WWW.LIT.I-DOCX.RU
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - различные публикации
 


Pages:   || 2 | 3 |

«БЕЛОРУССКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ Кафедра биохимии СТРУКТУРНАЯ БИОХИМИЯ УЧЕБНОЕ ПОСОБИЕ МИНСК УДК 577. 11 (112, 113, 114, 115). 15. 16. ББК в.р. Б Авторы О.И. Губич, ...»

-- [ Страница 1 ] --

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ

БЕЛОРУССКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

Кафедра биохимии

СТРУКТУРНАЯ

БИОХИМИЯ

УЧЕБНОЕ ПОСОБИЕ

МИНСК

УДК 577. 11 (112, 113, 114, 115). 15. 16 .

ББК в.р .

Б Авторы О.И. Губич, Т.Н. Зырянова, Е.О. Корик, Т.А.Кукулянская, С.И. Мохорева, Д.А. Новиков, Н. М. Орл, И.В. Семак Рекомендовано Ученым советом биологического факультета 7. 09. 2011 г., протокол № 1

Рецензенты:

кафедра биохимии и биофизики УО «Международный государственный экологический университет имени А.Д. Сахарова», доцент кафедры биотехнологии и биоэкологи УО «Белорусский государственный технологический университет», кандидат биологических наук Н. А. Белясова Структурная биохимия: учебное пособие /авт. О.И. Губич, Т.Н. Зырянова, Е.О. Корик, Т.А. Кукулянская, С.И. Мохорева, Д.А. Новиков, Н. М. Орл, И.В. Семак .

– Минск: БГУ, 2011. – __ с .

Учебное пособие предназначено для получения теоретических знаний о структуре, биохимических свойствах, функциях и значении белков, ферментов, нуклеиновых кислот, углеводов, липидов, витаминов и коферментов и приобретения практических навыков изучения этих групп веществ путем выполнения лабораторного практикума, решения тестовых заданий, упражнений, задач. Предназначено для студентов, магистрантов, аспирантов .

УДК 577. 11 (112, 113, 114, 115). 15. 16 .

ББК в.р .

©БГУ,2011

ПРЕДИСЛОВИЕ

Биологическая химия – наука, значимость которой возрастает с поразительной быстротой и движущие силы этого прогресса заложены в самой сути этой науки, направленной на познание химических основ процессов жизнедеятельности. Она постоянно обогащается новыми данными о химическом составе, путях и механизмах химических процессов, происходящих в макромолекулах, органоидах, клетках, тканях, органах, организмах на всех уровнях организации живого .

Накопленные за последние десятилетия факты и идеи дали мощный толчок развитию е направлений – молекулярной биологии, биоорганической и бионеорганической химии, биохимической генетике, энзимологии, биоэнергетике, экологической и эволюционной биохимии, медицинской биохимии, космической биохимии. Окончательно сформировались такие современные науки как протеомика и метаболомика. На знании биохимии базируется развитие физиологии растений, животных и человека, микробиологии, классических зоологии и ботаники. Эти обстоятельства убедительно доказывают, что биохимия является важнейшей фундаментальной научной дисциплиной, определяющей возможность решения многих проблем биологии, биотехнологии, медицины, сельского хозяйства, ветеринарии и др .

Возрастающий объем современной биохимической информации диктует необходимость е изучения и начинать целесообразно с получения как теоретических знаний о структуре, свойствах, функциях и значении всего многообразия природных органических соединений, так и практических – овладения основами биохимических методов исследований, применяемых для анализа качественного и количественного состава живых организмов. Закрепить и детализировать знания по этому предмету можно в процессе самостоятельной работы над вопросами, тестами, упражнениями, задачами .





Биохимия предмет нелегкий, усвоить материал можно только при систематической работе в течение прохождения всего курса. Настоящее пособие предназначено для получения современных теоретических знаний и практических навыков по первой части курса – структурной биохимии. Оно состоит из 6-ти глав: «Белки», «Ферменты», «Витамины и коферменты», «Нуклеиновые кислоты», «Углеводы», «Липиды» .

Каждая глава включает раздел, посвященный биохимии данной группы соединений, их классификации, номенклатуре, особенностям строения, значению важнейших представителей. В конце раздела помещены вопросы по каждой теме, которые далее используются при составлении контрольных и экзаменационных заданий .

Второй раздел, содержащийся в главах, – это лабораторный практикум по темам. Он должен помочь приобрести навыки экспериментальной работы и знакомит с основами биохимических методов, применяемых для идентификации перечисленных групп соединений или отдельных представителей и изучения их свойств .

Каждая лабораторная работа включает описание принципа метода и возможностей его применения, перечень необходимых реактивов и материалов, ход выполнения работы. Предлагаемые к выполнению методики являются общепринятыми, при их проведении используется доступное лабораторное оборудование и реактивы .

В третьих разделах глав пособия приведены тесты, упражнения и задачи, они развивают системный многоуровневый подход к усвоению биохимии. Их целесообразно выполнить в процессе самоподготовки .

В пособие включено приложение, содержащее справочные материалы, которыми можно пользоваться как при изучении курса и выполнении лабораторного практикума, так и при выполнении исследовательских работ по биохимии .

В конце книги помещен список учебной, монографической, журнальной литературы, в которой биохимическая тематика изложена наиболее полно .

