Вид дистальных концов А и проксимальных концов семян Б При раскалывании или при распиливании семян видно, что семенная кожура желтовато-коричневого или бежевого цвета, имеет толстые стенки (рисунок 3.9.). Внутренняя поверхность семенной кожуры имеет тонкую мембрану серебристого цвета – тегмен (рисунок 3.9, а) .

–  –  –

Рисунок 3.10 .

Внешний вид эндосперма с пучками проводящей системы На рисунке (3.11, А) показан эндосперм, покрытый слоем тегмена. Этот слой трудно удалить (рисунок 3.11, Б) .

Рисунок. 3.11. Внешний вид и размеры эндосперма семян стиракса лекарственного: А- внешний вид эндосперма покрытый тегменом; Б- внешний вид аналогичного эндосперма без тегмена Для стиракса лекарственного характерна моноэмбриония и в семени растения происходит развитие единственного зародыша. Чаще всего при распиливании семян вдоль или поперек, виден один созревший семязачаток, в котором находится один зародыш (рисунок 3.12.). Сплюснутый и округлый эндосперм семени стиракса лекарственного, освобожденный от семенной кожуры, с одного конца заостренный, с другого - округлый. Размеры эндосперма: длина от 4 до 11 мм, толщина - от 1 до 3мм, ширина – от 3 до 8 мм. Внутри эндосперма виден один зародыш белого цвета .

Рисунок 3.12 .

Эндосперм с зародышем Разработан нами проект НД на изученное сырье (Околоплодники стиракса лекарственного) представлены в приложении № 4 .

3.1.2. Изучение диагностических признаков в анатомическом строении плодов стиракса лекарственного Раздел «Микроскопия» является обязательной частью НД на ЛРС для установления его подлинности. При изучении нового вида сырья, с целью выявления его диагностических признаков, нами была получена общая картина анатомического строения различных тканей плода изучаемого растения .

–  –  –

с

2. Мезокарп Мезокарп состоит из крупных, округлых к наружной части и вытянутых со слабо извилистыми стенками к внутренней части околоплодника клеток. В верхней части мезокарпа встречаются кубические кристаллы. Проводящие элементы расположены в мезокарпе ближе к внутренней поверхности околоплодника. Рядом с ними встречаются одиночные склеренхимные клетки или их группы по 2-3 клетки (рис. 3.16: а, б, с, д). В примыкающих к экзокарпию клетках содержатся хлоропласты, а клетки, примыкающие к эндокарпию, нередко служат местом накопления крахмальных зёрен (рис 3.17: а, б) .

–  –  –

Поверхность эндокарпа ровная, местами с выемками, имеющими размеры клеток 30х50 мкм. Главная часть эндокарпа представлена склеренхимой, клетки которой непосредственно примыкают к мезокарпию. Часть эндокарпа, обращённая к полости плода - внутренний эпидермис. На внутреннем эпидермисе плода имеется губчатый слой – аэренхима (рис. 3.18: а, б) .

На эндокарпе также имеются трихомы. Они состоят из одной или нескольких длинных заостренных клеток, выходящих из одного основания .

В отличие от трихом экзокарпия они расположены спорадически (рис. 3.19: а, б, с, д) .

–  –  –

а – наружная поверхность (СЭМ) б – внутренняя структура (СЭМ) Рисунок. 3.22. Семенная кожура .

6. Эндосперм и зародыш:

Эндосперм покрыт тегменом, тонкой пленкой, выполняющей механическую функцию (рис 3.23.) .

–  –  –

Рисунок. 3.25. Пленка между семенами Полученные нами данные представлены в проекте НД на изученное сырье (Околоплодники стиракса лекарственного) представлены в приложении 4 .

Следующий, после раздела «Подлинность» в ФС на ЛСР идет раздел «Определение основных групп биологически активных веществ» (БАВ). Для разработки этого раздела мы применили различные современные методы химического и физико-химического анализа состава БАВ в околоплодниках стиракса лекарственного .

Изучение химического состава околоплодников стиракса 3.2 .

лекарственного Нормативная документация разрабатывается нами для того, чтобы сырье стиракса лекарственного можно было использовать в качестве источника для получения растительной субстанции – сухого экстракта околоплодников стиракса лекарственного, содержащего сумму сапонинов .

–  –  –

Как видно из представленной таблицы, реакции подтверждающие наличие сапонинов – положительные, а также флавоноидов и дубильных веществ .

Изучение характеристик сырья «околоплодники стиракса 3.3 .

лекарственного» для составления раздела НД "испытания" .

Раздел ФС Испытания, состоит из нескольких покозателей: Влажность; зола общая; зола, нерастворимая в 10 % растворе хлористоводородной кислоты;

размер частиц; посторонние примеси; тяжелые металлы; радионуклиды;

остаточные количества пестицидов; микробиологическая чистота; количественное определение; упаковка, маркировка и транспортирование; хранение .

Мы изучили характеристики сырья и разработали нормы для некоторых из этих показателей. Работа над созданием норм остальных показателей будет продолжена .

Определение влажности растительного сырья высушенных околоплодников стиракса лекарственного Проведены измерения показателя влажность для 5-ти проб измельченного сырья стиракса лекарственного. Максимальное значение влажности составило 5,2% (таб. 3.2.) .

Таблица 3.2 .

– Результаты определения влажности околоплодников стиракса лекарственного

–  –  –

В% 14 2,145 3,775 0,74 19,6 0,41 3,8±0,41 В НД на измельченный околоплодник стиракса лекарственного предлагаем ввести норму влажности – не более 4,5 % .

Определение общей золы и золы, нерастворимой в растворе кислоты хлористоводородной 10% Согласно методу, приведенному в п.2.2.2.3, нами получены результаты испытаний общей золы и золы нерастворимой в хлористоводородной кислоте для 4 образцов. Данные представлены в таблице 3.3 .

Таблица 3.3 .

– Результаты определения золы сырья околоплодников стиракса

–  –  –

Основная масса частиц при ситовом анализе остается на ситах 1 и 0,5 мм .

Таким образом, нами предложено установить норму измельченности: частиц размером более 2 мм, не более 15%; частиц размером менее 0,25 мм, не более 20% .

Коэффициент водопоглощения: определяли в соответствии с требованиями ГФ XIII РФ - ОФС 1.5.3.0012.15, результаты представлены в таблице (3.5.) .

Таблица 3.5 .

– Определение коэффициента водопоглощения

–  –  –

Определение коэффициента поглощения летучих экстрагентов:

определяли для метанола и спирта 96%, после получения извлечения в соответствии с ГФ XIII РФ - ОФС.1.4.1.0019.15 «Настойки» .

Таблица 3.6 .

– Определение коэффициента поглощения метанол/спирт 96%

–  –  –

Таким образом, установлено, что измельченное сырье – околоплодники стиракса лекарственного имеют Кпэ (метанол) – 0,77, и Кпэ (спирт 96%) – 0,73 (табл. 3.6)

Количественное определение экстрактивных веществ:

Для определения содержания суммы биологически активных и балластных веществ в сырье околоплодники стиракса лекарственного, использовали согласно ГФ XIII РФ - ОФС.1.5.3.0006.15 метод 2 – многократную экстракцию (см. Г2, П .

2.2.2). Анализ проводили в 4 повторностях и результаты представлены в таблице (3.7) .

Таблица 3.7 – Содержание экстрактивных веществ в сырье

–  –  –

Поэтому при установлении нормативных требований к содержанию экстрактивных веществ, предлагаем ввести следующие нормы: для околоплодников стиракса лекарственного, при проведении экстракции метанолом

– не менее 60 % .

Полученные нами данные представлены в проекте НД на изученное сырье (Околоплодники стиракса лекарственного) представлены в приложении № 4 .

ВЫВОДЫ ПО ГЛАВЕ 3

Проведен макроскопический и микроскопический анализ 1 .

растительного сырья плодов и околоплодников стиракса лекарственного, выявлены диагностически значимые признаки в анатомическом строении, позволяющие устанавливать подлинность сырья. Результаты проиллюстрированы оригинальными микрофотографиями .

Впервые с помощью сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) 2 .

изучены и иллюстрированы оригинальными микрофотографиями плоды стиракса лекарственного. В том числе изучены особенности архитектуры поверхности околоплодника и поперечного среза через экзокарп, мезокарп и эндокарп, диагностические признаки семени и семенной кожуры .

В околоплодниках стиракса лекарственного установлено наличие 3 .

сапонинов, что подтверждено качественными реакциями .

Изучены показатели сырья «околоплодники стиракса лекарственного»

4 .

в соответствии с требованиями ГФ XIII: влажность – не более 4,5 %, общая зола – не более 1,0 %, зола нерастворимая в хлористоводородной кислоте – не более 0,1 % .

Установлен фракционный состав сухих измельченных 5 .

околоплодников стиракса лекарственного и предложны нормы для контроля измельченности: частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями размером 0,25 мм не более 20%, размером более 2 мм, не более 15% .

Разработан проект НД на изученное сырье «Околоплодники стиракса 6 .

лекарственного» по ряду показателей: внешние признаки, микроскопические признаки, определение основных групп биологически активных веществ, влажность, зола общая, зола не растворимая в 10% растворе НСl, измельченность, коэффициент водопоглощения, количественное определение экстрактивных веществ .

ГЛАВА 4. РАЗРАБОТКА МЕТОДИКИ ВЫДЕЛЕНИЯ И ИЗУЧЕНИЕ

ЭКСТРАКТА СТИРАКСА ЛЕКАРСТВЕННОГО

В целях создания контрацептивных средств для Сирийских женщин из местного сырья были изучены околоплодниках стиракса и подтверждено наличие сапонинов. Следующим этапом явилось выделение и очистка суммы сапонинов в виде сухого экстракта, стандартизация и характеристика его биологических свойств .

4.1. Определение технологических параметров выделения сухого экстракта из околоплодников стиракса лекарственного Поскольку методика выделения сапонинов из околоплодников стиракса лекарственного разрабатывалась впервые в качестве основных технологических параметров рассматривали: метод экстрагирования, экстрагент, дисперсность растительного материала и время экстрагирования .

4.1.1. Обоснование метода экстрагирования:

Циркуляционные экстрагирование с помощью аппарата Сокслета является одним из широко распространенных способов извлечения целевых БАС .

Благодаря постоянной циркуляции летучего экстрагента достигается максимальный выход экстракта при небольшом расходе экстрагента. Прибор занимает мало места и имеется почти в каждой химической и технологической лаборатории. В связи с вышесказанным, мы выбрали именно этот вид экстракции .

4.1.2. Выбор экстрагента:

При выборе экстрагента для получения сухого экстракта околоплодников стиракса лекарственного (СЭСЛ) исходили из литературных данных о растворителях, обладающих высокой способностью растворять сапонины – это этанол и метанол. Был оценен выход СЭСЛ в пересчете на абсолютно сухое сырье при экстрагировании метанолом и спиртом этиловым с содержанием этанола 70%, 90% и 96 %, результаты приведены в таблице 4.1 .

В ходе эксперимента нами установлено, что максимальный выход СЭСЛ наблюдался при использовании метанола (без разбавления) .

Таблица 4.1 .

– Выход СЭСЛ в пересчете на абсолютно - сухое сырье % (w/w) с использованием разных растворителей с различными концентрациями .

–  –  –

Из данных таблицы 4.1. следует, что оптимальная концентрация этилового спирта для экстрагирования сапонинов 70% и обеспечивает самый высокий выход сухого экстракта, по сравнению с другими концентрациями спирта. При том, что выход СЭСЛ при извлечении метанолом 78,90%, а при извлечении 70% спиртом последний выбран в качестве экстрагента из соображений безопасности .

4.1.3. Изучение влияния степени дисперсности сырья:

Поскольку полнота извлечения БАВ зависит, в том числе, и от степени дисперсности экстрагируемого материала, была проведена оценка влияния размера частиц околоплодника стиракса на выход СЭСЛ. Измельченные с помощью ножевой лабораторной мельницы околоплодники стиракса просеивали на виброустановке через набор сит с отверстиями 2,5; 2,0; 1,0; 0,5; 0,25 мм .

Основная масса частиц при ситовом анализе оставалась на ситах 1,0 и 0,5 мм .

Частиц, не проходящих сквозь сито с размером отверстий 2,0 мм, менее 15%;

частиц, проходящих сквозь сито с размером отверстий 0,25 мм, менее 16% (Таблица 3.4.) .

В ходе экстракции, среднее значение выхода СЭСЛ-36,99% наблюдается для фракции частиц 0,25-0,5 мм. Близкие к максимальному выходу значения мы получили для фракций 1,0-2,0 мм –35,06% и 0,5-1,0 мм – 32,38%. Работа с крупными частицами удобней, особенно при использовании аппарата Сокслета, поскольку экстрагирование сырья с размером частиц меньше 0,25 мм приводило к уплотнению материла, что являлось препятствием проникновению растворителя, поэтому мы наблюдали среднее значение минимального выхода 8,35% (Рис. 4.1.) .

–  –  –

Рисунок 4.1 .

Среднее значение выхода СЭСЛ в пересчете на абсолютно - сухое сырье% (w/w) из сырья с различной степенью измельченности

Дальнейшая работа проводилась с сырьем измельченном до показателя:

частиц размером более 2 мм, не более 15%; частиц размером менее 0,25 мм, не более 20% .

4.1.4. Изучение влияния времени экстракции:

Поскольку существенным экономическим показателем технологического процесса является скорость экстракции, была оценена полнота извлечения в зависимости от времени и количества сливов. Об истощении материала мы судили по отсутствию окраски сливающегося раствора. Первый слив был насыщенного коричневого цвета. Скорость прохождения одного цикла экстракции составляла 1 слив в 40 минут (1,5 слив/час) .

В ходе эксперимента было установлено, что обесцвечивание вытяжки наступает к 8-10 циклу, что соответствует 6-7 часам экстрагирования, с использованием ТСХ для оценки полноты экстракции. Для этого промежутка времени установлен максимум выхода СЭСЛ. При продолжительности экстракции менее 6 часов мы фиксировали низкий выход сухого экстракта, и при увеличении времени экстракции до 8, 9, 10, 11, 13 часов, не происходило повышения выхода СЭСЛ, что говорит о нерентабельности увеличения времени экстракции. Результаты данного исследования представлены в таблице (4.2.) .

Таблица 4.2 .

– Выход СЭСЛ в пересчете на абсолютно - сухое сырье % (w/w)

–  –  –

Таким образом, из полученных экспериментальных данных следует, что оптимальное количество циклов экстракции 8-10 и время 6-7 часов .

4.2. Разработка методики выделения СЭСЛ За основу методики принята циркуляционная экстракция в аппарате типа Сокслета и ранее установленные технологические параметры: степень измельченности сырья и время экстракции, а в качестве экстрагента использован 70% этанол .

Масса навески измельченных высушенных околоплодников стиракса лекарственного составляла 60,0 г. Объем растворителя по отношению к сырью 1:5. Точную навеску измельченного сырья помещали в патрон из фильтровальной бумаги и опускали в экстрактор аппарата Сокслета с рабочим объемом 250 мл .

Экстракцию проводили при температуре 55-60°С до полного извлечения экстрактивных веществ, которое контролировалось по обесцвечиванию сливов .

Полученную в колбу-приемник смесь полностью упаривали на ротационном испарителе в вакууме (230 мБар) при 66°С. Густой экстракт последовательно обрабатывали этилацетатом (1:10 вес/объем) и н-бутанолом (1:30 вес/объем). При подкислении концентрированной хлористоводородной кислотой выпадал осадок, который отфильтровывали на воронке с бумажным фильтром и сушили на воздухе при комнатной температуре в течение 24 ч в сухую погоду и до 48 ч при влажном воздухе до полного испарения растворителей .

Технологическая схема отражает этапы экстракции и очищения сапонинов из сырья «околоплодники стиракса лекарственного» и представлена в виде схемы (рис. 4.2.) .

Высушенные околоплодники стиракса лекарственного

–  –  –

Как видно из представленной таблицы, все реакции, подтверждающие наличие сапонинов, – положительные. По реакции пенообразования и реакции Санье можно сделать вывод, что в изучаемом экстракте преобладают тритерпеновые сапонины .

Для более глубоко изучения сухого экстракта околоплодников стиракса лекарственного была выделена сумма сапонинов стиракса (ССС) из сухого экстракта с помощью препаративной ТСХ и в дальнейшем все исследования проводились образца СЭСЛ и ССС .

4.3.1. Качественное определение сапонинов в СЭСЛ и выделение суммы сапонинов стиракса методом ТСХ Раствор стандартного образца (СО PQS). Около 0,05 г (точная навеска) стандартного образца Purified Quillaia Saponin HRS, EP standart растворяют в 2 мл метанола, перемешивают .

Испытуемый раствор СЭСЛ. Около 0,6 г (точная навеска) СЭСЛ растворяют в 2 мл метанола, перемешивали в течение 1 мин, затем фильтровали .