Учебное пособие подготовлено авторским коллективом кафедры биохимии Белорусского государственного университета .

Главы написаны; «Белки» – доцентом Т.А. Кукулянской, «Ферменты»

– доцентом О.И. Губич, «Витамины и коферменты» – доцентом Е.О .

Корик, «Нуклеиновые кислоты» – доцентом Д.А. Новиковым, «Углеводы» – доцентом С.И. Мохоревой, «Липиды» – доцентом Н.М .

Орл, «Приложение» – доцентами Т.А. Кукулянской и Н.М. Орл. Общая редакция осуществлена доцентом И.В. Семаком .

Выражаем признательность нашим коллегам кафедры биохимии и биофизики УО «Международный государственный экологический университет имени А.Д. Сахарова», доценту кафедры биотехнологии и биоэкологи УО «Белорусский государственный технологический университет», кандидату биологических наук Н. А. Белясовой за полезные замечания по различным разделам книги .

ГЛАВА 1. БЕЛКИ

Белки – это высокомолекулярные азотсодержащие биополимеры, состоящие из -аминокислот, соединенных пептидными связями, в формировании которых принимают участие карбоксильная группа одной и -аминогруппа другой аминокислоты .

Первичная структура белков характеризует их аминокислотную последовательность, которая определяет другие уровни организации этих полимеров – вторичную, третичную и четвертичную структуры .

Последовательность аминокислот в полипептиде определена генетически .

Химические свойства белков обусловлены набором и соотношением аминокислот. Поскольку аминокислоты представляют собой основные строительные единицы всех белков, для понимания биохимии белков необходимо знать биохимию аминокислот .

СТРУКТУРА И ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА

АМИНОКИСЛОТ

–  –  –

неполярные (гидрофобные) (аланин, лейцин, изолейцин, валин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан) ;

полярные (серин, треонин, тирозин, аспарагин, глутамин, цистеин);

кислые, т.е. отрицательно заряженные (аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота);

основные, т.е. положительно заряженные (лизин, аргинин, гистидин) .

Таблица 1.1 .

Классификация -аминокислот

–  –  –

На основе питательной ценности для человека аминокислоты подразделяются на: незаменимые – не могут синтезироваться в организме человека (треонин, метионин, валин, лейцин, изолейцин, фенилаланин, триптофан, лизин), частично заменимые – аргинин и гистидин и заменимые – могут синтезироваться в организме .

Исключение хотя бы одной аминокислоты из пищи приводит к развитию отрицательного азотистого баланса, к истощению, остановке роста и др .

Для нормального развития необходимо, чтобы незаменимые аминокислоты не только регулярно поступали с пищей, но и находились в определенном соотношении. Соотношение незаменимых аминокислот, необходимых человеку, рассчитано относительно триптофана, принятого за 1, и в среднем составляет: лизина 5% лейцина 4; валина 3,5;

фенилаланина,5; изолейцина 2.5; треонина 2,5; гистидина 2; аргинина 1 .

В некоторых белках встречаются аминокислоты, производные кодируемых аминокислот - оксипролин, -карбоксиглутаминовая кислота, гидроксилизин, 3,5-дийодтирозин и др., но их образование происходит уже после включения протеиногенных аминокислот в полипептидную цепь .

Стереоизомерия аминокислот Абсолютное большинство -аминоксилот имеют в структуре хиральные (асимметричные) атомы С, отличающиеся наличием четырех различных заместителей: карбоксильная группа, аминогруппа, атом водорода и боковая цепь R (исключение – глицин, где R – атом водорода). Это обусловливает существование двух стереохимических изомеров – энантиомеров – L- и D-форм аминокислот (рис. 1.1) .

–  –  –

Все аминoкиcлoты, входящие в состав белков, oтноcятcя к L-ряду. Аминокислоты, относящиеся к D-ряду, встречаются в пептидах, генетически не детерминированных (некодируемых), например в пептидных антибиотиках .

–  –  –

Реакционная способность аминокислот обусловлена наличием амино- и -карбоксильных групп, а также функциональных групп боковых цепей.

Все -аминокислоты могут вступать в реакции:

декарбоксилирования (образование аминов) и дезаминирования (образование карбоновых кислот);

переаминирования с -кетокислотами;

-аминокислота + -кетокислота -кетокислота’ + -аминокислота’

–  –  –

образования амидов и сложных эфиров;

взаимодействие аминогрупп с альдегидами (образование шиффовых оснований);

образование N-гликозидов (при взаимодействии с углеводами через аминогруппу);

образование О-гликозидов (при взаимодействии с углеводами через карбоксильную группу);

окисление SH-групп (образование дисульфидных соединений, например, димера цистеина - цистина);

фосфорилирование гидроксиаминокислот (образование сложных фосфорных эфиров);

окисление гуанидиновой группы аргинина .

Универсальной качественной реакцией, используемой для идентификации и количественного определения всех -аминокислот, является их взаимодействие с нингидрином, сопровождающееся образованием окрашенного продукта фиолетового цвета (пурпура Руэмана). Существует ряд химических реакций, которые также используются для количественного определения и обнаружения отдельных аминокислот (реакция Паули на тирозин и гистидин, реакция Адамкевича на триптофан, ксантопротеиновая реакция на ароматические аминокислоты и др.), которые будут подробно рассмотрены далее .