На линию старта аналитической хроматографической пластинки «Merk KGaA, Германия, 1.05626.» со слоем силикагеля с флуоресцентным индикатором размером 10 20 см на алюминиевой подложке наносят 10 мкл (0,010 мл) испытуемого раствора СЭСЛ и 10 мкл раствора стандартного образца (СО PQS) .

Пластинку с нанесенными пробами сушат на воздухе, ее помещают в камеру при температуре 20°С со смесью растворителей: хлороформ-метанол-вода (6:3:1) .

Пластину вынимают из камеры после прохождения фронта растворителей 15 см, сушат в течение 5 минут, затем опрыскивают раствором взвеси дефибринированной крови .

После проведения эксперимента, на основании полученных результатов, рассчитывали показатели Rf (рис. 4.3.) .

На ТСХ видны зоны адсорбции белого цвета с Rf около 0,68 (ССС) и Rf около 0,55 (сапонины СО PQS) .

Рисунок 4.3 .

Хроматограмма растворов сапонинов из; а – СЭСЛа, б – СО PQSв системе хлороформ-метанол-вода (6:3:1), (УФ-свет, 245 нм/ детектор-раствор взвеси дефибринированной крови) .

4.3.2. Регистрация УФ-спектрофотометрия СЭСЛ и ССС Около 0,010 г СЭСЛ помещают в мерную колбу вместимостью 10 мл, растворяют в метаноле и доводят объем до метки (раствор А). Выделенную с помощью препаративной ТСХ ССС помещают в метанол последовательно фильтруют через целлюлозный, а затем через шприцевый фильтр CHROMAFIL Xtra PTFE (Тефлон) с размером пор 45 мкм (раствор Б) .

УФ-спектр раствора А и Б снимают на спектрофотометре АКВИЛОН СФ-102 в кювете с толщиной слоя 1 см. В качестве раствора сравнения используют метанол. Результаты УФ-спектрофотометрии приведены на рисунке (4.4.) Рисунок 4.4. УФ-кривые спектрального сканирования растворов сапонинов стиракса лекарственного (А- СЭСЛ; Б- ССС) .

Полученный спектр может быть в дальнейшем использован для стандартизации СЭСЛ и препаратов на его основе. В проекте НД: УФ-спектр поглощения 0,1% метанольных растворов сапонинов, выделенных из стиракса лекарственного в области от 230 до 365 нм должен имеет максимум поглощения при длине волны 270 ± 1 нм и 315 ± 1 нм .

4.3.3. Изучение СЭСЛ и ССС с помощью ВЭЖХ При проведении исследования СЭСЛ, массой 0,01 г растворяли в 5 мл метанола, фильтровали через фильтр ПТФЭ с размером пор 0,2 мкм. Также в 1 мл метанола растворяли ССС, и фильтровали полученные растворы через фильтр ПТФЭ. Для ВЭЖХ использовали (JASCOPU-980 Intelligent HPLC Pump, JASCOUV-970 Intelligent UV/VIS Detector) и колонку C18, и мобильную фазу метанол:вода в соотношении (70:30), скорость элюции составляла 0,5 мл/мин;

детектирование при 260 нм. Использовали объем хроматографируемых образцов экстрактов по 10 мкл. Нами был получен ВЭЖХ-спектр для СЭСЛ и ВЭЖХспектр для ССС (Рисунок 4.5.) .

–  –  –

Типичная хроматограмма УЭЖХ-МС представлена на рис. (4.6.) .

Рисунок 4.6 .

УЭЖХ-МС профиль отрицательных m/zв диапазоне 1100-1300, характерных для сапонин гликозидов Styrax officinalisL. Профиль экстрагировали из хроматограммы всех отрицательных ионов 150-2000 Да .

Мы идентифицировали часть пиков, с помощью данных справочной литературы. Результаты представлены в таблице (4.5.) .

–  –  –

4.3.5. Анализ сапонинов в СЭСЛ с помощью МС-спектрометрии в режиме регистрации позитивных и негативных ионов Результаты исследования получены на оборудовании кафедры химии природных соединений Химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова .

Благодарим старшего научного сотрудника к.х.н. Ташлицкого В. Н .

Пробоподготовка: Приготовлен раствор 20 мг образца в 1 мл метанола .

Анализировали аликвоту 5 мкл. Условия анализа: Хроматографический метод:

растворитель A: муравьиная кислота 20 мM- вода, растворитель B: муравьиная кислота 20 мM- ацетонитрил. Колонка: стальная, 2,1150 мм, заполненная сорбентом AcquityBEHC18; размер частиц 1,7 мкм; (Waters); температура колонки: 35°С (таблицы 4.6., 4.7.) .

–  –  –

Нами были изучены МС-спектры в режиме регистрации позитивных и негативных ионов для наиболее интенсивных пиков:

1) Пик со временем удерживания около 16 мин имеет предположительно молекулярный ион М-Н=1219 и М+Na=1243, который может соответствовать ожидаемой структуре для стиракс дезацилсапонин (Рисунок 4.7.) .

–  –  –

2) Пик со временем удерживания около 18,2 мин. имеет предположительно молекулярный ион М-Н=1261 и М+H=1263. Предположительно данное соединение является стиракс сапонин A – где MF: C61H96O27; мол. м.: 1261.398 г/моль (Рисунок 4.8.) .

Рисунок 4.8 .

МС-спектры в режиме регистрации позитивных и негативных ионов растворов сапонинов стиракса лекарственного пик (18.2 мин, М-Н=1261, М+H=1263) .

3) Пик со временем удерживания около 20,7 мин имеет предположительно молекулярный ион М-Н=1321 или М-Н=1274 и М+H=1299. Предположительно данное соединение является стиракс сапонин B – где мол. м.: 1321.391 г/моль (Рисунок 4.9.) .

Рисунок 4.9 .

МС-спектры в режиме регистрации позитивных и негативных ионов растворов сапонинов стиракса лекарственного пик (20.7 мин, М-Н=1321) .

4) Пик со временем 23,8 мин имеет предположительно молекулярный ион МН=1314 или М-Н=1360 и М+H=1339 которая может соответствовать ожидаемой структуре для стиракс сапонин С– где мол. м.: 1353.506 г/моль (Рисунок 4.10.) .

Рисунок 4.10 .

МС-спектры в режиме регистрации позитивных и негативных ионов растворов сапонинов стиракса лекарственного пик (23.8 мин, М-Н =1360) .

Идентификация компонентов такой сложной смеси довольно затруднительна, поэтому было предложено исследование продуктов гидролиза в кислых и щелочных условиях. Нами была использована следующая методика гидролиза сапонинов: приготовлены два раствора сухого экстракта стиракса лекарственного с концентрацией 20 мг/мл для щелочного и кислотного гидролиза .

Полученные растворы инкубировали на термошейкере при 80°С в течение 2 часов при 1400 об/мин. Растворы центрифугировали и анализировали супернатант в режимах регистрации позитивных и негативных ионов .

Хроматографический анализ с МС-детекцией показал, что в результате щелочного гидролиза исследуемого образца сапонинов стиракса наблюдается сложная смесь пиков со значительно меньшим временем удерживания, чем до гидролиза. Среди прочих наблюдается пик со временем удерживания 6,3 мин, который в режиме регистрации негативных пиков имеет массу 1134, соответствующую ожидаемой структуре дезацил-жегосапонин (Deacyl jegosaponin) (Рисунок 4.11.) .

Соединение такой структуры может образоваться из исходных сапонинов за счет гидролиза сложноэфирных связей, характерного для щелочных условий проведенного гидролиза. В режиме регистрации позитивных ионов пик с этим же временем удерживания имеет спектр с ионом 1158 (M+Na=1158). Что подтверждает правильность идентификации продукта гидролиза (Рисунок 4.12.) .

Рисунок 4.11 .

Структура Deacyl jego saponin / Styrax sapogenin Рисунок 4.12. МС-спектры в режиме регистрации позитивных и негативных ионов растворов щелочного гидролиза сапонинов стиракса лекарственного В исходной смеси до гидролиза данное соединение (со временем удерживания 6,3 мин) практически отсутствует, что подтверждает его образование в ходе щелочного гидролиза .

В условиях кислотного гидролиза сапонинов стиракса лекарственного на спектре ВЭЖХ также наблюдается набор пиков. Один из пиков со временем удерживания 17,4 мин имеет спектр в режиме регистрации негативных ионов характерный для продукта полного гидролиза Theasapogenol B (M-Н=490, M+HCOO=535) (Рисунок 4.13.) .

–  –  –

Рисунок 4.13 .

структура Theasapogenol B Этот же пик имеет сложный спектр в режиме регистрации позитивных ионов, который может соответствовать продукту полного гидролиза Theasapogenol B (M+Н-Н2О=473 и M+Na=514) (Рисунок 4.14.) .

Рисунок 4.14 .

МС-спектры в режиме регистрации позитивных и негативных ионов растворов кислотного гидролиза сапонинов стиракса лекарственного Компонент с таким временем удерживания и молекулярным ионом 490 в режиме регистрации негативных ионов наблюдается в исходной смеси, но в значительно меньшей концентрации. На основании этого можно утверждать, что данный компонент является продуктом гидролиза в кислых условиях .

Таким образом, простые методы - химические реакции и также более современные – УЭЖХ и МС, подтверждают, что полученный СЭСЛ содержит сумму сапонинов стиракса лекарственного .

4.4. Стандартизация СЭСЛ На основании результатов изучения химического состава СЭСЛ полученного по методике 4.2. в целях стандартизации предполагаются следующие показатели: описание, растворимость, сыпучесть, влажность, подлинность и количественное определение содержания сапонинов .

4.4.1. Описание СЭСЛ Внешний вид СЭСЛ: Сухой очищенный экстракт стиракса представляет собой аморфные частицы от светло-кремового до кремового цвета с серым оттенком, со специфическим запахом (Рис 4.15.) .

–  –  –

Микроскопические признаки СЭСЛ: Одной из характеристик любого порошка и сухого растительного экстракта, в том числе является форма и размер частиц. Форму частиц СЭСЛ определяли с помощью СЭМ .

Как видно из рисунка 4.16., частицы сухого экстракта стиракса лекарственного имеют различные размеры и форму. Частицы многоугольные, с ломаными краями иногда удлиненные иногда округлые. Поверхность частиц – покрыта выступающими многогранными образованиями. Даже округлые частицы имеют очень неровную поверхность. Неровная поверхность частиц не позволяет им скользить относительно друг друга .

Рисунок 4.16 .

Микрофотографии частиц порошка сухогоэкстракта стиракса лекарственного при разных увеличениях (СЭМ) В таблице (4.8.) представлен анализ размера частиц экстракта, проведенный по полученным микрофотографиям .

–  –  –

В процессе исследования было установлено, что сумма сапонинов в сухом экстракте растворима в ацетоне, метаноле и диметилсульфоксиде. Однако, использование этих растворителей в лекарственной форме исключено, поскольку эти растворители небезопасны и могут вызывать раздражение и пенетрантное действие. Поэтому для дальнейшей работы была выбрана система растворителей вода очищенная + трометамол (опыт 3) .

4.4.3. Определение степени сыпучести сухого экстракта Одним из технологических свойств сухих растительных экстрактов являются характеристики сыпучих материалов. Поэтому нами были определены технологические характеристики экстракта стиракса лекарственного: сыпучесть, угол естественного откоса, насыпная плотность, насыпная масса и коэффициент прессуемости. Результаты, представленные в таблице (4.10.), демонстрируют неудовлетворительные технологические характеристики у изучаемого экстракта, полученного по нашему методу. В результате проведенных испытаний, получены =33,39; V0=78 смЗ; V10=76 смЗ; V500=58 смЗ; V1250=58 смЗ .

следующие данные:

–  –  –

4.4.5. Количественное определение содержания сапонинов для контроля качества сырья Количественное содержание сапонинов в сухом экстракте стиракса лекарственного определяли при помощи, разработанной и валидированной методики ЯМР- 1Н, изложенной в главе 2 (см. п. 2.2.7.). Для сапонина В был выбран сигнал при 5.94 м.д., для сапонинов А и С выбрана совокупность сигналов в области 5.70-5.8м.д. Сигналов дезацилсапонина, не перекрывающихся другими сигналами, не обнаружено. В результате получено содержание сапонина В = 2,7 ± 0,1 мг (5,8 ± 0,21%), суммы сапонинов А и С = 10,4 ± 0,21 мг (22,5 ± 0,45%) (Рисунок 4.17.). Содержание сапонинов А, В, С в образцах сухого экстракта стиракса лекарственного составило от 28,3 до 29%. Установлена норма содержания суммы сапонинов в сухом экстракте стиракса лекарственного не менее 27% .

Рисунок 4.17 .

Спектр ЯМР 1Н сухого экстракта стиракса лекарственного На основании проведенных экспериментов по стандартизации СЭСЛ разработан нами проект НД «Стиракса лекарственного экстракт сухой (СЭСЛ)»- приложение № 5 .

–  –  –

Как видно, из представленных данных в таблице 4.12., СЭСЛ соответствует требованиям по всем показателям качества и позволяет уставить срок годности в течение 24 месяцев .

Определение биологических свойств СЭСЛ 4.6 .

4.6.1. Оценка активности БАВ Styrax officinalis в опытах in silico Одно из фармакологических действий сапонинов это спермицидная активность. Прежде чем выделять БАВ и разрабатывать лекарственную форму на основе сапонинов стиракса мы изучили их фармакологическую активность in silico. На рисунке 4.18. показан механизм действия сапонинов на липидный бислой в плазматической мембране сперматозоидов. Действие сапонинов приводит к везикуляциям и вакуолизациям. Эти эффекты разрушают мембрану и тем самым приводят к разрушению спермиев .

Мы предполагаем такие же эффекты у сапонинов стиракса лекарственного .

Рисунок 4.18. Схема спермицидного действия сапонинов [Augustin J.M. et al. 2011]

Чтобы понять, обладают ли сапонины стиракса спермицидной активностью и какие ещё свойства они могут проявлять in vivo, была проведена оценка фармакологических свойств сапонинов стиракса с помощью компьютерного моделирования молекул сапонинов стиракса и их взаимодействия с различными рецепторами, ферментами и др .

Компьютерная оценка плейотропного действия сапонинов стиракса лекарственного на основе анализа зависимостей «структура-активность» с использованием программы PASS Химические соединения имеют широкий спектр биологической активности .

Прогнозирование спектров активности веществ (Prediction of Activity Spectra for Substances) (PASS) представляет собой программу, используемую для анализа общей комплексной активности: фармакологическую активность, токсичность, механизм действия, метаболические условия на основе взаимосвязи структурных формул и активности (SAR) с точностью 95% .

Компьютерная визуализация химических структур сапонинов стиракса:

2D химические структуры сапонинов стиракса (А, В, С, стиракс дезацилсапонин) были составлены с использованием пакета Marvin Sketch 2017. В качестве входной информации в программе PASS и сайте Swiss Dock используется информация о структурной формуле молекулы, представленная в виде файла в формате Mol file, либо в виде файла в формате SD file .

Химические структуры сапонинов стиракса (А, В, С, стиракс дезацилсапонин) были определены с помощью ЯМР в предыдущих опубликованных статьях (R. Segal-1964, Y. Yayla - 2002). Структуры сапонинов стиракса были составлены с использованием пакета MarvinSketch 2017, принадлежащего Chem Axon Ltd и сохранились в виде файлов (Mol file, SDF file, JPEG, PDF) .

В рисунке 4.19. представлены геометрически оптимизированные структуры стиракс-сапонинов в 2D-форме .

Рисунок 4.19 .

Структура стиракс-сапогенина (В) в окне программы Marvin Sketch

–  –  –

Прогнозирование биологической активности химических структур сапонинов стиракса / Prediction of activity for chemical structure of styrax saponins Изучение специфической фармакологической активности сапонинов стиракса проводилось с помощью программы PASS .

Компьютерная программа PASS оценивает вероятный профиль биологической активности структурной формулы органического соединения, молекулярная масса которого находится в интервале 50 - 1250 .

В программе PASS биологическая активность представлена качественным образом (активно/неактивно)с оценками вероятности проявления активности: Pa – соединение активно; Pi - неактивно .

Конечную информацию мы получили в виде списка прогнозируемых видов активности с оценками Pa и Pi, которые могут принимать значения в диапазоне от 0,000 до 1,000. Шанс обнаружить конкретную активность в эксперименте тем выше, чем больше значение Pa и меньше значение Pi для данной активности .

Для анализа в программе использовались химические формулы стиракс дезацилсапонина, сапогенина стиракса А, сапогенина стиракса В и сапогенина стиракса С - несахарная часть сапонинов стиракса А, В, С, полученная гидролизом .

Результаты показали, что дезацилсапонин имеет 283 прогнозируемые активности, около 60 из них с высокими значениями Pa и низкими значениями Pi .

Такое сочетание показателей прогнозирует высокую фармакологическую активность .

Некоторые из высоких ожиданий: гепатопротектор (Pa: 0,992, Pi: 0,001), ингибитор экспрессии ICAM1 (Pa: 0,971, Pi: 0,000), стимулятор Caspase3 (Pa:

0,970, Pi: 0,002) и других. Полученные результаты представлены в табл. 4.13 .