–  –  –

Образование биполярного иона происходит в результате диссоциации

-карбоксильной и протонирования -аминогруппы. Для большинства моноаминомонокарбоновых кислот соотношение цвиттер-ионов к незаряженным молекулам в состоянии равновесия составляет 105-106 (хотя, для удобства в большинстве случаев аминокислоты изображают в незаряженной форме). В зависимости от рН раствора могут преобладать анионы (–СОО-) и катионы (-NH3+) аминокислот, биполярные ионы аминокислот или их смесь .

Степень диссоциации функциональных групп аминокислот характеризуется константами диссоциации .

Необходимо отметить что у положительно и отрицательно заряженных аминокислоты (Лиз, Арг, Гис, Асп, Глу), а также полярных аминокислот имеются дополнительные функциональные группы, способные принимать или отдавать протоны, характеризующиеся своими константами диссоциации .

Поскольку степень диссоциации ионогенных групп зависит от рН, то, естественно, существует такое значение рН раствора, при котором суммарный заряд молекулы аминокислоты равен «0», т.е. молекула электронейтральна.

Такое значение рН называется изоэлектрической точкой рI и определяется по формуле:

рI=(pK1+pK2)/2, где pK1 – константа диссоциации -карбоксильных групп;

pK2 – константа диссоциации -аминогрупп .

Если аминокислота содержит дополнительные ионогенные группы, то при расчете рI учитывается их вклад .

Существует также понятие изоионной точки – это значение рН водного раствора химически чистой аминокислоты. Значения изоэлектрической и изоионной точек в разбавленных растворах

–  –  –

Кислотно-основные свойства аминокислот, значения констант диссоциации ионогенных групп могут быть определены при анализе кривых титрования (рис. 1.1.) .

–  –  –

Рисунок 1.2 .

Кривые кислотно-основного титрования 0,1 М раствора аланина (0,1 М раствором НСl и 0,1 М раствором NaOH) .

Если аминокислота имеет одну карбоксильную и одну аминогруппу (например, аланин, валин, лейцин, серин, метионин и др.), то в кривой титрования наблюдаются 2 точки, соответствующие значениям рН, при которых происходит диссоциация (рК1) и протонирование (рК2) ионогенных групп. Большинство рК карбоксильных групп аминокислот лежит в диапазоне 1,8-2,8, а рК аминогрупп – 8,8-10,6. В кривых титрования кислых и основных аминокислот имеются дополнительные точки, обусловленные наличием дополнительных ионогенных групп в боковой цепи .

Биполярность аминокислот обеспечивает хорошую растворимость в воде и плохую – в неполярных растворителях (эфир, хлороформ), т.е .

аминокислоты при любых значениях рН ведут себя как сильные электролиты, проявляя амфотерные свойства .

–  –  –

В настоящее время ежегодно в мире производится более 200 тыс. тонн аминокислот, которые используются в сельском хозяйстве, пищевой и фармацевтической промышленности.

Аминокислоты получают, в основном, путем:

- ферментативного синтеза;

- химического синтеза;

- микробиологического синтеза (ферментации) .

Наиболее широко аминокислоты используются в медицине в качестве лекарственных и профилактических препаратов.

Например:

метионин – применяется в качестве протекторного препарата при отравлении бактериальными токсинами и др. Мет, являясь донором метильных групп, участвует в процессах метилирования биополимеров, защищая их от разрушения бактериальными ферментами химической модификации;

глутаминовая кислота – применяется в психиатрии. При декарбоксилировании Глу образуется -аминомасляная кислота (ГАМК), которая тормозит передачу нервных импульсов в ЦНС, влияет на метаболизм глюкозы и процесс тканевого дыхания в мозге;

аспарагиновая кислота – улучшает снабжение кислородом сердечной мышцы;

глицин – обладаем ГАМК-подобным действием и др .

В пищевой промышленности применяются:

глутаминовая кислота – усилитель вкуса;

глицин, лизин, цистеин – антиокислители;

глицин – сахарозаменитель при производстве приправ и безалкогольных напитков и др .

В сельском хозяйстве и промышленности:

лизин – применяется для обогащения кормов (N-содержащая добавка);

метионин, глутаминовая кислота, валин – применяются как препараты, защищающие растения от болезней;

аланин, глицин – применяются как гербициды;

глутаминовая и аспарагиновая кислоты – используются в качестве поверхностно-активных веществ при синтезе

–  –  –

заряженным группам боковых групп аминокислот. Химические свойства аминокислот также обусловлены функциональными группами аминокислотных остатков. Также существует качественная реакция на пептидную группу, позволяющая качественно и количественно определить белки и пептиды – биуретовая реакция, которая будет рассмотрена далее .

Название пептида формируется начиная с N-концевого аминокислотного остатка (со свободной аминогруппой) к С-концевой аминокислоте. Аминокислоты в составе пептидов находятся в форме ацилов (за исключением последней) .

По числу аминокислотных остатков в цепи пептиды делятся на олигопептиды (до 10 аминокислотных остатков) и полипептиды (от 10 до 50 аминокислотных остатков). Полипептиды, насчитывающие более 50 аминокислот в цепи, относят к белкам.

По составу пептида подразделяются на:

простые (гомомерные) – состоят только из аминокислотных остатков;

сложные (гетеромерные) – включены и не аминокислотные компоненты (углеводы, липиды, металлы и др.) .

Образование пептидов в организме может происходить различными способами:

1) путем ферментативного гидролиза (протеолиза) белков (полипептидов);

2) путем ферментативной полимеризации аминокислот (нематричный синтез);

3) путем матричного ферментативного синтеза в многокомпонентной системе (генетически детерминированный процесс) .

Большинство пептидов выполняют регуляторные и транспортные функции. К регуляторным пептидам относятся гормоны и нейромедиаторы (таблица 1.3) .

К нейропептидам, например, относятся опиоидные пептиды – эндорфины, энкефалины, динорфины. Они по рецепторному типу взаимодействуют с различными участками головного мозга и уменьшают болевые ощущения. Эндогенным нейропептидом является метэнкефалин, вырабатывающийся в головном мозге. Энкефалины – короткоцепочечные пептиды, быстро инактивирующиеся под действием ферментов пептидаз. Для усиления их анальгезирующего действия, в настоящее время проводят замещение одной из аминокислот в цепи на Dстереоизомер или химически модифицируют (метилируют) С-концевые аминокислоты, предотвращая тем самым протеолитическое расщепление этих пептидов .

–  –  –

Пептидные антибиотики, синтезируемые микроорганизмами, отличаются тем, что в их состав входят аминокислоты D-ряда и непротеиногенные (некодируемые) L-аминокислоты. Например, антибиотик грамицидин S – это циклический декапептид, содержащий в соем составе 2 остатка D-фенилаланина и 2 остатка L-орнитина .

Необходимо отметить также трипептид глутатион ( глутамилцистеинилглицин), который содержится в организме в достаточно высоких концентрациях (1 - 10 ммоль/л) и выполняет ряд биохимических функций: является компонентом антиоксидантной системы организмов и кофактором окислительно-восстановительных ферментов; осуществляет перенос аминокислот в клетки (в глутамильном цикле) .

–  –  –

В структуре белковой молекулы выделяют 4 уровня его организации: первичная, вторичная, третичная и четвертичная структуры белка .

Под первичной структурой белка понимают последовательность аминокислотных остатков, связанных пептидной связью, в полипептидной цепи. Последовательность аминокислот генетически детерминирована и предопределяет последующую структурную организацию белка .

Вторичная структура белка – это конфигурация полипептидной цепи: упорядоченная структура стабилизированная водородными связями .

Наиболее распространенными конфигурациями являются спираль и -складчатый слой .

-Спираль одна из наиболее выгодных структур с точки зрения термодинамики. Это правозакрученная спираль, характеризующаяся следующими параметрами: 3,6 аминокислотных остатка на 1 виток, шаг спирали (расстояние между витками) – 0,54 нм. Образование -спирали происходит за счет водородных связей между С=О и NH пептидных групп 1 и 4 (2 и 5; 3 и 6 и т.д.) аминокислотных остатков. Боковые цепи аминокислот обращены наружу спирали и не участвуют в формировании и стабилизации вторичной структуры (рис. 1.3.) .

Рисунок 1.3 .

-Спиральная конфигурация полипептидной цепи (по Комов, Шведова, 2004) Если в непосредственной близости в полипептиде расположены одноименно заряженные аминокислоты (Асп и Глу, Лиз и Арг), аминокислоты с крупными алифатическими боковыми группами (например, Сер, Тре, Лей), то образование -спирали затруднено .

Присутствие в полипептидной цепи Про приводит к нарушению спирализации. Такие аминокислоты как Ала, Глу, Глн, Лей, Лиз, Мет, Гис являются -образующими .

-Складчатый слой (или -структура) образована линейными фрагментами полипептидной цепи (или цепей), связанными водородными связями (рис. 1.4) .

Рисунок 1.4 .

-Структура полипептидной цепи (по Комов, Шведова, 2004) На один повторяющийся фрагмент -структуры приходится 2 аминокислотных остатка, а его длина – 0,35 нм В белках обнаружено 2 типа -структур: параллельные (совпадает направление от N-конца к С-концу) и антипараллельные. Параллельные и антипараллельные структуры могут присутствовать в одном складчатом слое. Участок, на котором направление полипептидной цепи при формировании вторичной структуры меняется на 180 о называется изгибом (зигзагом) .

Образованию -складчатых структур способствуют следующие аминокислоты: Вал, Иле, Тре, Тир, Фен .

Неупорядоченные структуры возникают при близком расположении Гли, Сер, Асп, Асн, Про .

В пределах одной полипептидной цепи могут формироваться спиральные и -складчатые структуры, а также присутствовать неупорядоченные участки. Процентное соотношение спиральзованных, структурированных и неупорядоченных участков различно. Например, мышечный белок парамиозин почти на 100% состоит из -спиралей, миоглобин и гемоглобин – на 75%. В фиброине шелка отсутствуют спирализованные участки. У трипсина и рибонуклеазы полипептидная цепь преимущественно имеет конфигурацию -структур, а кератин почти полностью образован -складчатыми структурами (однако, необходимо отметить, что существует -кератин, в котором отсутствуют структуры) .

-Спирализованные и -складчатые участки могут формировать более сложные регулярные структуры. Например, спирализованные участки полипептида могут образовывать левозакрученную двойную спираль. Также могут формироваться структуры с четким чередованием (повторяющимся) вторичных структура:,,, 22, Х (, ) и др. Такую организацию полипептидных цепей рассматривают как супервторичную структуру белка .