Таблица 4.13 .

– Результаты прогнозирования биологической активности химических структур сапонинов стиракса с помощью программы PASS

–  –  –

Как видно из приведённых в табл. 4.13. данных, сапогенины стиракса имеют сходную предсказуемую активность друг с другом и со структурой их сапонина. Они обладают контрацептивной активностью и являются антагонистами целостности мембран, что говорит о возможности использовать БАВ стиракса лекарственного в качестве спермицидного агента. Кроме того, сапогенины и сапонин стиракса лекарственного по результатам компьютерного моделирования могут обладать противовоспалительным, противогрибковым и противовирусным действием .

Предполагаемым способом метаболизма является взаимодействие с CYP2H и UDP-глюкуронозил трансферазой. Вероятность побочных эффектов и токсичности прогнозируется низкая, данные представлены в табл. 4.14.. Однако сапогенины стиракса А, В и С показывают чуть больше токсичности и побочных эффектов, чем общие сапонины .

Таблица 4.14 .

– Побочные эффекты и токсичность сапогенинов стиракса лекарственного по программе PASS

–  –  –

По результатам моделирования фармакологической активности в программе PASS предполагается, что сапогенин стиракса А и сапогенин стиракса С будут субстратом для фермента CYP2J с (Pa: 0,556) и (Pa: 0,629) соответственно, тогда как сапогенин стиракса B, как предполагается, может является субстратом для CYP2H с (Pa: 0,728) .

Проведенные нами исследования по компьютерному моделированию фармакологической активности БАС стиракса лекарственного, показали перспективность использования данных соединений для разработки лекарственных форм спермицидного действия .

4.6.2.Исследование специфической активности экстрактов стиракса лекарственного (Styrax officinalis L.) в опытах in vitro Изучение спермицидного действия суммы сапонинов в СЭСЛ При исследовании спермицидной активности суммы сапонинов в СЭСЛ in vitro после смешивания нативной спермы и растворов различных концентраций сапонинов стиракса в хлорид натрия 0,9% в равных количествах и последующего нанесения смеси на предметное стекло и исследовали спермы в подвижном и активно подвижном виде по методу (Г. 2, п. 2.2.8.). Результаты исследований 12 образцов представлена в приложении 3, среднее значение и стандартная ошибка среднего представлены в таблице (4. 15.) .

Таблица 4.15 .

– Влияние водных растворов суммы сапонинов в сухом экстракте из стиракса лекарственного различных концентраций на жизнеспособность спермиев

–  –  –

Из таблицы (4. 15.) видно, что в экспериментах in vitro после смешивания в равных количествах нативной спермы с растворами сапонинов стиракса лекарственного, было установлено что подвижных и живых спермиев в изучаемых смесях не наблюдалось с раствором 0,5%, где 100%-ная эффективность проявлялась в концентрации 0,5 % в моменте смешивания спермиев с раствором сапонинов стиракса (минимальная активная концентрация) .

4.6.3. Изучение бактериостатической и фунгистатической активности жидкого и сухого экстрактов околоплодников стиракса лекарственного (Styrax officinalis L.) в опытах in vitro

Антимикробную активность изучали для 2 образцов экстрактов:

жидкий водный экстракт околоплодников стиракса лекарственного с сухим остатком 64 %;

сухой очищенный экстракт околоплодников стиракса лекарственного .

В результате изучения установлено (см. таблицу 4.16.), что все изученные образцы обладают слабой антимикробной активностью в отношении грамположительных бактерий Staphylococcus aureus 209-P, в отношении грамотрицательных бактерий Esherichia coli АТСС 25922, Proteus vulgaris ATCC 6896 и Pseudomonas aeruginosa АТСС 9027, также дрожжеподобных грибов Candida albicans АТСС 10231:жидкий водный экстракт околоплодников в разведении 1:8-1:16 и сухой очищенный экстракт околоплодников в концентрации 2000-4000 мкг/мл .

В отношении мицелиальных грибов Microsporum canis 252:жидкий водный экстракт околоплодников в разведении 1:5120 и сухой очищенный экстракт околоплодников в концентрации 31,2 мкг/мл .

Таблица 4.16 .

– Антимикробная активность жидкого и сухого экстракта околоплодников стиракса лекарственного (Styrax officinalis L.) в опытах in vitro (разведение, концентрация) (мкг/мл)

–  –  –

Таким образом, проведенными исследованиями установлено наличие у 2 изученных образцов слабой антимикробной активности в отношении Staphylococcus aureus 209-P, Esherichia coli АТСС 25922, Proteus vulgaris ATCC 6896, Pseudomonas aeruginosa АТСС 9027, Candida albicans АТСС 10231 и сильной антимикотической активности в отношении Microsporum canis 252: у жидкого водного экстракта околоплодников в разведении 1:5120 и у сухого очищенного экстракта околоплодников в концентрации 31,2 мкг/мл .

Изучена сравнительная антимикробная активность экстрактов стиракса жидкого и сухого (СЭСЛ). Установлено, что все экстракты обладают выраженным антимикробным действием, но СЭСЛ обладает высшей активностью чем жидкий неочищенный экстракт. А это показатель о том, что антимикробный эффект принадлежит сапонинам в СЭСЛ и не других БАВ в жидком экстракте .

ВЫВОДЫ ПО ГЛАВЕ 4

1. Разработана методика выделения сухого экстракта из околоплодников стиракса лекарственного. Установлены основные технологические характеристики. Оптимальный выход сухого экстракта достигается при размере частиц от 2,5 до 0,25 мм, оптимальным растворителем является чистый метанол или более безопасный, но менее технологичный 70% спирт, оптимальное количество циклов экстракции 8-10 и время 6-7 часов;

2. Изучение химических состав СЭСЛ с помощью методов УФ, ВЭЖХ, МС и ЯМР спектроскопии, подтверждено присутствие 28% суммы сапонинов;

3. Предложена стандартизация СЭСЛ по показателям: внешний вид и микроскопические признаки СЭСЛ, растворимость, подлинность, сыпучесть и количественное определение содержания сапонинов в СЭСЛ, на основе полученных результатов разработан проект НД на ЛС «Стиракса лекарственного экстракт сухой (СЭСЛ)»;

4. Определены биологические свойства СЭСЛ:

- методом in silico установлена потенция биологических активности сапонинов стиракса лекарственного, по компьютерному моделированию фармакологической активности БАС стиракса лекарственного показали перспективность использования данных соединений для разработки лекарственных форм спермицидного действия .

- установлена в результате проведённых исследований методом in vitro спермицидная активность СЭСЛ. При использовании 0,025 г СЭСЛ активность была максимальной уже в момент смешивания .

- методом in vitro установлена антимикробная активность СЭСЛ, что позволяет предположить наличие потенциальной эффективности в отношении сопутствующих заболеваний половых путей при использовании его в составе вагинальных форм контрацептивного действия .

ГЛАВА 5. РАЗРАБОТКА СОСТАВА, ТЕХНОЛОГИИ И

СТАНДАРТИЗАЦИЯ СПЕРМИЦИДНОЙ ПЛЕНКИ НА ОСНОВЕ СУХОГО

ЭКСТРАКТА СТИРАКСА ЛЕКАРСТВЕННОГО

5.1. Разработка состава и технологии спермицидной плёнки содержащей сапонины стиракса лекарственного Результаты изучения химического состава и спермицидной активности СЭСЛ свидетельствуют о возможности разработки на их основе контрацептивного препарата местного действия .

Лекарственные формы в виде пленок обладают рядом известных положительных характеристик. Они непосредственно вводятся на место аппликации, где создают высокую концентрацию действующих веществ и позволяют достичь значительного спермицидного эффекта при минимальном побочном действии, а также не требуют особых условий для применения (как крем, пена или гель). Пленки выгодно отличаются от вагинальных кремов, которые неудобны в применении, пачкают белье и руки. Кроме того, у кремов и гелей не предусмотрена точность дозирования лекарственного препарата, что приводит к неоднородному распределению при применении во влагалище влекущему за собой снижение контрацептивного эффекта .

5.1.1.Обоснование состава пленки на основе СЭСЛ:

Состав пленок Одним из важных моментов в разработке состава биорастворимых лекарственных полимерных вагинальных пленок является выбор компонентов матрицы .

В качестве структурообразующих веществ в составе пленки использовали различные растворимые в воде полимеры такие, как МЦ, РАП, ПВС. Для выбора полимеров или смеси полимеров и их концентраций, а также пластификаторов позволяющих получить адекватные пленки, были исследованы характеристики пленок различных составов .

Получение растворов ВВ - пленкообразователей Приготовление основы лекарственной формы – пленки, с 1 .

использованием ПВС (поливиниловый спирт) .

Приготовление 6% раствора спирта поливинилового 50 мл: к 3,0 г ПВС, добавляют 50 мл воды очищенной и помещают в нее ПВС. Основообразующее вещество набухает при комнатной температуре в течение 40 минут при постоянном помешивании. Полученную смесь нагревают до температуры 90С, непрерывно перемешивая, до полного растворения, затем охлаждают до комнатной температуры .

Приготовление основы, с использованием Карбопола 940. Для 2 .

приготовления 0,5% раствора карбопола, объемом 50 мл: к 0,25 г карбопола, добавляют 50 мл воды очищенной и помещают карбопол. Основообразующее вещество набухает при комнатной температуре в течение 20 минут, после чего было добавляют несколько капель ТЭА (триэтаноламина) или трометамол до рH 6,5-7,5 и полного растворения, размешивают .

Приготовление основы лекарственной формы с использованием 4 % 3 .

раствора метилцеллюлозы (МЦ). К 2,0 г МЦ, добавляют 25 мл горячей (90°С) воды очищенной и МЦ. Основообразующее вещество набухает при комнатной температуре в течение 40 минут при постоянном помешивании. После охлаждения раствора до комнатной температуры доводят объем до 25 мл и добавляют остальную холодную воду 25 мл .

Приготовление многокомпонентной основы, смесь 1,0 г ПЭГ 1500, 0,5 г 4 .

ПЭГ6000, 2,5 г глицерина, 3,0 г ПЭГ400 и 2,0 г ПГ помещают в колбу и нагревают на водяной бане .

Выбор концентрации активной фармацевтической субстанции сумма сапонинов в сухом экстракте Выбор концентрации БАВ в составе вагинальных пленок со спермицидным действием, основан на собственных результатах по определению спермицидной активности in vitro, поскольку подобных данных нет в литературе .

Проанализировав результаты в исследовании активности in vitro, в качестве рабочей концентрации СЭСЛ выбрана 0,025 г/пленка 25 см 2 ~ 0,15 г/ 6 пленок (150 см2) - для вагинального контрацептивного применения .

Разработка состава пленки Учитывая, что в литературе есть данные об использовании биоразлагаемых полимеров в различных концентрациях и сочетаниях, такие как МЦ, Na-КМЦ, ПВС, альгинат и др., а в качестве пластификатора применяли глицерин. Были изготовлены образцы пленок без/с содержанием действующей вещества по составам, которые представлены в таблице (5.1.) .

–  –  –

Приготовленные образцы основы и лекарственных пленок оценивались по критериям, описанным в научной литературе: морфология, время дезинтеграции, время растворения, результаты представлены в таблице 5.2 .

–  –  –

На основании полученных результатов выбраны составы образцов пленок 6 и 10, обладающие лучшими внешними характеристиками, а также временем дезинтеграции и растворения. В этой связи, было проведено сравнение времени растворения образцов 6 и 10 и спермицидной пленки VCF® (США, одобрен FDA), выбранной в качестве контрольного образца. Растворение проводилось в одинаковых условиях в течении 1 мин. В результате проведенного исследования, нами выбран образец 10, имеющий следующий состав (Таблица 5.3.) .

Таблица 5.3 .

– Состав Вагинальной спермицидной пленки с экстрактом стиракса (ВСПЭС)

–  –  –

Полученные пленки имеют квадратную форму, со стороной 55 см;

толщина – около 200 мкм, гладкую поверхность, без воздушных включений, прозрачные, легко складываются, не липкие, цвет пленок светло желтый (с возможностью добавления окрашивающих агентов), без запаха и вкуса, на изломе

– однородные .

5.1.2. Разработка технология ВСПЭС (ВР) стадии вспомогательных работ:

Подготовка дезинфицирующих растворов; подготовка производственных помещений и необходимого оборудования; подготовка персонала, подготовка БАВ и основы. Подготовка БАВ включает следующие операции: приёмка сырья;

оценка его качества по показателям; взвешивание БАВ. Подготовка основы включает: взвешивание полимера (ПВС и карбопол 980), воды очищенной, глицерина, трометамола, нипагина и нипазола. В конце стадии проводили подготовку упаковки (буфлен) .

(ТП) Стадии основного технологического процесса:

Пленки вагинальные готовили в асептических условиях методом полива .

Начальным этапом приготовления вагинальной пленки с сухим экстрактом стиракса является получение лекарственной композиции, затем СЭСЛ растворяли в смеси вода и трометамол, после чего его вводили в состав полимерной композиции (раствор полимеров) и тщательно смешивали. Разливали пленочную массу после деаэрации на подложки в пластиковую форму с размерами 10 15, .

После сушки, высушенную пленку снимали от подложки, дозировали разрезали ножом до 6 пленок с размером пленки 5 5 см .

(УМО) Стадии упаковывания и маркировки:

Полученный готовый продукт – вагинальные пленки с экстрактом стиракса, после анализа на соответствие НД расфасовывают по 1 пленке в буфлен по ТУ 5453-030-21032843-96 .

Буфлен — это четырехслойный материал, состоящий из алюминиевой фольги и бумаги, соединенных расплавом полиэтилена, и дополнительного слоя полимера, нанесенного на фольгу. Буфлен обеспечивает упаковке необходимую прочность и устойчивость к большинству агрессивных сред. Полимерный слой позволяет выполнять термосваривание, при этом высокая прочность склеенных швов является важным достоинством буфлена .

Упаковку, маркировку осуществляют в соответствии с рекомендациями .

Хранение спермицидных вагинальных пленок на основе экстракта стиракса лекарственного необходимо проводить в сухом, защищенном от света месте, при температуре 15- 25 °С .

Принципиальная технологическая схема получения ВСПЭС представлена на рисунке 5.1 .

–  –  –

Пленки, получаемые по представленной на рисунке 5.1. технологии, представляют собой прозрачные, желтоватого цвета, гладкие, без воздушных включений квадратные пластинки 55 см, толщиной около 200 мкм, легко складывающиеся, не липкие, без запаха и вкуса, на изломе – однородные .

Для подтверждения адекватности разработанной технологии проведена оценка фармацевтической доступности ССС из ВСПЭС:

Cапонины, имеющие кислый характер, определяют титриметрическим методом. Наибольшее распространение получил метод нейтрализации в неводной среде. Титриметрические методы для количественного определения сапонинов проводили по ГФ ХI (потенциометрическое титрование раствором натра едкого аралия маньчжурская, radices Аraliae mandshuricae) .

Тритерпеновые сапонины стиракса лекарственного имеют кислый характер, поэтому полученный раствор ССС титровали потенциометрически раствором натра едкого .

Методика - Количественное содержание ССС, высвобождаемых из пленки при контакте со средой высвобождения (СВ) – 0,001 М раствором уксусной кислоты pH 3,5-4,5 при перемешивании находили следующим образом - в 3 параллельных емкости помещают: А-холостой раствор - 10 мл СВ + основа пленки; В – ВСПЭС (25 мг СЭСЛ) + 10 мл СВ; С- контроль 25 мг СЭСЛ + 10 мл воды очищенной. При температуре 37°С и через определённые интервалы времени пробы отбирают параллельно из образцов А, В и С, которые оттитровывают потенциометрически стандартным раствором NaOH (0,0125 моль/л) .

При титровании отмечают количество титранта, израсходованного на

–  –  –

2 объем раствора натра едкого (0,0125 моль/л), израсходованного на титрование пробы В, в миллилитрах;

1 объем раствора натра едкого (0,0125 моль/л), израсходованного на 3 объем раствора натра едкого (0,0125 моль/л), израсходованного на титрование холостого раствора А, в миллилитрах;

–  –  –

40.11 25 16.23

-5 0 10 20 30 40 50 60 70

–  –  –

В результате установлено, что ССС полностью высвобождается через минуту вместе с полным растворением плёнки, что подтверждает адекватность технологии .

Определение показателей качества вагинальной пленки 5.2 .

Согласно данным обзора литературы для стандартизации пленок могут быть использованы следующие показатели качества: внешний вид, масса пленки, pH, содержание влаги и время дезинтеграции время растворения и др .

5.2.1. Внешний вид: Визуальное наблюдение поверхности пленки: Гладкая, прозрачная, однородная, без воздушных включений, светло-желтого цвета;

Размер пленки: квадрат 5 см х 5 см;

Толщина: Измерение проводили при помощи микрометра. Методика:

Среднее значение 6 измерений в разных местах пленки (в центре и четырех углах) [27, 28]. Результаты представлены в Таблице 5.5 .