Пространственное расположение (или конформация) полипептидной цепи называется третичной структурой белковой молекулы. Формирование третичной структуры происходит за счет возникновения нековалентных взаимодействий (рис.

1.5.) между боковыми функциональными группами (R) боковых цепей аминокислотных остатков:

гидрофобные взаимодействия между неполярными R;

ионные взаимодействия между ионогенными группами (карбоксильные группы Асп, Глу, гуанидиновая группа Арг, аминогруппа Лиз);

водородные связи .

Конформация белковой молекулы поддерживается ковалентными дисульфидными связями между остатками Цис .

–  –  –

Обособленные участки полипептидной цепи, имеющие пространственную структуру, соединенные шарнинрными (неструктурированными) участками называют доменами. Домены бывают структурными и функциональными. У ряда ферментов, например, имеется субстратсвязывающие и коферментсвязывающие домены (рис. 1.6.). Домены являются основными элементами структуры белка .

Конформация белка – пространственная структура. В результате ее образования атомы и функциональные группы аминокислотных остатков, находящиеся на различных участках полипептидной цепи сближаются и взаимодействуют друг с другом. Трехмерные молекулы белка могут иметь различную степень асимметрии. В зависимости от этого белки подразделяются на глобулярные (при соотношении длинной оси к короткой 3:5) и фибриллярные (при соотношении 80:150) .

Рисунок 1.6 .

Домены глицероальдегидфосфатдегидрогеназы (НАД-связывающий домен и каталитический домен) (по Комов, Шведова, 2004) Глобулярные белки сохраняют свою конформацию, в первую очередь, благодаря взаимодействию между гидрофобными аминокислотными остатками полипептидной цепи, которые образуют гидрофобные области. Внутри белковых глобул сформировано гидрофобное ядро, а на поверхности находятся боковые группы полярных аминокислот. В имеющихся на поверхости в очень незначительном количестве гидрофобных участках (формирующих впадины и углубления) чаще всего располягаются функциональные центры белков, например, активные и регуляторные центры ферментов, рецепторов .

Формирование третичной структуры приводит к образованию функционально активной, или нативной, белковой структуры .

Нарушение третичной структуры белка приводит к потере его активности .

Приобретение пространственной структуры (сворачивание) белка – называется фолдинг. Фолдинг – это ферментативный процесс, протекающий сразу же после синтеза полипептида на рибосомах.

В фолдинге принимают участие ферменты:

аминопептидаза – катализирует отщепление N-концевой аминокислоты Мет;

сигнальная пептидаза – катализирует отщепление сигнального пептида на N-конце;

пептидил-пролил-цис/транс-изомераза – катализирует о поворот цепи в точке включения Про на 180 ;

протеиндисульфид-изомераза – катализирует изомеризацию дисульфидных связей .

Помимо ферментов в фолдинге участвуют некаталитические белки, относящиеся к hsp-белкам (белкам теплового шока) – шапероны и шаперонины. Шапероны – это небольшие молекулы, состоящие из 1-2 полипептидных цепей, а шаперонины – крупные олигомерные структуры. Они помогают правильной сборке полипептидных структур;

ингибируют образование неправильных связей при сворачивании цепи;

препятствуют агрегации еще не сформировавшихся белков; переносят сформированные белки в различные компартменты клеток. Однако, шапероны и шаперонины не входят в состав образующихся белков и не участвуют в их функционировании .

Четвертичная структура белка – это ассоциированные между собой 2 и более субъединиц (протомеров) – полипептидных цепей, имеющих третичную структуру. Белки, имеющие четвертичную структуру – это олигомерные белки.

Они делятся на:

гомомерные – состоящие из одинаковых субъединиц (например, лактатдегидрогеназа 1 и 5 – 4 субъединицы, каталаза – 4 субъединицы);

гетеромерные – состоящие из различных субъединиц (например, РНК-полимеразы – 5 различных субъединиц, протеинкиназа – 2 разные субъединицы, лактатдегидрогеназа 2,3 и 4 – 2 разные субъединицы) .

Образование субъединичных белков происходит при помощи водородных связей, гидрофобных и ионных взаимодействий. Например, гемоглобин состоит из 4-х субъединиц двух видов полипептидных цепей: двух - и двух -цепей .

Необходимо отличать крупные гетеромерные белки, состоящие из субъединиц, обладающих различными активностями (например, аденилатциклаза: рецепторная субъединица, сопрягающая субъединица, каталитическая субъединица) и мультиферментные комплексы (например, пируватдегидрогеназный комплекс, комплекс синтетазы жирных кислот), оброазованные несколькими отдельными белками, обладающими различными функциями и способными функционировать отдельно друг от друга .

Физико-химические свойства белков Большинство белков – это водорастворимые вещества .

Растворимость белков определяется их аминокислотным составом, особенностями организации молекулы и свойствами растворителя.

В растворах белки проявляют коллоидные свойства и отличаются:

- высокой вязкостью;

- способностью к образованию гелей;

- неспособностью проходить через полупроницаемые мембраны .

Но белковые растворы не являются коллоидными. Основное сходство белков и коллоидных частиц – это их большие размеры .

Стабильность растворам белков придают заряд белковой молекулы и ее гидратная оболочка .

Белки, как и аминокислоты, являются амфолитами. Значение рН, при котором молекула белка электронейтральна называется изоэлектрической точкой pI. Значение рI зависит от числа и природы ионогенных групп в молекуле. Если рН раствора больше рI, то молекула белка заряжена положительно, если рН меньше рI, то отрицательно. рНсреды влияет на заряд белка, а следовательно, и на его растворимость .

При рН равном изоэлектрической точке растворимость белка наименьшая, т.к. силы электростатического отталкивания минимальны, а силы, способствующие агрегации белка – максимальны. При смещении рН в сторону от изоэлектрического молекула приобретает заряд и ее растворимость увеличивается .

Уменьшение растворимости белков напрямую связана таким свойством нативных белковых молекул как денатурация – изменение (до полной потери) пространственной структуры. Денатурация белков происходит в связи с разрывом связей, поддерживающих и образующих пространственную структуру. Факторы, приводящие к денатурации делятся на два типа: физические (механические воздействия, высокие и низкие температуры, ультразвук, радиация и другие виды высокоэнергетических излучений) и химические (концентрированные неорганические и органические кислоты, концентрированные щелочи, органические растворители и т.д.). Если денатурация затрагивает только третичный уровень организации белка, то этот процесс обратим, происходит восстановление первоначальной нативной структуры .

Процесс, обратный денатурации, называется ренатурация. Если разрушения затрагивают первичную структуру, то речь идет не о денатурации, а о разрушении (в основном, гидролитическом) белка .

Как амфолиты белки способны взаимодействовать и с катионами, и с анионами. Способность белков взаимодействовать с различными заряженными веществами может приводить к их осаждению, т.к .

происходит изменение заряда молекулы. Влияние различных соединений на стабильность белковых растворов будет рассмотрена далее в практической части .

КЛАССИФИКАЦИЯ БЕЛКОВ

В зависимости от состава белки делят на простые и сложные .

Простые белки состоят только из аминокислот .

–  –  –

Простые белки Альбумины и глобулины – глобулярные белки, различающиеся по растворимости в дистиллированной воде и полунасыщенном и насыщенном растворе (NH4)2SO4 (см. практическую часть) .

Глобулины – делятся на 3 фракции:, и. К ним относятся:

транспортные белки: трансферрин (осуществляет транспорт железа из печени), церулоплазмин (транспорт меди в печень). К глобулинам относится протромбин – белок системы свертывания крови .

Альбумины – основные транспорные и питательные белки плазмы крови (до 50 % от общего белка). Молекулярная масса 40-70 кДа .

Сывороточный альбумин человека содержит большое количество кислых аминокислот Асп и Глу, а растительные альбумины – Трп и Мет .

Протамины – основные белки, содержащие от 60 до 85 % аргинина. Например, клупенин из молок сельди из 30 аминокислот, 21 – аргинин. Входят в состав нуклеопротеинов, осуществляют регуляцию генной активности .

Гистоны – ядерные основные белки. Содержат до 30 % лизина и до 15 % аргинина. Делятся на 5 классов, образуют кор-частицу в хроматине .

Проламины, глютелины – кислые растительные белки, образующие основную массу клейковины. 20-25 % приходится на глутаминовую кислоту, 10-15 % - на пролин .

Сложные белки Классификация сложных белков основана на строении простетической группы .

Хромопротеины – сложные окрашенные белки, способные поглощать свет видимой области спектра.

К ним относятся:

гемопротеины. Сложные белки, содержащие гем – комплекс железа с протопорфирином IX, окрашенные в красный цвет. К гемопротеинам относят гемоглобин, миоглобин, каталазу, пероксидазы, гуанилатциклазу, цитохромы и др. Большинство гемопротеинов являются окислительно-восстановительными ферментами;

флавопротеины. Сложные белки желтого цвета, содержащие нуклеотидные производные витамина В2: флавинмононуклеотид (ФМН) и флавинадениндинуклеотид (ФАД). Являются окислительновосстановительными ферментами;

родопсин – зрительный белок, состоящий из белка опсина и производного витамина А – ретиналя .

Фосфопротеины – сложные белки, содержащие остатки фосфорной кислоты, связанные сложноэфирной связью с ОН-группами серина, треонина или тирозина. Обратимое фосфорилирование ферментов – одна из форм регуляции их активности in vivo .

Гликопротеины – сложные белки, содержащие ковалентно связанные углеводные компоненты (моно- или олигосахариды, например D-глюкозу, N-ацетил-D-глюкозамин, D-галактозу, D-глюкуроновую кислоту и др.). Гликопротеинами являются рецепторы гормонов, иммуноглобулины, некоторые гормоны .

Нуклеопротеины – сложные белки, которые содержат белок и нековалентно связанный остаток нуклеиновой кислоты. Существует две группы: ДНП (дезоксирибонуклеопротеины) и РНП (рибонуклеопротеины). .

Липопротеины – сложные гидрофобные белки, в которых полипептидная часть нековалентно связана с фосфолипидами, холестеролом и его эфирами, ацилглицеролами, свободными жирными кислотами. Липопротеины делятся на мембранные и свободно циркулирующие в кровяном русле.