Таблица 5.5 .

– Толщина пленки 25 см2 и отклонение от средного значения

–  –  –

5.2.2. Масса пленки (Однородность массы): Определение проводят в соответствии с требованиями ГФ XIII ОФС «Однородность массы дозированных лекарственных форм». Нами было проведены трехкратные измерения для 6 полученных образцов одной серии. Результаты представлены в Таблице 5.6 .

Таблица 5.6 .

– Средняя масса пленки 25 см2 и отклонение от средней массы,

–  –  –

определения изменения рН вагинальных жидкостей после дисперсии/растворения пленки, нами был приготовлен раствор, имитирующий искусственную вагинальную жидкость – 0,001 М раствор уксусной кислоты рН=3,5 в количестве 20 мл. Результаты представлены в таблице (5.7.) .

Таблица 5.7 .

– Значение рН раствора гелеобразования и дисперсии пленки в ВЖИ

–  –  –

5.2.4. Содержание влаги: Разница в весе связана с потерей воды .

Содержание влаги рассчитывается, как разница в весе до и после полного высушивания пленки [24, 25, 27], или с использованием аппарата определения влажности (Аквилон АВ-50). Результаты определения влажности представлены в таб. (5.8.) .

Таблица 5.8 .

– Изменение содержания воды % в процессе получения пленок до и после сушки (n=6, Р=95%) (t0,95, 5 = 2,571) .

–  –  –

5.2.5. Время дезинтеграции пленки и время растворения: С целью определения время дезинтеграции (потеря формы), образцы пленки поместили в 20 мл 0,001 М раствора уксусной кислоты рН 3,5 на шейкер и определяли время дезинтеграции [28]. Время растворения определяется после полного растворения пленки. Результаты анализа представлены в таблице (5.9.) .

Таблица 5.9 .

– Время дезинтеграции и растворения вагинальных пленок

–  –  –

Время дезинтеграции пленки (сек) 20,5 3,834 18,702 4,039 20,5±4,04 Время растворения пленки (сек) 64,67 5,391 8,337 5,680 64,67±5,68 Методики качественного и количественного определения 5.3 .

сапонинов стиракса в пленке:

5.3.1. Определение подлинности ВСПЭС Для подтверждения присутствия ССС возможно использование ранее применявшихся методик для околоплодников стиракса лекарственного и СЭСЛ с помощью ТСХ и УФ-спектрофотометрии .

Вне зависимости от состава ВВ пленок, извлечения суммы БАВ из препаратов с метанолом имеют идентичные результаты .

Подготовка образца пленки, для качественного определения используют одну пленку (масса одной пленки размером 55 см примерно равна 0,22 ± 0,02 г), содержит 25 мг (точная навеска) СЭСЛ (с количественным содержанием 7,075 мг сапонинов стиракса А, В и С ), испытуемый образец выдерживают в растворе метанола (15 мл) в течении 1 часа, после чего разрезают ножницами на мелкие кусочки. Затем интенсивно встряхивают на вортексе в течение 5 минут .

В результате исследования установлено, что пленка не растворима в метаноле, в ходе испытаний образец приобрел твердость, также зафиксировано изменение окраски – пленка приобрела белое окрашивание. Промывку пленки метанолом повторяют 3 раза. Затем нами был отобран раствор метанола в колбе и испаряют метанол на роторном испарителе .

ТСХ – на хроматограмме в системе хлороформ-метанол-вода (6:3:1) испытуемого раствора (извлечение из ЛФ) наблюдаются зоны адсорбции на уровне зон адсорбции образцов сапонинов из СЭСЛ с Rf около 0,68 (Рис. 5.3.) .

Рисунок 5.3 .

Хроматограмма растворов сапонинов из; а – СЭСЛ, б – раствора извлечения из ВСПЭС с метанолом в системе хлороформ-метанол-вода (6:3:1), (УФ-свет, 245 нм/ детектор- раствор взвеси дефибринированной крови) .

УФ-спектрофотомерия – В качестве критериев подлинности выбраны характерные максимумы поглощения при длинах волн 270 ± 1 нм и 315 ± 1 нм, представленные на рисунке 5.4 .

Рисунок 5.4 .

УФ-кривые спектрального сканирования растворов сапонинов стиракса лекарственного (1- из СЭСЛ; 2- из ВСПЭС; 3-из основы пленок; 4метанола) .

УФ-спектр поглощения раствора СЭСЛ и раствора ВСПЭС имеют максимумы поглощения при длине волн 270 ± 1 нм и 315 ± 1 нм. Измерения проводились в области от 200 до 400 нм .

5.3.2. Методика количественного определения ССС в ВСПЭС Для количественного определения ССС в пленке была разработана и валидирована методика ЯМР Н. Пробоподготовка образца пленки для количественного определения проведена в соответствии с п. 5.3.1 .

Методика – После полного испарения метанола на роторном испарителе, к содержимому колбы добавляют 1 мл DMSO-d6, встряхивают в течение 1 минуты, центрифугируют в течение 5 минут при 14000 об/мин. Раствор переносят в стандартную ампулу для ЯМР d=5 мм. Регистрируют спектр ЯМР 1Н при следующих условиях: 90 импульс, смещение 5 м.д., развертка 15 м.д., 32 К точек на спектр, 32 повторения, задержка между импульсами 40 с .

В результате анализа установлено, что пленка содержит 5,6 мг суммы А и С сапонина (сигналы в области 5.70-5.8 м.д и 5.41 м.д.) и 1,2 мг В сапонина (сигнал при 5.94 м.д.), что эквивалентно 96,0% от содержания сапонинов в пленке. Спектр ЯМР 1Н сапонинов стиракса из пленки представлен на рисунке 5.5 .

Рисунок 5.5. Спектр ЯМР 1Н сапонинов стиракса из пленки

Валидация методики количественного определения сапонинов стиракса в пленке – ЯМР 1Н Для подтверждения пригодности данной методики для количественного определения сапонинов стиракса в пленке, была проведена ее валидация. Проводя валидацию разработанной методики, мы экспериментально доказываем, что методика количественного определения сапонинов стиракса в пленке с помощью

ЯМР Н пригодна и соответствует заложенным критериям приемлемости:

сходимость, точность, воспроизводимость. Приготовление испытуемых образцов и определение количественного содержания ИДН в них проводили по описанной выше методике количественного определения .

Специфичность (Specificity) Способность методики однозначно определять действующие вещества (сапонины стиракса) в присутствии других компонентов, которые могут присутствовать в образце (пленка) .

Критерии приемлемости и их оценки:

1- Примесные соединения:

а- Должны отсутствовать пики, которые мешают определению анализируемых веществ. Оценка критерия: На хроматограмме – ЯМР 1Н суммы сапонинов стиракса нет никаких сигналов, мешающих определению сигналов сапонинов стиракса А, В, С .

б- На хроматограмме образца сапонинов не должно быть пиков, которые принадлежат растворителю и имеют такое же время удерживания. Оценка критерия: Критерий был достигнут при использовании метанола для экстракции сапонинов из пленки, где матрица пленки не растворима в метаноле и затем использовании DMSO-d6 в качестве растворителя для подготовки образца для ЯМР 1Н .

2- Содержание основных веществ:

Интенсивность сигналов спектра ЯМР 1Н испытуемого образца, должна соответствовать интенсивности сигналов стандартного спектра ЯМР 1Н .

Оценка критерия: На хроматограмме образца сапонинов, сигналы в области 5,41-5,74 м.д. и при 5,73 м.д. соответствуют сапонинам стиракса 1(А) и 3 (С) .

Сигналы при 5,94 м.д. соответствуют сапонинам стиракса 2 (В) .

Условия регистрации спектра ЯМР 1Н стандартного образца (Y. Yayla et al. / Fitoterapia 73 (2002) 320-326) были такими же, как и для испытуемых образцов (1Н ЯМР, 500 MHz и 125 MHz, DMSO-d6) .

Сходимость/повторяемость Критерий сходимости характеризует прецизионность методики при ее выполнении в одних и тех же условиях и одним и тем же аналитиком в течение небольшого промежутка времени. В течение одного дня, один лаборантисследователь проводил 5 измерений количественного содержания сапонинов в пленке для одного и того же образца с помощью ЯМР-1Н .

Критерии приемлемости и их оценки Относительное стандартное отклонение (Sr%) при оценке сходимости полученных результатов определения содержания сапонинов стиракса в пленке должно быть 5 % (=0,05) .

Результаты определения количественного содержания сапонинов стиракса в пленке 55 см2, массой 0,22 ± 0,02 г. и их статистической обработки представлены в таблице 5.10 .

Таблица 5.10 .

– Математическая обработка результатов измерений и испытания сходимости методики № образца xi Показатели мг Массовое содержание сапонинов 6,8 6,6 6,94 6,92 6,85

–  –  –

Точность Методика количественного определения сапонинов в пленке должна обеспечивать требуемую точность оценки показателей. Для определения точности методики готовили 5 параллельных образцов и проводили количественное определение сапонинов в 5 пленках на ЯМР- 1Н .

Критерии приемлемости и их оценки Относительное стандартное отклонение (Sr%) при оценке точности содержания сапонинов стиракса в пленке должно быть 5 % (=0,05) .

Результаты определения количественного содержания сапонинов стиракса в 5 параллельных образцах (5 пленок) и их статистической обработки представлены в таблице 5.11 .

Таблица 5.11 .

– Математическая обработка результатов измерений и испытания точности методики

–  –  –

Воспроизводимость Для определения воспроизводимости методики проводили анализ количественного определения сапонинов стиракса из одного и того же образца на двух разных ЯМР-спектрометрах, «Jeol JNM-ECA 600» и «Jeol JNM-ECS 400» .

–  –  –

Вышеуказанные тесты подтверждают достоверность данной методики для количественного определения сапонинов в пленке с помощью ЯМР-1Н .

5.4. Анализ однородности содержания / дозирования:

Согласно ГФ XIII изд. ОФС.1.4.2.0008.15 «Однородность дозирования»

испытание на однородность дозирования выполняли согласно методике 1, так как масса действующего вещества составляет 25 мг и его массовая доля - 1,1 % .

Количественное определение содержания действующего вещества проводили по отдельности в каждой отобранной для испытания единице препарата или в части препарата (прямое определение содержания действующего вещества) .

Подготовка проб проводилась, как описано выше, но для анализа использована половина пленки с содержанием 25 мг сухого экстракта (около 7,075 мг суммы сапонина/ пленка и около 3,54 в каждом половине) .

В результате проведенного анализа установлено, что половина пленки содержит 2,9 мг суммы (А) и (С) сапонина и 0,8 мг (В) сапонина, что эквивалентно 3,7 мг ~ 104,5 % содержанию сапонинов в половине пленки. Спектр ЯМР 1Н сапонинов стиракса в пленке представлен на рисунке 5.6 .

Рисунок 5.6 .

Спектр ЯМР 1Н сапонинов стиракса из половины пленки Результаты испытания 10 случайных образцов представлены в таблице 5.13 .

Таблица 5.13 .

– Результаты анализа однородности содержания в половине пленке (n=10, р=95%) (t0,95, 9 = 2,262) .

–  –  –

БАВ, микробиологическая чистота и масса содержимого упаковки .

Для установления срока годности пленки в упаковке (буфлен), исследовалась стабильность в процессе хранения. Стабильность определялась по показателями качества, установленным ранее и предложенным в проект НД на ВСПЭС - (приложение № 6). Результаты изучения стабильности при хранении представлены в таблице 5.15 .

Таблица 5.15 .

– Результаты изучения стабильности ВСПЭС при хранении в буфлене при температуре 25±5°C и влажности 60±2% .

–  –  –

Как видно, из представленных данных в таблице 5.15., разработанные ВСПЭС соответствуют установленным требованиям по всем исследованным показателям качества, что свидетельствует о их стабильности при хранении в условиях комнатной температуры в упаковке из буфлена и позволяет уставить срок годности в течение 24 месяцев. Мы продолжаем исследование стабильности для возможности увеличения срока хранения до 3-х лет .

Изучение контрацептивного действия ВСПЭС на основе СЭСЛ 5.7 .

в опыте in vivo Комплекс проведенных исследований по разработке вагинальных спермицидных пленок на основе сапонинов стиракса лекарственного и оценке биологической активности in silico, in vitro предполагается завершить оценкой контрацептивного действия in vivo .

Для поведения эксперимента на лабораторных животных – крысах, для удобства введения была приготовлена ЛФ с СЭСЛ – гель, соответствует разработанным ВСПЭС (полупродукт Т.П. 4, Рис. 5.1.) .

Проведено исследование контрацептивного действия и биологической безвредности по методикам, подробно изложенным в гл.2, п 2.2.7.3. (А, Б). Отчет исследования приведен в приложении № 2 .

В результате исследования спермицидной активности in vitro ранее было установлено, что эффективность сапонинов стиракса проявляется уже в концентрации 0,5%, вызывая мгновенную гибель сперматозоидов при полном отсутствии подвижных .

СЭСЛ вводили в состав аппликационного геля 15 %, который легко смешивается с вагинальным секретом и просто вводится крысами .

В результате изучения установлено (см. таблицу 5.16.), что изученные образцы (гель 1,5% СЭСЛ) обладают контрацептивным эффектом, сопоставимым с действием зарубежного контрацептивного препарата «Фарматекс, крем вагинальный» (Франция) .

–  –  –

4. Гель СЭСЛ 1,5 % (опыт) Изучение контрацептивного действия СЭСЛ in vivo при вагинальном введении половозрелым крысам в виде 1,5 % геля выявило 90 % эффективность .

Контрацептивное действие ВСПЭС будет определяться присутствием сапонинов в СЭСЛ и их принадлежностью к классу природных ПАВ, проявляющих свою активность за счет снижения поверхностного натяжения мембраны сперматозоида и ее разрушения под воздействием сапонинов .

В результате осмотра животных, контрольной II и опытной IV групп опыта перед и после каждого нанесения аппликационной формы, не были отмечены и зарегистрированы появления экссудата, изменений внешнего вида видимых слизистых оболочек влагалища и у животных в целом, не было признаков эритем и раздражений .

Гиперемии, ссадин, эритем и раздражений выявлено не было .

Макроскопических изменений не выявлено. Отсутствие микроскопических изменений подтверждено гистологическим исследованием слизистой оболочки влагалища крыс (рис.5.7.) .

–  –  –

Таким образом, по показателям местно-раздражающего действия можно констатировать, что препарат сухого экстракта стиракса лекарственного гель 1,5% не обладает местно-раздражающим действием .

ВЫВОДЫ ПО ГЛАВЕ 5

1. Разработан состав биорастворимых лекарственных полимерных вагинальных пленок 25 см2 с 25 мг сухого экстракта стиракса лекарственного (около 3% сапонинов стиракса) на основе ПВС, карбопола 980 и глицерина;

2. Обоснованы показатели и нормы качества препарата «Вагинальные спермицидные пленки с сапонинами стиракса», с использованием методик ЯМР, ТСХ и УФ определения подлинности и количественного содержания сапонинов стиракса А, В и С в ЛФ;

3. Проведена валидация разработанных методик качественного и количественного анализа ВСПЭС в процессе хранения в естественных условиях. Установлена стабильность разработанных пленок по всем показателям исследованным качества, что позволило установить срок годности 24 месяца в упаковке - буфлен .

4. Исследование специфической активности и биологической безвредности лекарственной формы на основе сапонинов Styrax officinalis L.в геле in vivo на лабораторных животных (крысы) показало, что 1,5% гель сухого экстракта стиракса лекарственного проявляет спермицидную активность при местном применении и не обладает местно-раздражающим действием .

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. На основе сравнительного анализа данных литературы и результатов оценки биологической активности тритерпеноидных сапонинов Styrax officinalis L. in silico обоснована актуальность разработки местного контрацептивного средства;

2. Методами оптической и СЭ микроскопии установлены диагностические признаки в анатомическом строении нового вида сырья "Околоплодники стиракса лекарственного" и разработан проект НД на него по ряду показателей (внешние признаки, микроскопические признаки, определение основных групп биологически активных веществ, влажность, зола общая, зола не растворимая в 10% растворе НСl, измельченность, коэффициент водопоглощения, количественное определение экстрактивных веществ и суммы сапонинов);

3. Разработана новая методика получения СЭСЛ из фракции частиц сырья размером 2,5-0,25 мм за 8-10 циклов экстракции метанолом (или 70% спиртом) в аппарате Сокслета в течение 6-7 часов с выходом 35% и количественным содержанием суммы сапонинов - 27%, установленной методом ЯМР Н1;

4. Разработаны состав ВСПЭС, содержащий 25 мг СЭСЛ на основе ПВС, карбопола 980, глицерина и технология их получения;

5. Разработана методика установления подлинности и количественного определения сапонинов стиракса лекарственного с использованием ЯМР Н1 .

6. Установлена стабильность ВСПЭС по показателям качества в течение 24 месяцев в упаковке из буфлена;

7. Установлена 99,96% фармацевтическая доступность комплекса сапонинов in vitro, выявлено 90% контрацептивное действие и биологическая безвредность ВСПЭС на лабораторных животных in vivo .

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведённых исследований дана фармакогностическая оценка сырья "околоплодники стиракса лекарственного", получен и стандартизован сухой экстракт околоплодников стиракса лекарственного и разработаны состав и технология вагинальных спермицидных пленок с сухим экстрактом стиракса лекарственного. Подтверждена спермицидная активность ВСПЭС in vitro и контрацептивное действие in vivo на лабораторных животных .

Практические рекомендации Результаты диссертационного исследования могут быть внедрены в учебный процесс для студентов по дисциплинам «Фармацевтическая технология», «Фармацевтическая химия», «Фармакология» и «Фармакогнозия» .

Можно провести дополнительное изучение контрацептивного действия разработанных ВСПЭС для внедрения в качестве инновационного лекарственного средства .

Перспективы дальнейшей разработки темы В развитие научных исследований целесообразно полностью стандартизовать сырье "околоплодники стиракса лекарственного", усовершенствовать методику очистки сапонинов при получении СЭСЛ, провести полный комплекс фармацевтической разработки новых вагинальных ЛФ СЭСЛ в виде крема, геля и пены .

ПЕРЕЧЕНЬ УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

АФС – активная фармацевтическая субстанция БАВ – биологически-активные вещества ВЖИ–искусственная вагинальная жидкость ВЖС – вагинальная жидкость стимулятора ВЛФ – вагинальные лекарственные формы ВМС – внутриматочная спираль ВОЗ –всемирная организация здоровья (WHO) ВПЧ –вирус папилломы человека ВР – вспомогательные работы ВСПЭС – спермицидные вагинальные пленки с экстрактом околоплодников стиракса лекарственного ВЭЖХ – высокоэффективная жидкостная хроматография ГОСТ– государственный отраслевой стандарт ГФ – государственная фармакопея ГХ – газовая хроматография ГХ-МС – газовая хроматография с масс-селективным детектором ДМСО – Диметильсулфоксид ККМ – критическая концентрация мицеллообразования КМАФАнМ – Количество мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов КОЕ – Колониеобразующая единица ЛП – лекарственный препарат ЛРС – лекарственное растительное сырье ЛФ – лекарственная форма МБЧ – микробиологическая чистота МС – масс-спектрометрия МСГ – международный совет по гармонизации МЦ – метилцеллюлоза НД – нормативный документ ОФС – общая фармакопейная статья ОМ – оптический микроскоп ПАВ – Поверхностно-активное вещество ПВС – поливиниловый спирт ПГ – пропиленгликоль ПЭГ – полиэтиленгликоль ПЭМ – просвечивающая электронная микроскопия ПМР – протонный магнитный резонанс РАП–редкосшитые акриловые полимеры СВ – среда высвобождения ССС – сумма сапонинов стиракса СО PQS– стандартный образец (Purified Quillaia Saponin) СЭМ – сканирующая электронная микроскопия (сканирующий электронный микроскоп) СЭСЛ – сухой экстракт стиракса ТП – Технологический процесс ТСХ – тонкослойная хроматография .

ТЭА – триэтаноламин .

УЭЖХ-МСВР – ультра высокоэффективная эффективная жидкостная хроматография с масс-спектрометром высокого разрешения УМО – упаковка, маркировка, отгрузка УФ - СФМ – ультрафиолетовая спектрофотометрия ФС – фармакопейная статья ЯМР – ядерно-магнитный резонанс Caspase – Cysteine-aspartic acid proteases EP – European Pharmacopoeia / Европейская фармакопея ICAM1 – Intercellular Adhesion Molecule 1 NF–National Formulary/ Национальный формуляр PASS– Prediction of Activity Spectra for Substances SAR–Structure–activity relationship USP– Фармакопея США /United States Pharmacopeia

Список используемой литературы

1. Государственная фармакопея Российской федерации. Лекарственное растительное сырье, фармацевтические субстанции растительного происхождения: (ФС.2.5.0050.15) 13-ое издание.- том III.- выпуск 2015.С.729 .

2. Камаева, С. С. Изучение контрацептивного действия лекарственного средства на основе этония / С. Камаева,И. В. Мухина et.al. //ВестникСанктПетербургскогоуниверситета.- 2009.- Сер. 11.- Вып. 1.- С.168-174 .

3. Карамаврова Т. В. Анализ параметров качества вагинальных суппозиториев, обладающих спермицидной и антимикробной активностью / Т. В .

Карамаврова, А. С. Кухтенко // Управління якістю в фармації : матеріали VІІІ наук.-практ.конф. м. Харків.- 2014. – 23 трав.- С. 51-52 .

4. Ладыгина, Е. Я. Химический анализ лекарственных растений: Учеб, пособие для фармацевтических вузов / Е. Я. Ладыгина, Л. Н. Сафронич, В. Э .

Отряшенкова и др. Под ред. Н. И. Гринкевич, Л. Н. Сафронич.

[Электронный ресурс].– Режим доступа:

1983.http://chem21.info/page/040010195188236196187150131077039115254123145184/

5. Лекарственное растительное сырье, содержащее сапонины [Электронный ресурс].– – Режим доступа:

2007-2015.- Pharm Spravka .

http://pharmspravka.ru/biologicheski-aktivnyieveschestva/saponinyi/rasprostraneniya-v-prirode.html

6. Мазнев, Н.И. Энциклопедия лекарственных растений. 3-е изд., испр. и доп. — М.: Мартин 2004 .

7. Николаева И. А. Перспективы рынка анти-ВИЧ/СПИД-микробицидов в России / И. А. Николаева, Э. В. Карамов, И. Г. Сидорович // Иммунология.- 2013. – № 6.- том 34.- С.292-297 .

8. Описание сапонинов, GoMedicine [Электронный ресурс].– 2017.– Режим доступа: http://www.satelin.ru/gmjs-47-3.html .

9. Тихонов, В.Н. Лекарственные растения, сырье и фитопрепараты / В.Н .

Тихонов, Г.И. Калинкина, E.H. Сальникова, С.Е. Дмитрука // Учебное пособие .

Часть I. Томск, 2004 .

10.Тихонов, В.Н. Лекарственные растения, сырье и фитопрепараты / В.Н .

Тихонов, Г.И. Калинкина, E.H. Сальникова, С.Е. Дмитрука // Учебное пособие .

Часть II. Томск, 2004 .

11.Хомик, А.С. Назначение и роль микроскопического анализа при установлении подлинности лекарственного растительного сырья / А.С. Хомик, В.В .

Вандышев, Е.А. Мирошникова // Фармацевтическая промышленность.Москва.- 2010.- №3.- С. 54-56 .

12.Шишкова В. Н. Cовременная оральная контрацепция и риск тромбозов / В. Н .

Шишкова // Журнал международной медицины.- 2013.- № 1.- С. 56-61 .

13.Abdulsalam, A. How Quality of Care in the Field of Family Planning Affects Contraception use Among Syrian Women/ A. Abdulsalam// Damascus University for Health Sciences Journal. – Vol. 25. – No. 2. – 2009. – P. 11-28 .

14.Aboutalebi1, R. SaponinTerpenoids; A Brief Review of Mechanisms of Actions and Anti-cancerous Effects / R. Aboutalebi1, A. Monfared // American Chemical Science Journal.- 2016.- Vol. 12. – No. 2.- P.1-8 .

15.Akbari, M. Physiological and pharmaceutical effect of fenugreek: a review / M .

Akbari, et al. // IOSR Journal of Pharmacy.- 2012.- Vol. 2.- Issue 4.- P. 49-53 .

16.Akil, A. Development and characterization of a vaginal film containing dapivirine, a non- nucleoside reverse transcriptase inhibitor (NNRTI), for prevention of HIV-1 sexual transmission/ A. Akil, M. Parniak, C. Dezzuitti, B. Moncla, M. Cost, M. Li, L. Rohan //Drug Deliv. Transl. Res.- 2011.- 1(3).- P.209–222 .

17.Albertini, B. Polymer-lipid based mucoadhesive microspheres prepared by spraycongealing for the vaginal delivery of econazole nitrate/ B. Albertini, N .

Passerini, M. Sabatino, B. Vitali, P. Brigidi, L. Rodriguez // Euro J Pharm Sci.P. 591-601 .

18.Alexander, N. Why consider vaginal drug administration? / N. Alexander, E. Baker, M. Kaptein, et.al. // Fertility and Sterility.- 2004.- Vol. 82.- №1.- P.1-12 .

19.Al-Nasser, Z. Efficacy Some Insecticide and Plant Extracts for Controlling, Beet Flea Beetle, Chaetocnematibialis (Illiger) / Z. Al-Nasser, M.Y. Ibrahim // Damascus University Journal of Agricultural Sciences.- 2011.- Vol. 27.- Issue 2.- P. 107-118 .

20.Al-Snafi, A. E. The Chemical Constituents and Pharmacological Effects of Bryophyllum calycinum. A review / A. E. Al-Snafi // International Journal of Pharma Sciences and Research (IJPSR).- 2013.- Vol 4.- No.12.- P.171-176 .

21.Amaral, E. Vaginal safety after use of a bioadhesive, acid-buffering, microbicidal contraceptive gel (ACIDFORM) and a 2% nonoxynol-9 product / E. Amaral, A .

Perdigo, et.al. // Contraception.- 2006.- №73.- P. 542-547 .

22.Amarowicz, R. Hypocholesterolemic effects of saponins / R. Amarowicz, M. K. O .

Shimoyamada // RocznikiPastwowegoZakaduHigieny.- 1994.- Vol.45 (1-2).P.125 .

23.Anil, H. 21-Benzoyl-barringtogenol C, a sapogenin from Styraxofficinalis / H. Anil // Phytochemistry.-1979.- Vol.18.- P.1760-1761 .

24.Aranha, C. Contraceptive efficacy of antimicrobial peptide Nisin: in vitro and in vivo studies / C. Aranha, S. Gupta, R. Reddy // Contraception.- 2004.- Vol. 69.P.333-338 .

25.Arshad, B. K. Review on vaginal drug delivery/ B. K. Arshad, R. Mahamanaetal.// RGUHS J Pharm Sci.- 2014.- Vol 4.- Issue 4 .

26.Asahina, Y. Arch. Pharm. / Y. Asahina, M. Momoya // Archiv Der Pharmazie.Vol. 56.- P. 252 .

27.Attele, A. S. Commentary ginseng pharmacology multiple constituents and multiple actions / A. S. Attele, et al. // Biochemical Pharmacology.- 2000.- Vol. 58.- P.1685– 1693 .

28.Azila, A. K. Fruit Pod Extracts as a Source of Nutraceuticals and Pharmaceuticals / A. K. Azila, A. Azrina // Molecules.- 2012.- Vol. 17.- P. 11931-11946 .

29.Balakrishnan, S. Micellar Characterisation of Saponin from Sapindus Mukorossi / S .

Balakrishnan, S. Varughese, A. P. Deshpande // Tenside Surfactants Detergent.Vol.43.- №5.- P. 262-268 .

30.Baloglu, E. Strategies to prolong the intravaginal residence time of drug delivery systems/ E. Baloglu, Z. Senyigit, S. Karavana, A. Bernkop-Schnurch // J Pharm .

Sci.- 2009.- 12(3).- P.312–336 .

31.Bayer, L. ACIDFORM: a review of the evidence / L. Bayer, J. Jensen // Contraception.- 2014.- Vol. 90.- №1.- P.11-8 .

32.Baytop, A. Farmos6tik Botanik.- Istanbul.- 1967.- P. 213 -214 .

33.Bock, B. Rfrentiel des trachophytes de France mtropolitaine / B. Bock, et al. // version 3.02.- 26 janvier 2016 .

34.Borrelli, F. The Plant Kingdom as a Source of Anti-ulcer Remedies / F. Borrelli, A .

I. Angelo // Phytother. Res.- 2000- Vol.14.- P.581–591 .

35.Bruneton, J. Pharmacognosie: Phytochimie, Plantes Mdicinales / J. Bruneton // Lavoisier.-Paris.- 2009 .

36.Brusotti, G. Antimicrobial and phytochemical properties of stem bark extracts from Piptadeniastrum africanum (Hook f.) Brenan / G. Brusotti, et al.// Industrial Crops and Products.- 2013.- Vol. 43.- P.612– 616 .

37.Cabo-Conzalez, A. M. Еdicin y traduccin del kitb Al-mi de Ibn al-Bayr / A .

M. Cabo-Conzalez // BIBLID.- [1133-8571].-2011.- Vol. 18.- P. 65-96 .

38.Cabrera-Orozco A. Soybean: Non-Nutritional Factors and Their Biological Functionality / A. Cabrera-Orozco, C. Jimnez-Martnez, G.Dvila-Ortiz .

ресурс].–2016.- Режим доступа:

[Электронный https://www.intechopen.com/books/soybean-bio-active-compounds/soybean-nonnutritional-factors-and-their-biological-functionality .

39.Central office of Statistics - survey of the Syrian family health in the Syrian Arab

Republic [Электронный ресурс]. –2011. –Режим доступа:

http://www.cbssyr.sy/index-EN.htm .

40.Chaieb, I. Saponins as Insecticides: a Review/ I. Chaieb // Tunisian Journal of Plant Protection.- 2010.- Vol. 5.- No. 1 .

41.Chen, J. C. Effect of Panax notoginseng saponins on sperm motility and progression in vitro / J. C. Chen, M.X. Xu, L.D. Chen, Y.N. Chen, T.H. Chiu // Phytomedicine.Vol. 5.- No.4.- P.289-292 .

42.Chen, J. Composition producing adhesion through hydration. In: Adhesion in Biological Systems/ J. Chen, C. Cyr, // Manly R.S. (Ed.), Academic Press New York.- 1970.- P.163–184 .

43.Chen, J. Evaluation of the Efficacy and Safety of hyaluronic acid vaginal gel to ease vaginal cryness: a multicenter, randomized, controlled, open-label, parallel group, clinical trial// J. Chen, L. Geng, X. Song, H. Li, N. Giordan, Q. Liao// J sexu Med.June 2013.- Vol.10.- No.6.- P.1575-84 .

44.Chun-Su, Y. Chemical and pharmacological studies of saponins with a focus on American ginseng / Y. Chun-Su, et al. // J Ginseng Res.- 2010.- Vol. 34.- No.3.- P .

160–167 .

45.Clarke, G. Sperm immobilizing properties of lemon juice / G. Clarke, S. Mc Coombe, R. Short // Fertility and Sterility.- 2006.- Vol.85.- P.1529-1530 .

46.Coleman, J. J. Characterization of plant-derived saponin natural products against Candida albicans / J. J. Coleman, I. Okoli, G. P. Tegos, E. B. Holson, F. F. Wagner, M. R. Hamblin, E. Mylonakis // ACS Chem.Biol.- 2010.- 5(3).- P.321-332 .

47.Correa, M. P. Dicionario das PlantasUteis do Brasil e das Exoticas Cultivadas.-vol II.- Ministerio da Agricultura: Rio de Janeiro.- Brazil.- 1931 .

48.Dande, P. R. Evaluation of saponins from Sesbania sesban L. for its antifertility effect in female albino rats / P. R. Dande, et al. // World Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences.- 2014.- Vol. 3.- Issue 3.- P. 1039-1054 .

49.Das-Neves, J. Current perspectives on vaginal drug delivery/ J. Das-Neves, R .

Palmeira-de-Oliveira, A. Palmeira-de-Oliveira, F. Rodrigues, B. Sarmento //KhutoryanskiyV.- Ed. New Jersey.-John Wiley & Sons .

50.Das-Neves, J. Vaginal drug delivery in pharmaceutical manufacturing /J. Das-Neves, M. Amaral, M. Bahia //handbook: Production sand processes.- Hoboken, New Jersey: Wiley.- 2008.- P.809–879 .

51.Davis, P. H. Flora of Turkey and The East Aegean Islands / P. H. Davis // University of Edinburg Press.- vol. 4.- 1972 .

52.D'Cruz, J. AZT derivatives exhibiting spermicidal and anti-viral activity / J. D'Cruz, M. Uckun, T. Venkatachalam // United States Patent No. 20020025922.- February 28.- 2002 .

53.De-Ven, H. V. Nanosuspensions of chemically modified saponins: Reduction of hemolytic side effects and potential tool in drug targeting strategy / H. V. De-Ven, L .

Van Dyck, W. Weyenberg, L. Maes, A. Ludwig // J. Controlled Release.- 2010.P. 122–123 .

54.Dobaria, N. A novel itraconazole bioadhesive film for vaginal delivery: Design, optimization, and physicodynamic characterization/ N. Dobaria, A. Badhan, R .

Mashru //AAPS Pharm-Sci. Tech.- 2009.- Vol.10.- No. 3.- P.951–959 .