Последние в зависимости от плотности делятся на четыре типа:

липопротеины высокой плотности содержат до 50 % белка, до 30 % фосфолипидов, около 20 % холестерола;

липопротеины низкой плотности содержат до 50 % холестерола;

липопротеины очень низкой плотности;

хиломикроны содержат до 95 % триацилглицеролов .

Металлопротеины – сложные белки, содержащие атомы (ионы) металлов. В состав металлопротеинов входят Fe, Zn, Mn, Mo, Cu, Mg, K, Na, Ca, Se, Co, Ni, V, часто в различных степенях окисления. Например, железо-серные белки, супероксиддисмутаза содержат цинк и медь, карбоксипептидаза – цинк, и многие другие .

Функциональная классификация белков Функции, выполняемые белками крайне разнообразны .

Каталитическая функция. Абсолютное большинство ферментов имеют белковую природу. Ферменты катализируют окислительновосстановительные реакции, реакции переноса функциональных групп, изомеризации, синтеза и расщепления. Большинство ферментов – это сложные белки, содержащие в качестве простетической группы производные водорастворимых витаминов .

Структурная функция. К структурным относятся белки, участвующие в постороении биологических мембран, а также белки, поддерживающие форму клеток, клеточных органелл и сруктур .

Например, коллаген, гистоновые белки, рибосомальные белки и др .

Транспортная функция. Многие белки осуществляют связывание и перенос веществ по кровотоку (альбумин, преальбумин, трансферрин, церулоплазмин). Ионные каналы и некоторые мембранные белки транспортируют вещества через мембраны. Гемоглобин осуществляет газообмен между легкими и тканями .

Защитная функция. К белкам относятся иммуноглобулины (антитела) – ключевые компоненты иммунной системы. Ряд ферментов входит в состав систем детоксикации ксенобиотиков (система цитохрома Р 450) и антиоксидантной системы организма (пероксидаза, каталаза, супероксиддисмутаза и др.). Кроме того, защитную функцию выполняют коллаген и кератин .

Регуляторная функция. Ряд гормонов, которые регулируют и интегрируют обмен веществ имеют белковую или пептидную природу (инсулин, паратгормон, белки, регулирующие активность генома, белки

– ингибиторы ферментов и др.). Белками также являются рецепторы, которые избирательно связывают различные регуляторы (гормоны, медиаторы) на поверхности клеточных мембран. Синтез ферментов может регулироваться при участии белковых факторов транскрипции (белков-репрессоров и индукторов) .

Двигательная функция обусловлена функционированием мышечных сократительных белков (актина, миозина, тропомиозина) .

Белки выполняют также ряд других функций. Например, они являются токсинами микроорганизмов и животных, а также некоторых растений; запасными питательными веществами и др .

МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ БЕЛКОВ

Для определения первичной структуры полипептидной цепи проводят последовательное определение N- и C-концевых аминокислот .

Для определения природы N-концевой аминокислоты предложен ряд методов, в частности метод Сэнджера, основанный на реакции с 2,4динитрофторбензолом (ДНФБ), что приводит к образованию 2,4динитрофенильного производного N-концевой аминокислоты, которая идентифицируется хроматографически Метод Эдмана, основанный на взаимодействии фенилизотиоцианата реагирует со свободной -NH2-группой N-концевой аминокислоты полипептида с образованием фенилтиокарбамоилпептида .

N-концевую аминокислоту также идентифицируют хроматографически .

–  –  –

Метод Эдмана используется в качестве химической основы для определения первичной структуры белков и пептидов. Он реализован в специальном приборе – секвенаторе, работающем в автоматическом режиме и позволяющем определить последовательность аминокислот с N-конца пептида до 50–60 аминокислотных остатков .

Для определения природы С-концевой аминокислоты часто используют ферментативные методы гидролиза С-концевой аминокислоты, которая хроматографически идентифицируется. Также используется химический метод Акабори, который основан на гидразинолизе полипептида. Гидразин, вызывая распад пептидных связей, реагирует со всеми аминокислотами, за исключением С-концевой аминокислоты, поскольку ее карбоксильная группа не участвует в образовании пептидной связи. При этом образуется смесь аминоацилгидразинов и свободной С-концевой аминокислоты. Последнюю отделяют и идентифицируют хроматографически .

Для определения первичной структуры проводят специфический гидролиз полипептида (с использованием химических и ферментативных методов), в результате которого получают набор коротких перекрывающихся олигопептидов, в которых точно определяют последовательность аминокислот. В завершении, на основе полученных данных о перекрывающихся аминокислотных последовательностях, составляются пептидные карты .

Для изучения структуры белков в настоящее время широко используются различные физико-химические методы .

Спектральные методы используются для качественного и количественного анализа белков. Различные виды спектроскопии (абсорбционная, инфракрасная, электронного парамагнитного резонанса, ядерного магнитного резонанса и др.) позволяют получить информацию о тех или иных структурных особенностях белков: наличии хромофоров, относительном расположении и окружении функциональных групп, наличии в структуре неспаренных электронов и структур с сопряженными двойными связями и др .

Электрофоретические методы применяются для разделения белков (пептидов) по величине их заряда, молекулярной массе и соотношению молекулярная масса/заряд.

В настоящее время применяются различные виды электрофоретического разделения белков:

изоэлектрическое фокусирование, двумерный электрофорез, капиллярный электрофорез .

Хроматографические методы.