55.Dubey, R. Sperm immobilization activity of aqueous, methanolic and saponins extract of bark of Ziziphus Mauritiana / R. Dubey, K. Dubey, C. Sridhar et al.// Der Pharmacia Sinica.- 2011.- Vol.2. No. 2.- P.11-16 .

56.Edson J. Artificial oocyte activation with calcium ionophore A23187 in intracytoplasmic sperm injection cycles using surgically retrieved spermatozoa / J .

Edson // Fertility and Sterility.- 2009.- Vol. 92.- No. 1.- P.131-136 .

57.Egidio, M. Pharmaceutical compositions containing rifaximin for treatment of vaginal infections./ M. Egidio, R. L. Gabriele, D. Subhash, G. Massimo.// S.P.A. US 5314904 A.- May 1994 .

58.Encyclopaedia Britannica. – Book of the year. – 2009, 2011, 2014.[Электронный ресурс]. –2016. –Режим доступа: https://www.britannica.com/topic/BritannicaBook-of-the-Year .

59.Ensign, L. Mucus Penetrating Nano particles for Vaginal Drug Delivery Protect Against Herpes Simplex Virus/ L. Ensign, B. Tang, Y. Wang, T. Tse, T. Hoen, R .

Cone, et.al.// SciTransl Med.- 2012.- 4(138).- P.138 .

60.Faour, M. Fertility Policy and Family planning in the Arab Countries/ M. Faour //Studies in Family Planning.- 1989.- Vol. 20.- No. 5.- P. 254-263 .

61.Fertility patterns in the Arab region/ S. Farid //International Family Planning Perspectives.-1984.- Vol. 10.- No. 4.- Р. 119-125 .

62.Fournier, P. Les Quatre Flores de la France, Corse Comprise: Generale, Alpine, Mediterranee / P. Fournier // Littorale, 2e ed. Lechevalier.- Paris.- 1977 .

63.Francis, G. The biological action of saponins in animal systems: a review / G .

Francis, Z. Kerem, H. P. Makkar, K. Becker // Br. J. Nutr.- 2002.- 88(6).- P.587-605 .

64.Francis, G. The biological action of saponins in animal systems: a review / G .

Francis, et al. // British Journal of Nutrition.- 2002.- Vol.88.- P.587–605 .

65.Fritsch, P. W. Isozyme analysis of intercontinental disjuncts within Styrax (Styracaceae): implications for the Madrean-Tethyan hypothesis / P. W. Fritsch // Am. J. Bot.- 1996.- Vol. 83.- P. 342–355 .

66.Fritsch, P. W. Population structuring and patterns of morphological variation in California Styrax (Styracaceae) / P. W. Fritsch // Aliso.- 1996.- Vol. 14.- P. 205– 218 .

67.Fritsch, P.W. Phylogeny of Styrax based on morphological characters with implications for biogeography and infrageneric classification / P.W. Fritsch // Syst .

Bot.- 1999.- Vol. 24.- P. 356-378 .

68.Garg, S. Advances in development, scale-up and manufacturing of microbicide gels, films, and tablets/ S. Garg, D. Goldman, M. Krumme, L. Rohan, S. Smoot, D .

Friend// Antiviral Res. Suppl..- 2010.-1.-P.19–29 .

69.Garg, S. Advances in development, scale-up and manufacturing of microbicide gels, films, and tablets/ S. Garg, D. Goldman, M. Krumme, L. Rohan, S. Smoot, D .

Friend.// Antiviral Res 88Suppl.- 2010.- 1.- P.19–29 .

70.Garg, S. Development and characterization of bioadhesive vaginal films of sodium polystyrene sulfonate (PSS), a novel contraceptive antimicrobial agent/ S. Garg, K .

Vermani, A. Garg, R. Anderson, W. Rencher, L. Zaneveld// Pharm. Res.- 2005.P.584–595 .

71.Ghosal, K. A novel vaginal drug delivery system: anti-HIV bioadhesive film containing abacavir/ K. Ghosal, A. Ranjan, B. Bhowmik// Jour Mater Sci.- 2014.P.1679-89 .

72.Girijashankar, V. Micropropagation of multipurpose medicinal tree Acacia auriculiformis / V. Girijashankar // Journal of Medicinal Plants Research.- 2011.Vol.5.- No. 3.- P.462-466 .

73.Gossypol and Derivatives [electronic resource] // GPE Discussion paper series.Режим доступа: (дата http://www.timtec.net/gossypol-and-derivatives.html .

обращения 15, 9, 2016) .

74.Ham, A. Vaginal film drug delivery of the pyrimidinedioneIQP-0528 for the prevention of HIV infection/ A. Ham, L. Rohan, A. Boczar, L. Yang, R. Buckheit// Jr. Pharm. Res.29.- 2012.- vol.7.- P.1897–1907 .

75.Harwood, H. J. Pharmacologic consequences of cholesterol absorption inhibition:

alteration in cholesterol metabolism and reduction in plasma cholesterol concentration induced by the synthetic saponin Ptigogen in cellobioside / H. J .

Harwood, et al. // Journal of Lipid Research.- 1993.- Vol.34.- P.377-395 .

76.Hassan, S.M. Haemolytic and antimicrobial activities of saponin-rich extracts from guar meal / S.M. Hassan, et al. // Food Chemistry.- 2010.- Vol.119.- P.600–605 .

77.Hocking, G. M. A dictionary of terms in pharmacognosy / G. M. Hocking // Charles Thomas Publ. Co., U.S.A.- 1955.- P. 219 .

78.Hostettmann, K. Saponins / K. Hostettmann, A. Marston // Cambridge University Press.- 2005 .

79.Howse, K. Contraceptive methods used by younger women/ K. Howse //Arab World Population Horizons Factsheet.- 2014.- No.10 .

80.Ibrahim, D. Medical Uses of Forest Types In Al Ghab / D. Ibrahim et al. // Book.Syria.- 2011 .

81.Ikan, R. Naturally Occurring Glycosides / R. Ikan //John Wiley and Sons Ltd.P.304–305 .

82.Jain, A. Novel Trichomonacidal Spermicides / A. Jain, N. Lal et.al. // Antimicrobial agents and chemotherapy.- 2011.- Vol. 55.- № 9.- P.4343-4351 .

83.Jitian, Y., Huiming, G. 2008.- Patent CN101199555 .

84.Kayacik, H. Forest and park agents- Istanbul.- 1966.- P. 198-200 .

85.Kousa, L. Ethical issues regarding reproductive freedom in Syria/ L. Kousa// Revista Romn de Bioetic.- 2007.- vol. 5.- P. 51-61 .

86.Lee, S. J. Antitumor activity of a novel ginseng saponin metabolite in human pulmonary adenocarcinoma cells resistant to cisplatin / S. J. Lee, et al. // Cancer letter.- 1999.- Vol.144.- P.39-43 .

87.Leon, T., Gable, P. 2004.- Patent WO2004103232 .

88.Li, C. Evaluation of a mucoadhesive buccal patch for delivery of peptides: in vitro screening of bioadhesion/ C. Li, P. Bhatt, T. Johnston// Drug Dev. Ind. Pharm.P.919–926 .

89.Lieutaghi, P. The Book Of Trees, Shrubs And Shrubs. Haute Provence. In: Le Livre Des Arbres, Arbustes et Arbrisseaux.- vol. I.- Morel.- 1969 .

90.Liu, J. Benzofurans from Styrax agrestisas Acetyl cholinesterase Inhibitors:

Structure Activity Relationships and Molecular Modeling Studies / J. Liu, V .

Dumontet, A. L. Simonin // Journal of Natural Products.- 2011.- Vol. 74.- P. 2081Liu, W.K. Anti-proliferative effect of ginseng saponins on human prostate cancer cell line / W.K. Liu, et al. // Life Sciences.- 20000- Vol. 67.- P.1297-1306 .

92.Liu, X., Kresevic, J. 2009.- Patent US2009099149 .

93.Machado, R. Vaginal Films for Drug Delivery/ R. Machado, A. Palmeira-DeOliveira, J. Martinez-De-Oliveira et al.// Journal of Pharmaceutical Sciences.Vol. 102.- P.2069–2081 .

94.Mcconville, C. Preformulation and development of a once-daily sustained-release tenofovir vaginal tablet containing a single excipient/ C. Mcconville, D. Friend, M .

Clark, K. Malcolm// J Pharm Sci.- June 2013.- 6(102).- P. 1859-68 .

95.Mishell, D. Contraception by means of a silastic vaginal ring impregnated with medroxyprogesterone acetate/ D. Mishell, M. Talas, A. Parlow, D. Moyer// Amer J Obst And Gyne.- 1970.- 107(1).- P.100-3 .

96.Mohammed, A. Scanning and classification of forest trees in Palestine / A .

Mohammed, A. Bahgat et al. // The Arab Organization for Agricultural Development.- 2007 .

97.Mohd, Jameel. Pharmacological scientific evidence for the promis of Tribulusterrestris / J. Mohd, et al. // IRJP.- 2012.- Vol.3.- No. 5 .

98.Mortazavi, S. An investigation into the role of water movement and mucus gel dehydration in mucoadhesion/ S. Mortazavi, J. Smart// J. Control. Release.- 1993.P.197–203 .

99.NassiriAsl, M. Review of Pharmacological Effects of Glycyrrhiza sp. and its Bioactive Compounds / M. NassiriAsl, H. Hosseinzadeh // Phytother. Res.- 2008.Vol. 22.- P.709–724 .

100. Nemat, Z. Y. Pharmacological activities of saponin-containing fraction derived from Gleditsiacaspica Desf. methanolic fruit extract / Z. Y. Nemat, et al. // Der Pharmacia Lettre.- 2013.- Vol. 5.- No. 2- P.247-253 .

101. Nielsen, J. K. Resistance in the plant, Barbarea vulgaris, and counter-adaptations in flea beetles mediated by saponins / J. K. Nielsen, T. Nagao, H. Okabe, T. Shinoda // J. Chem.Ecol.- 2010.- 36(3).- P. 277-285 .

102. Okunade, A. L. Natural antimycobacterial metabolites: current status / A. L .

Okunade, M. P. Elvin-Lewis, W. H. Lewis // Phytochemistry.- 2004.- 65(8).P.1017-32 .

103. Pakrashi, A. Sperm immobilizing effect of triterpene saponins from Acacia auriculiformis / A. Pakrashi, H. Ray, B.C. Pal, S. B. Mahato // Contraception.Vol. 430- No. 5.- P. 475 .

104. Papadopoulou, K. Compromised disease resistance in saponin-deficient plants / K. Papadopoulou, R. E. Melton, M. Leggett, M. J. Danielsand, A. E. Osbourn // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A..- 1999.- vol.96.- № 22.- P.12923-12928 .

105. Paul, S.In vitro determination of the contraceptive spermicidal activity of essential oil of Trachyspermum ammi (L.) Sprague ex Turrill fruits / S. Paul, S. Chul Kang // New Biotechnology.-2011.- Vol. 28.- Issue 6.- P.684–690 .

106. Pauletti, P. M. The Styracaceae / P. M. Pauletti, H. L. Teles, D. H. Silva,. R .

Arajo, V. S. Bolzani // Rev. bras. farmacogn.-Joo Pessoa.- 2006.- vol.16.- No.4 .

107. Pazar, E. Chemical composition of the endocarps of fruits of Styrax officinalis L .

/ E. Pazar, Y. Akgul // Natural Product Research.- 2015.- Vol. 29.- Issue 15.- P .

1466-1468 .

108. Pazar, E. Chemical Investigations of Styrax officinalis L. Fruits Endocarp / E .

Pazar, Y. Akgl // OP-EN-039.- 2011.- P. 163-164 .

109. Peh, K. Polymeric films as vehicle for buccal delivery: Swelling, mechanical, and bioadhesive properties/ K. Peh, C. Wong// J. Pharm. Pharmaceut. Sci.- 1999.- 2.P.53–61 .

110. Polunin, O. Flowers of the Mediterranean / O. Polunin, A. Huxley // London.P. 143-144 .

111. Proestos, C. Analysis of flavonoids and phenolic acids in Greek aromatic plants:

Investigation of their antioxidant capacity and antimicrobial activity / C. Proestos, I .

S. Boziaris et al. // Food Chemistry.- 2006.- Vol. 95.- P. 664–671 .

112. Rajasekaran, M. Spermicidal activity of an antifungal saponin obtained from the tropical Berbmollugo pentaphylla / M. Rajasekaran, A.G.R. Nair, et al. // Contraception.- 1993.- Vol.47.- P.401-412 .

113. Rao, A. Dietary saponins and human health. Saponins in Food / A. V. Rao, D. M .

Gurfinkel // Feedstuffs and Medicinal Plants: Kluwer Academic Publishers.-2000.P.291 .

114. Reid, G. Influence of three-day antimicrobial therapy and Lactobacillus vaginal suppositories on recurrence of urinary tract infections/ G. Reid, A. W. Bruce, M .

Taylor// Clin Thera.- 1992.- 14(1).P. 11-6 .

115. Roth, A. C. Intermittent prophylactic treatment of vaginal tablet/ A. C. Roth, I .

Milsom, L. Forssman, P. Wahlen// Genitourin Med.- Oct 1990.- 66(5).- P.357-60 .

116. Roumen, F. Efficacy, tolerability and acceptability of a novel contraceptive vaginal ring releasing etonogestrel and ethinyloestradiol/ F. Roumen, D. Apter, T .

Mulders, T. Dieben// Hum Repro.- 2001.- 16(3).- P.469-75 .

117. Saha P. Evaluation of Spermicidal Activity of Mi-Saponin A / P. Saha, S .

Majumdar, et.al. // Reproductive Sciences.- 2010.- Vol. 17.- № 5.- P.454-464 .

118. Samuelsson, G. Drugs of Natural Origin. A Textbook of Pharmacognosy. 5th Edition. / G. Samuelsson // Swedish Pharm. Press.- 2004.- P.354–359 .

119. Segal, R. A new benzofuran from the seeds of Styrax officinalis / R. Segal, I .

Milo-Goldzweig, S. Sokoloff, D. V. Zitscek // J. Chem. Soc.- C 45.- 1967.- P. 2402Segal, R. A new type of saponin from Styrax officinalis L. / R. Segal, H. Govrin, et al. // Tetrahedron Letters.- 1964.- No.10.- P. 527-530 .

121. Segal, R. Effect of ester groups on the haemolytic action of some saponins and sapogenins / R. Segal, M. Mansour, D. V. Zaitschek // Biochem. Pharmacol.- 1966.Vol.15.- P. 1411-1416 .

122. Shah, H. C. Spermicidal agents / H. C. Shah, K. K. Singh // Drug Discovery Ther.- 2008.- vol. 2.- №4.- P.200-210 .

123. Shufeng, Z. Modes of Action of Herbal Medicines and Plant Secondary Metabolites / Z. Shufeng // Medicines.- 2015.- Vol.2.- P.251-286 .

124. Soetan, K. O. Evaluation of the antimicrobial activity of saponins extract of Sorghum Bicolor L / K. O. Soetan, et al.,// African Journal of Biotechnology.Moench.- 2006.- Vol.5.- No.23.- P.2405-2407 .

125. Soni, P. K.Antifertility activities of traditional medicinal plants in male with emphasis on their mode of action: a review / P. K. Soni, G. Luhadia, et al. // Journal of Global Biosciences.- 2015.- Vol. 4.- P.1165-1179 .

126. Srivastava, S. Bacopamonniera -a Future Perspective / S. Srivastava et al. // International Journal of Pharmaceutical Sciences and Drug Research.- 2009.- Vol .

1.- No.3.- P. 154-157 .

127. Staab, R. 2009.- Patent US20090098188 .

128. Stanimirova, R.Surface rheology of saponin adsorption layers / R. Stanimirova, K. Marinova, S. Tcholakova, N. D. Denkov, S. Stoyanov, E. Pelan // Langmuir.P.12486-12498 .

129. State Planning Commission of the Syrian Arab Republic (2006), the Tenth Fiveресурс]. –2006. –Режим доступа:

Year Plan [Электронный https://www.unido.org/sites/default/files/2010-01/syrian_e-book_0.PDF

130. Styrax officinalis L.-eFlore, la flore lectronique de Tela Botanica.–2016 .

BDTFX v.3.02 .

131. Suhagia, B. N. Sapindus mukorossi (areetha): an overview / B.N. Suhagia, I. S .

Rathod // International Journal of Pharmaceutical Sciences and Research.- 2011.Vol. 2.- № 8.- P.1905-1913 .

132. Sung, M. K. Effect of soybean saponins and gypsophila saponin on morphology of colon carcinoma cells in culture / M. K. Sung, C. W. Kendall, A. V. Rao // Food and Chemical Toxicology.- 1995 Vol.33.- No.5.- P.357-366 .

133. Tabbaa, M. The Relation Between the Obstacles of Contraception Usage and Unsafe Abortion in Syria/ M.Tabbaa //Damascus University for Health Sciences Journal.- 2010.- Vol. 26.- No. 2.- Р. 61-73 .

134. Tanaka, O. Application of saponins in foods and cosmetics: saponins of Mohave yucca and Sapindus mukurossi / O. Tanaka, Y. Tamura, H. Masuda, K. Mizutani // Adv. Exp. Med. Biol.- 1996.- 405.- P.1-11 .

135. Tayoub, G. Composition of volatile oils of Styrax (Styrax officinalis L.) leaves at different phenological stages / G. Tayoub, I. Schwob, et al. // Biochemical Systematics and Ecology.- 2006.- Vol. 34.- P.705-709 .

136. Tayoub, G. Essential oil composition of leaf, flower and stem of Styrax (Styrax officinalis L.) from south-eastern France / G. Tayoub, I. Schwob et al. // Flavour Fragr. J.- 2006.- Vol. 21.- P. 809–812 .

137. Teuscher, E. Gifte, Biologie, Chemie, Pharmakologie, Toxikologie, 3rd ed./ E .

Teuscher, E. Lindequist, U. Biogene // Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft.Stuttgart.- Germany.- 2010 .

[Электронный ресурс].– Режим доступа

138. The wild flowers 2016.http://www.wildflowers.co.il/english/plant.asp?ID=488 .

139. The World Bank Group [Электронный ресурс]. –2016. –Режим доступа:

http://data.worldbank.org/indicator/SP.DYN.CBRT.IN?end=2014&start=1960

140. The World Bank Group [Электронный ресурс]. –2016. –Режим доступа:

http://data.worldbank.org/indicator/SP.DYN.CBRT.IN?end=2014&locations=SY&st art=1960&view=chart

141. Tian, F. A New Sulfated Saponin from Sea Cucumber, Exhibits Anti-Angiogenic and Anti-Tumor Activities In Vitro and In Vivo/ F. Tian, et al.// Cancer Biology & Therapy.- 2005.- Vol. 4.- No. 8.- P.874-882 .

142. Ulubelen, A. Preliminary investigations on the herb of Styrax officinalis part I / A. Ulubelen, N. Goren // Faculty of Pharmacy.- University of Istanbul.- Turkey.- Bd .

24.- Heft 3 .

143. Umme, H. Preparation and Optimization of Curcumin-Hydroxy Propyl Cyclodextrin Bioadhesive Vaginal Films for Human Papilloma Virus-Induced Cervical Cancer/ H. Umme, H. Shivakumar, A. Heena, P. Younus// J Biom Tiss Engn.- 2014.- 4(10).- P. 796-803 .

144. Upadhyay, A. Pharmacological effects of Sapindus mukorossi Rev./ A .

Upadhyay, D.K. Singh // Inst. Med. Trop. Sao Paulo.- 2012.- Vol.54.- No.5.- P.273Van Dyck, S. The triterpene glycosides of Holothuria forskali: usefulness and efficiency as a chemical defense mechanism against predatory fish / S. Van Dyck, G .

Caulier, M. Todesco, P. Gerbaux, I. Fournier, M. Wisztorski, P. Flammang // J. Exp .

Biol.- 2011.- 214(8).- P.1347-1356 .

146. Varda, Y. Preliminary Studies on the Styrax Oil / Y. Vardar, S. Oflas // Qual .

Plant.-Veg. XXII.- 1973.- Vol. 2.- P. 145-148 .

147. Vardar, Y. Preliminary studies on the styrax oil / Y. Vardar, S. Oflas. // Qual .

Plant. Mater. Veg. XXII.- 1973.- Vol. 2.- P. 145-148 .

148. Wang, X. Elucidation of compatibility principle and scientific value of Chinese medical formulae based on pharmacometabolomics / X. Wang, B. Zhang // Zhongguo Zhong Yao ZaZhi.- 2010.- 35.- P.1346–1348 .

149. Williams J. R. Biological activities and syntheses of steroidal saponins: the sharkrepelling pavoninins / J. R. Williams, H. Gong // Lipids.- 2007.- vol.42.- №1.- P.77Wink, M. Mind-Altering and Poisonous Plants of the World / M. Wink, B. E. van Wyk // Timber Press.- Portland.- OR.- USA.- 2010 .

151. Woodrow, K. Intravaginal gene silencing using biodegradable polymer nano particles densely loaded with small- interfering RNA/ K. Woodrow, Y. Cu, C .

Booth, J. Saucier-Sawyer, M. Wood, W. Saltzman// Nature Materials.- 2009.- 8(6).P.526–533 .

152. World Contraceptive Use (United Nations publication) [Электронный ресурс].–

Режим доступа:

2010.– http://www.un.org/esa/population/publications/wcu2010/Main.html

153. World Health Statistics 2010: WHO Library Cataloguing-in-Publication Data.–

World Health Organization.–[Электронный ресурс].– 2010.–Режим доступа:

http://www.who.int/gho/publications/world_health_statistics/EN_WHS10_Full.pdf

154. Yayla, A. Benzofurans and another constituents from seeds of Styrax officinalis / A. Yayla, H. Anil // Phytochemistry.- 2003.- 63.- P. 939-943 .

155. Yayla, Y. Saponins from Styrax officinalis / Y. Yayla, O. Alankus-Calskan, et al .

// Fitoterapia.- 2002.- Vol. 73.- P. 320-326 .

156. Yoo, J. The physicodynamic properties of mucoadhesive polymeric films developedas female controlled drug delivery system./ J. Yoo, K. Dharmala, C. Lee //Int. J Pharm.309.- 2006.-vol.1.-No.2.-:P.139–145 .

157. Zehavi, U. Fungistatic Activity of Saponin A from Styrax officinalis L. on Plant Pathogens / U. Zehavi, M. Levy, R. Segal // J. Phytopathology.- 1986.- Vol. 116.- P .

338-343 .

158. Zolghadr, J. Vagifem is superior to vaginal premarin in induction of endometrial thickness in the frozenthawed cycle patients with refractory endometria: A randomized clinical trial/ J. Zolghadr, H. Haghbin H, N. Dadras, S. Behdin// Iran J Reprod Med.- Jun 2014.- 12(6).- P. 415-20 .

ПРИЛОЖЕНИЯ

–  –  –

Список рисунков и фотографий в отчете Рисунок 1. Препараты: А-опыт, В-контроль II, С-сравнение Рисунок 2. Распределение животных по группам во время карантина

–  –  –

Рисунок 4. Введение препарата опыта вагинально самке Рисунок 5 .

Введение препарата контроля вагинально самке Рисунок 6. Введение препарата сравнения вагинально самке

–  –  –

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И СОЦИАЛЬНОГО РАЗВИТИЯ

РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА ПО НАДЗОРУ В СФЕРЕ

ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И СОЦИАЛЬНОГО РАЗВИТИЯ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ КАЧЕСТВА ЛЕКАРСТВЕННОГО

СРЕДСТВА

ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ

–  –  –

Настоящая фармакопейная статья предприятия распространяется на околоплодники стиракса лекарственного для получения сухого экстракта, применяемого в качестве лекарственного средства .

ИЗДАНИЕ ОФИЦИАЛЬНОЕ

–  –  –

Собранные с августа по октябрь и высушенные околоплодники дикорастущего многолетнего кустарника или невысокого дерева стиракса лекарственного – Styrax officinalis L., сем. стираксовых – Styracaceae .

Технология получения сырья. При сборе плодов стиракса лекарственного после полного их созревания (с августа по октябрь) обрывают плодов руками, складывая их в мешки или корзины. Для отделения плодов от других частей которые могут попасть в сырье при сборе (от листьев, веточек и плодоножек) собранное сырье провеивают на решетах .

Перед сушкой удаляют семян из плодов (выход свежых околоплодников без семян составляет 65-70% от массы свежесобранных плодов). Сушат околоплодников в сушилках или на открытом воздухе в сухую погоду в тени. При сушке на открытом воздухе рассыпают по 3-4 кг околоплодников стиракса лекарственного на 1 м2, укрывая их от росы в хорошо проветриаемом помещении .

Сушка обычно длится 5-7 дней. В сушилках околоплодники стиракса сушат при температуры до 50°С. Выход сухого сырья составляет 30-35% от массы свежесобранного околоплодников без семян .

ПОДЛИННОСТЬ

Внешние признаки. Цельное сырье. Высушенные околоплодники стиракса лекарственного шарообразной формы разного размера. Апикальный конец чаще всего заострен. Место прикрепления к укороченному побегу (дистальный конец) более округлый. Размеры околоплодников: диаметр от 7 до 25мм. Поверхность покрыта желтовато-коричневыми звездчатыми волосками или мелкими чешуйками. Окраска околоплодников варьирует: от светло-коричневого до светлого сероватого-зеленоватого. Среди тканей околоплодника чётко различаются несколько слоев: светло-коричневая с сероватым оттенком иногда зеленоватая наружная часть плода – экзокарп; желтовато-коричневая, светлая, блестящая внутренняя часть околоплодника – эндокарп; и прозрачный желтоватый слой мезокарпа между ними. Экзокарп – наружная часть околоплодника шероховатая, покрыта складками, пупырышками, мелкими чешуйками и густо опушена волосками. Цвет варьируется от светло-коричневого до землисто-серого и зеленовато-серого. Эндокарп – внутренняя часть околоплодника представляет собой достаточно плотный, светло-коричневый рыже-коричневый или бежевый слой, отслаивающийся как от семени, так и от высохшей мякоти мезокарпа .

Рисунок. 1. Вид отделенного от семени околоплодника Во фрагментах околоплодника после разрушения плода присутствуют темно-зеленные или светло-желтые ткани экзо - и мезокарпа, а также ткани светло-коричневого или желтого цвета (плотные), отслаивающийся от других частей околоплодника и семени – эндокарп .

Рисунок. 2. Вид высушенных плодов после их разрушения Измельченное сырье. При рассмотрении измельченного сырья под лупой (10) или стереомикроскопом (16) видны кусочки околоплодников различной формы, проходящих сквозь сито с отверстиями размером 2,5 мм. Цвет с поверхности и на изломе желтоватый. Запах специфический. Вкус водного извлечения горьковатый .

На Микроскопические признаки. Цельное и измельченное сырье .

поперечном срезе околоплодника видны три слои: экзокарп, мезокарп и эндокарп .

Экзокарп представлен слоем наружной эпидермы. Наружная поверхность околоплодника густо покрыта звёздчато-лучистыми трихомами. Клетки экзокарпа мелкие, толстостенные, расположены в 2-4 слоя. Волоски состоят из 4-12 заостренных клеток, выходящих из одного основания в разные стороны толщиной 6-9 мкм .

Мезокарп состоит из крупных, округлых к наружной части и вытянутых со слабо извилистыми стенками к внутренней части околоплодника клеток. В верхней части мезокарпа встречаются кубические кристаллы. Проводящие элементы расположены в мезокарпе ближе к внутренней поверхности околоплодника. Рядом с ними встречаются одиночные склеренхимные клетки или их группы по 2-3 клетки. В примыкающих к экзокарпию клетках содержатся хлоропласты, а клетки, примыкающие к эндокарпию, нередко служат местом накопления крахмальных зёрен. Эндокарп представлен толстостенными пористыми клетками, расположенными в несколько слоев и уменьшающимися в размерах к внутренней части околоплодника .

Поверхность эндокарпа ровная, местами с выемками, имеющими размеры клеток 30х50 мкм. Главная часть эндокарпа представлена склеренхимой, клетки которой непосредственно примыкают к мезокарпию. Часть эндокарпа, обращённая к полости плода - внутренний эпидермис. На внутреннем эпидермисе плода имеется губчатый слой – аэренхима. На эндокарпе также имеются трихомы .

Они состоят из одной или нескольких длинных заостренных клеток, выходящих из одного основания. В отличие от трихом экзокарпия они расположены спорадически .

Плодоножка имеет цилиндрическую форму и густо покрыт звезчатыми трихомами .

Рисунок 3- Стиракс лекарственный околоплодников 1 (СЭМ), 2 (ОМ)– поперечный срез экзокарпия и мезокарпия: а–Экзокарпий, б– паренхима мезокарпия, с– эндокарий; 3 (СЭМ) –многочисленные звезчатые трихомы на поверхности экзокарпа; 4 (ОМ), 5 (СЭМ) – звезчато-лучистые трихомы; 6 (ОМ)– продольный разрез мезокарпия; 7 (ОМ)– поперечный разрез мезокарпия; 8 (ОМ)– срез мезокарпия: а– сосуды, б– клетки мезокарпия; 9 (ОМ)– крахмальные зёрна в мезокарпе (после окрашивания раствором Люголя): а– крахмальные зёрна; 10 (СЭМ), 11 (ОМ) – поперечный срез эндокарпия; 12 (СЭМ)

–эндокарп в плане (трихомы); 13 (ОМ) – поперечный срез эндокарпа (трихомы);

14 (СЭМ) – плодоножка покрыта волосками .

Определение основных групп биологически активных веществ

1. Тонкослойная хроматография Приготовление растворов .

Раствор стандартного образца (СО PQS). Около 0,05 г (точная навеска) стандартного образца Purified Quillaia Saponin HRS, EP standart растворяют в 2 мл метанола, перемешивают. Срок годности раствора 10 сут .

Испытуемый раствор. Около 0,6 г (точная навеска) сухого экстракта стиракса лекарственного (СЭСЛ) растворяют в 2 мл метанола, перемешивали в течение 1 мин, затем фильтровали. Срок годности раствора 10 сут .

На линию старта аналитической хроматографической пластинки со слоем силикагеля с флуоресцентным индикатором размером 10 20 см на алюминиевой подложке наносят 10 мкл испытуемого раствора (раствора сухого экстракта стиракса лекарственного в метаноле) и 10 мкл раствора стандартного образца (СО PQS) .

Пластинку с нанесенными пробами сушат на воздухе, ее помещают в камеру при температуре 20 °С со смесью растворителей: хлороформ-метанол-вода (6:3:1) .

Пластину вынимают из камеры после прохождения фронта растворителей 15 см, сушат в течение 5 минут, затем опрыскивают раствором взвеси дефибринированной крови .

На хроматограмме испытуемого раствора должно обнаруживаться зоны адсорбции белого цвета с Rf около 0,68 испытуемого раствора и Rf около 0,55 (сапонины СО PQS) .

2. Аналитическую пробу сырья измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 0,5 мм. Около 1 г измельченного сырья помещают в плоскодонную колбу вместимостью 50 мл и прибавляют 20 мл спирта этилового 70%. Содержимое колбы нагревают на водяной бане в течение 30 мин с обратным холодильником. Колбу с содержимым охлаждают до комнатной температуры, фильтруют через складчатый бумажный фильтр в пробирку вместимостью 20 мл .

2 мл извлечения помещают в пробирку вместимость 20 мл, прибавляют 8 мл воды, перемешивают и энергично встряхивают. Наблюдается образование обильной и устойчивой пены (сапонины) .

2 мл извлечения переносят в две пробирки вместимость 20 мл (мерные, с одинаковым диаметром). В одну из пробирок 8 мл раствора кислоты хлористоводородной 0,1Н, в другую - 8 мл раствора натрия гидроксида 0,1Н. Обе пробирки интенсивно встряхивают в течение 1 мин. образуются пена, равная в обеих пробирках по объему (тритерпеновые сапонины) .

2 мл извлечения переносят в фарфоровую чашку диаметром 10 см, помещают на кипящую водяную баню и выпаривают досуха в вытяжном шкафу. К сухому остатку прибавляют 1 мл хлороформа и 5 капель концентрированной серной кислоты. Появиться желтое окрашивание, постепенно переходящее в красное окрашивание (тритерпеновые сапонины) [ТУ 9377-075-04868244-2008] .

ИСПЫТАНИЯ

Влажность. Цельное сырье, измельченное сырье – не более 4,5% .

Зола общая. Цельное сырье, измельченное сырье – не более 1% .

Зола, не растворимая в 10% растворе НСl. Цельное сырье, измельченное сырье – не более 0,1% .

Измельченность сырья. Цельное сырье: частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 3 мм, не более 2%. Измельченное сырье: частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 0,25мм, не более 20%; частиц размером более 2 мм не более 15% .

Коэффициент водопоглощения. Измельченное сырье: равный 2,3 мл/г .

Коэффициент поглощения этанола 96%. Измельченное сырье: равный 0,73 мл/г .

Коэффициент поглощения метанола. Измельченное сырье: равный 0,77 мл/г .

Посторонние примеси Другие части стиракса (листья и ветки). Цельное сырье, измельченное сырье – не более 3 % .

Плодоножки. Цельное сырье, измельченное сырье – не более 6 % .

Органическая примесь. Минеральная примесь. Тяжелые металлы. В соответствии с требованиями ОФС «Определение содержания тяжелых металлов и мышьяка в лекарственном растительном сырье и лекарственных растительных препаратах» .

Радионуклиды. В соответствии с требованиями ОФС «Определение содержания радионуклидов в лекарственном растительном сырье и лекарственных растительных препаратах» .

Остаточные количества пестицидов. В соответствии с требованиями ОФС «Определение содержания остаточных пестицидов в лекарственном растительном сырье и лекарственных растительных препаратах» .

Микробиологическая чистота. В соответствии с требованиями ОФС «Микробиологическая чистота» (Категория 4 А) .

Количественное определение. Цельное сырье, измельченное сырье:

экстрактивные вещества– не менее 59%, сумма сапонинов– не менее 7,5 % .

Экстрактивные вещества Аналитическую пробу сырья измельчают до величины частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями размером 1 мм. Около 6,0 г (точная навеска) высушенных околоплодников стиракса лекарственного (с определенной влажностью W%) помещают в колбу 250 мл, прибавляют 30 мл метанола. Колбу взвешивают и проводят первичную мацерацию сырья в течении 1 ч, после чего соединяют ее с обратным холодильником и нагревают на водяной бане в течение 2 ч. После охлаждения взвешивают колбу с содержимым и восполняют растворителем потерю в массе. Затем взбалтывают колбу и фильтруют содержимое. Эту процедуру повторяют 3 раза, каждый раз прибавляя фильтрат обратно в колбу. Фильтраты объединяют, отбирают 10,0 мл и высушивают эти пробы досуха при температуре 100 °С, затем охлаждают в течение 30 мин в эксикаторе и взвешивают сухой остаток (m) .

Содержание экстрактивных веществ в сухом сырье околоплодников стиракса лекарственного вычисляют по формуле:

;

где: m — масса сухого остатка, г;

W — влажность сырья, % .

Сумма сапонинов 6,0 г (точная навеска) измельченных высушенных околоплодников стиракса лекарственного (с определенной влажностью W%), проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 0,5 мм помещают в патрон из фильтровальной бумаги и опускают в экстрактор аппарата Сокслета. Экстракцию проводят с использованием экстрагента метанол 100 мл, при температуре 55-60 °С до полного извлечения экстрактивных веществ. Полученную в колбу-приемник смесь полностью упаривают на ротационном испарителе в вакууме (230 мБар) при 66°С .

Густой экстракт последовательно обрабатывают этилацетатом и нбутанолом. При подкислении выпадают осадок. Фильтрационный осадок представляет собой густую однородную массу серого цвета. Выпавший осадок отфильтруют, отмывают водой и сушат на воздухе при комнатной температуре до полного испарения растворителей .

К точной навеске 46,3 мг сухого экстракта стиракса лекарственного (СЭСЛ), добавляют 1 мл DMSO-d6, встряхивают в течение 1 минуты, центрифугироваться в течение 5 минут при 14000 об/мин. Раствор берут в стандартную ампулу для ЯМР d=5 мм. Регистрировать спектр ЯМР1Н при следующих условиях: 90 импульс, смещение 5 м.д., развертка 15 м.д., 32 К точек на спектр, 32 повторения, задержка между импульсами 40 с .

Определение содержания сапонинов проводят сравнением интегральной интенсивности откалиброванного по остаточному содержанию протонсодержащего изотопомера DMSO-d6, и сигналов сапонинов, описанных в статье Y. Yayla et al. (2002 г.) (Рис 4). Условия регистрации спектра ЯМР1Н сапонинов образца должны быть такими же, как и для стандартного образца в статье. Спектр ЯМР 1Н СЭСЛ представлен в (Рис. 5) .

Рисунок 4. Результаты ЯМР 1Н сапонинов стиракса А, В, С и дезацилсапонин - Y .

Yayla et al. (2002 г.) Для сапонина В был выбран сигнал при 5.94 м.д., для сапонинов А и С выбрана совокупность сигналов в области 5.70-5.8 м.д и 5.41 м.д. Сигналов дезацилсапонина, не перекрывающихся другими сигналами, не обнаружено .

Для количественного определения измерют интегральную интенсивность сигналов сапонинов стиракса.

Процентное содержание каждого сапонина в испытуемом образце в пересчете на сухое вещество (X, % масс) вычисляют по формуле:

X, % масс= 100 (S' /S'0) (M a0 /M0 a) [100/(100 – W)], где S' – нормированное значение интегральной интенсивности сигнала определяемого вещества;

S'0 – нормированное значение интегральной интенсивности сигнала стандарта;

M – молекулярная масса определяемого вещества;

M0 – молекулярная масса;

a – навеска испытуемого образца;

a0 – навеска вещества-стандарта;

W – содержание влаги, % .

Рисунок 5. Спектр ЯМР 1Н сухого экстракта стиракса лекарственного

Упаковка, маркировка и транспортирование. В соответствии с требованиями ОФС «Упаковка, маркировка и транспортирование лекарственного растительного сырья и лекарственных растительных препаратов» .

Хранение. В соответствии с требованиями ОФС «Хранение лекарственного растительного сырья и лекарственных растительных препаратов» .

–  –  –

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И СОЦИАЛЬНОГО РАЗВИТИЯ

РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА ПО НАДЗОРУ В СФЕРЕ

ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И СОЦИАЛЬНОГО РАЗВИТИЯ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ КАЧЕСТВА ЛЕКАРСТВЕННОГО

СРЕДСТВА

ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ

Стиракса лекарственного экстракт сухой (СЭСЛ)

–  –  –

Настоящая фармакопейная статья предприятия распространяется на сухой экстракт из околоплодников стиракса лекарственного (СЭСЛ) для применения в качестве лекарственного средства .

ИЗДАНИЕ ОФИЦИАЛЬНОЕ

Стиракса лекарственного экстракт сухой, получаемый из околоплодников дикорастущего многолетнего кустарника или невысокого дерева стиракса лекарственного – Styrax officinalis L., сем. стираксовых – Styracaceae, экстракцией спиртом с содержанием суммы тритерпеновых сапонинов не менее 28 % применяемый для производства лекарственных препаратов .

Описание Порошок сухого очищенного экстракта стиракса представляет собой аморфные частицы от светло-кремового до кремового цвета с серым оттенком, со специфическим запахом (Рис 1.) .

–  –  –

Микроскопические признаки СЭСЛ Форма частиц СЭСЛ определяется с помощью СЭМ. Частицы сухого экстракта стиракса лекарственного имеют различные размеры и форму. Частицы многоугольные, с ломанными краями иногда удлиненные иногда округлые .

Поверхность частиц – покрыта выступающими многогранными образованиями .

Даже округлые частицы имеют очень неровную поверхность .

Неровная поверхность частиц не позволяет им скользить относительно друг друга (Рис 2.) .

Рисунок 2. Микрофотографии частиц порошка СЭСЛ под СЭМ Подлинность

1. Тонкослойная хроматография Приготовление растворов .

Раствор стандартного образца (СО PQS). Около 0,05 г (точная навеска) стандартного образца Purified Quillaia Saponin HRS, EP standart растворяют в 2 мл метанола, перемешивают. Срок годности раствора 10 сут .

Испытуемый раствор. Около 0,6 г (точная навеска) сухого экстракта стиракса лекарственного (СЭСЛ) растворяют в 2 мл метанола, перемешивали в течение 1 мин, затем фильтровали. Срок годности раствора 10 сут .

На линию старта аналитической хроматографической пластинки со слоем силикагеля с флуоресцентным индикатором размером 10 20 см на алюминиевой подложке наносят 10 мкл испытуемого раствора (раствора сухого экстракта стиракса лекарственного в метаноле) и 10 мкл раствора стандартного образца (СО PQS). Пластинку с нанесенными пробами сушат на воздухе, ее помещают в камеру при температуре 20 °С со смесью растворителей: хлороформ-метанол-вода (6:3:1) .

Пластину вынимают из камеры после прохождения фронта растворителей 15 см, сушат в течение 5 минут, затем опрыскивают раствором взвеси дефибринированной крови .

На хроматограмме испытуемого раствора должно обнаруживаться зоны адсорбции белого цвета с Rf около 0,68 испытуемого раствора "сумма сапонинов стиракса (ССС)" и Rf около 0,55 (сапонины СО PQS) .

2. 0,2 г СЭСЛ помещают в пробирку вместимость 20 мл, прибавляют 10 мл воды, перемешивают и энергично встряхивают. Наблюдается образование обильной и устойчивой пены (сапонины) .

3. 0,2 г СЭСЛ переносят в две пробирки вместимость 20 мл. В одну из пробирок 2 мл воды и 8 мл раствора кислоты хлористоводородной 0,1Н, в другую 2 мл воды и 8 мл раствора натрия гидроксида 0,1Н. Обе пробирки интенсивно встряхивают в течение 1 мин. образуются пена, равная в обеих пробирках по объему (тритерпеновые сапонины) .



Pages:   || 2 |



Похожие работы:

«Всесибирская олимпиада по БИОЛОГИИ 2016-17. 3аключительный этап. 7-8 кл. Стр. 1 из 3 16. Животные с внутренним известковым скелетом НЕ Всесибирская олимпиада по встречаются среди биологии 2016-17. 3 этап А. хордовых В. членистоногих Б. губок Г. иглокожих 24 февраля 2017 17. Голова може...»

«ШОРИНА Марина  Владимировна АККУМУЛЯЦИЯ КАДАВЕРИНА И ЕГО ФИЗИОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ ПРИ ДЕЙСТВИИ СОЛЕВОГО СТРЕССА 03.00.12 - "физиология и биохимия растений" АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой с...»

«I. Аннотация 1. Цели и задачи дисциплины Целями освоения дисциплины является формирование способности использовать представления о закономерностях воспроизведения и индивидуального развития биологических объектов для решения зад...»

«Б2.В.ОД.1 Медико-биологические основы здоровья 2. Цели и задачи изучения дисциплины Целью освоения дисциплины "Медико-биологические основы здоровья" является формирование знаний об анатомо-физиологических особенностях развития организма на различных возрастных этапах в междисциплинарном взаимодействии дисциплин естественно-научного ц...»

«Постановление Главного государственного санитарного врача РФ от 8 июня 2015 г. N 20 Об утверждении СП 3.1.3263-15 Профилактика инфекционных заболеваний при эндоскопических вмешательствах В соответствии с Федеральным зако...»

«Хапчаев Аскер  Юсуфович ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ  КИНАЗЫ ЛЕГКИХ ЦЕПЕЙ  МИОЗИНА И  БЕЛКА KRP  В РЕГУЛЯЦИИ  СОКРАТИТЕЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ  ГЛАДКИХ МЫШЦ 03.00.04 - Биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степе...»

«Вестник науки Сибири. 2012. № 4 (5) http://sjs.tpu.ru УДК 543.08 ИЗМЕРЕНИЕ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ЕМКОСТИ НА ГРАНИЦЕ ЭЛЕКТРОД/РАСТВОР Кагиров Артур Геннадьевич, В ГАЛЬВАНОСТАТИЧЕСКОМ ИМПУЛЬСНОМ ассистент кафедры экологии и РЕЖИМЕ безопасности жизнедеятельности Института неразрушающеА.Г. Кагиров го контроля ТПУ. E-m...»

«Вышестоящий орган управления: Управление образования администрации муниципального района "Княжпогостский" Муниципальное бюджетное общеобразовательное учреждение "Средняя общеобразовательная школа" пгтСиндор РАССМОТРЕНО школьным МО учителей естественного цикла МБОУ "СОШ" пгтСиндор Про...»

«МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ УО “ВИТЕБСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ” КАФЕДРА МЕДИЦИНСКОЙ БИОЛОГИИ И ОБЩЕЙ ГЕНЕТИКИ БЕКИШ 0.-Я.Л., БЕКИШ В.Я. МЕДИЦИНСКАЯ БИОЛОГИЯ И ОБЩАЯ ГЕНЕТИКА Утверж дено М инистерством образования Республики Беларусь в качестве учебн...»

«ЮЖНО-УРАЛЬСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ УТВЕРЖДАЮ: Декан факультета Механико-технологический _В. И. Гузеев 16.04.2018 РАБОЧАЯ ПРОГРАММА к ОП ВО от 17.10.2017 №007-03-0268 дисциплины Б.1.16 Экология для специальности 20.05.01 Пожарная безопасность уровень специалист тип п...»

«ГОРГ – ГЛОБАЛЬНЫЙ РЕГУЛЯТОР САМОСОХРАНЕНИЯ СОЦИУМА В.А.Антоненков Санкт-Петербург Развивая идеи К.Г.Юнга и свою теорию о существовании генетически ориентированных ролевых групп (ГОРГ) автор выдвигает гипо...»

«Щеголев Алексей Юрьевич Потенцирование NO-зависимой активации растворимой гуанилатциклазы 03.01.04 – биохимия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Научно-исследовательском институт...»

«БЕЛЕВИЧ Ольга Эдуардовна СТРЕКОЗЫ РОДА AESHNA (ODONATA, ANISOPTERA) ПАЛЕАРКТИКИ Специальность  03.00.09 - энтомология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических  наук Новосибирск - 2005 Работа выполнена в лаборатории Экологии насекомых Института систематики и экологии животн...»

«Плосконос Мария Вячеславовна ФИЗИОЛОГИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ ПОЛИАМИНОВ В РЕПРОДУКТИВНОЙ ФУНКЦИИ МУЖЧИН В НОРМЕ И ПРИ ЕЁ НАРУШЕНИЯХ 03.00.13 -физиология Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук Астрахань 2004 Работа выполнена на кафедре общей и биоорганической химии Астраханской государственной медицин...»

«Экология животных Юг России: экология, развитие. №4, 2010 Ecology of animals The South of Russia: ecology, development. №4, 2010 ЭКОЛОГИЯ ЖИВОТНЫХ УДК 597.583.1-152.6 (262.81) ЭТОЛОГИЯ МОРСКИХ РЫБ КАСПИЙСКОГО МОРЯ © 2010 Абдурахманов Г.М.,Сокольская Е.А. Дагестанский государственный университет Астраханский государствен...»

«ОГЭ—2018 Г.И. Лернер БИОЛОГИЯ ТРЕНИРОВОЧНЫХ ВАРИАНТОВ ЭКЗАМЕНАЦИОННЫХ РАБОТ ДЛЯ ПОДГОТОВКИ К ОСНОВНОМУ ГОСУДАРСТВЕННОМУ ЭКЗАМЕНУ Москва АСТ УДК 373:57 ББК 28я721 Л49 Лернер, Георгий Исаакович. Л49 ОГЭ–2018: Биология: 20 тренировочных вариантов экзаменационных работ для подготовки к основному государственному экзамену / Г.И. Лернер. — Москва...»

«ВЕСТНИК ЮГОРСКОГО ГОСУДАРСТВЕННОГО УНИВЕРСИТЕТА 2016 г. Выпуск 1 (40). С. 204–208 УДК 796.015 МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ОСОБЕННОСТИ АДАПТАЦИИ ЖЕНСКОГО ОРГАНИЗМА К ФИЗИЧЕСКИМ НАГРУЗКАМ А. С. Хорькова Период юношества – время бурного расцвета физических и интеллектуальных...»

«ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ Г. МОСКВЫ ЦЕНТР ОБРАЗОВАНИЯ №1865 ВЛИЯНИЕ ЭКОЛОГИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ НА СПЕРМАТОГЕНЕЗ И ПУТИ ПРОФИЛАКТИКИ Автор работы: Фазлыева Рената, ученица 10 "Б" класса, e...»

«биологически активная добавка к пище Официальный дилер O r t h o mol в Ро сс и и ООО "ЭйДи Вантэйдж" те л. ( 495) 5 1 4 4 6 4 9 or thomol.r f@yandex.ru Надежда для мужчин, h t t p : //орто м о л...»

«АННОТАЦИИ ДИСЦИПЛИН ООП ПОДГОТОВКИ БАКАЛАВРОВ ПО НАПРАВЛЕНИЮ 18.03.01 "ХИМИЧЕСКАЯ ТЕХНОЛОГИЯ", ПРОФИЛЬ "ХИМИЯ ПОЛИМЕРОВ МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКОГО НАЗНАЧЕНИЯ" ФОРМА ОБУЧЕНИЯ – ОЧНАЯ СРОК ОСВОЕНИЯ ООП – 4 ГОДА Наименование МЕТОДЫ ПЕРЕРАБОТКИ ПЛАСТМАСС В ИЗДЕЛИЯ дисциплины МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКО...»

«Н А У Ч Н Ы Е ВЕД О М О СТ И Серия Естественные науки. 2012. № 3 (122). Выпуск 18 5 БИОЛОГИЯ УДК 581.81 : 582.681.81 ОСОБЕННОСТИ АНАТОМИЧЕСКОГО СТРОЕНИЯ ДРЕВЕСИНЫ ТОПОЛЯ БЕЛОГО, ПРОИЗРАСТАЮЩЕГО В ЗАПАДНОЙ СИБИРИ Впервые приводится характе...»

«Хелена РУС Хелена РУС Хелена РУС Масс-спектрометрия в медицине Хелена РУС Хелена РУС Хелена РУС Хелена РУС Хелена РУС MALDI-TOF масс-спектрометрия Хелена РУС MALDI Biotyper – экспресс идентификация микроорганизмов • GENOLINK – генотипирование однонуклеотидных полиморфизмов • и оценка качества олигонуклеотидов CLINPROT – поиск пептидных марк...»







 
2018 www.lit.i-docx.ru - «Бесплатная электронная библиотека - различные публикации»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.