Для фракционирования белков применяется главным образом хроматография на колонках.По механизмам разделения выделяют следующие виды хроматографии:

адсорбционную (газовую или жидкостную), осадочную, ионообменную, распределительную, гель-фильтрационную (гель-хроматографию) и биоспецифическую (аффинную); по форме проведения – колоночную, хроматографию на бумаге и в тонком слое .

Гель-хроматография (гель-фильтрация) – фракционирование смеси компонентов по размерам молекул путем прохождения их через гели с определенной величиной пор. Наибольшей скоростью продвижения по колонке обладают компоненты раствора, размеры молекул которых больше пор геля. Такие компоненты не проникают в гранулы гелевой фазы и выходят из колонки первыми. Более мелкие молекулы, способные проникать внутрь геля, непрерывно обмениваются между жидкими фазами внутри и вне геля и продвигаются по колонке значительно медленнее. Находящиеся в растворе самые маленькие частицы (например, неорганические соли) выходят из колонки последними .

В основе разделения соединений методом ионообменной хроматографии лежат реакции ионного обмена между анализируемыми соединениями и сорбентами-ионитами, имеющими в своем составе ионизируемые группировки. Сильные иониты, функциональные группы которых образованы сильными кислотами или основаниями, могут быть ионизированы полностью во всем диапазоне рабочих значений pH (3 – 11). Слабые иониты, функциональные группы которых образованы слабыми кислотами или основаниями, могут быть ионизированы не полностью и лишь в ограниченной области значений pH. При работе с белками в качестве сорбентов используют иониты, обладающие высокой степенью гидрофильности .

Белки могут быть разделены как на катионитах, так и на анионитах. Выбор типа ионита определяется изоэлектрическими точками хроматографируемого материала и устойчивостью белка в определенной зоне значение pH. Эффективная сорбция белков происходит при значениях pH, отстоящих не менее чем на единицу от рI .

В области pH рI – 1 белки можно хроматографировать на катионитах, а в области pH рI + 1 — на анионитах. Хроматографию на анионитах ведут в таких системах, где диссоциируемым компонентом является катион (буферы: трис, пиридин, имидазод и др.), а для катионитов диссоциируемым компонентом является анион (ацетатный, фосфатный, бикарбонатный буфер и др.) .

Метод адсорбционной хроматографии основан на адсорбции фракционируемых соединений на сорбенте происходит под действием межмолекулярных сил .

Из большого числа поверхностно-активных веществ, используемых в качестве сорбентов при адсорбционной и ионообменной хроматографии, в белковой химии широкое применение получили гели фосфата кальция (гидроксилапатиты) .

Наиболее популярным современным хроматографическим методом является жидкостная хроматография высокого давления (ЖХВД), или высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ/HPLC) .

Наиболее полную информацию о структуре белков (и других веществ) позволяют получить методы, основанные на сочетании хроматографических методов и масс-спектроскопии, так как сразу после разделения веществ методом ВЭЖХ происходит установление их молекулярной массы и определение их химической структуры .

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ

1. Строение аминокислот, номенклатура, изомерия .

2. Физико-химические свойства аминокислот: амфотерность, растворимость, стереохимия .

3. На основе строения аминокислот аланина, лейцина, валина, серина, тирозина, цистеина, аспарагина, глутаминовой кислоты предположите значение их pI (рI=7,0, рI7,0 или рI7,0) .

4. Тип связи аминокислот в белках и пептидах. Характеристика пептидной связи .

5. Уровни организации белковой молекулы (первичная, вторичная, третичная и четвертичная структура белков) .

6. Какие связи и взаимодействия принимают участие в формировании и стабилизации конформации белковой молекулы?

7. Доменная организация белков. Структурные и функциональные домены .

8. На основании каких параметров белки делятся на глобулярные и фибриллярные? В чем заключаются основные функции глобулярных и фибриллярных белков?

9. Функциональная классификация белков .

10. Какие белки называются простыми? Охарактеризуйте их и приведите примеры .

11. Какие белки являются кислыми? Каковы особенности их аминокислотной последовательности? Приведите примеры .

12. Какие белки называются хромопротеинами? Каковы их структурные особенности? Каковы функции хромопротеинов? Приведите примеры этих белков .

13. Характеристика физико-химических свойств белков .

Амфотерность белков .

14. Методы разделения и очистки белков (диализ, электрофорез, хроматографические методы) .

15. Принципы методов обнаружения аминокислот в растворах (нингидриновая, ксантопротеиновая и др. реакции) .

16. Если с раствором одного белка реакции Миллона и ксантопротеиновая положительные, а с раствором другого – отрицательные, то что можно сказать о различиях аминокислотного состава этих белков?

17. При помощи каких цветных реакций можно установить различия аминокислотного состава альбумина и желатина?

18. На какой реакции основано количественное определение белка биуретовым методом?

19. Какими методами можно освободить раствор белка от низкомолекулярных веществ?

20. Почему при обессоливании белкового раствора методом гельфильтрации белок выходит с колонки в меньшем объеме, чем ионы соли?

Как это обнаружить?

21. Что такое денатурация белка? Какие физические и химические факторы вызывают денатурацию белка?

22. Почему белки при нагревании в изоэлектрической точке быстро выпадают в осадок и не выпадают при нагревании в сильно кислой или сильно щелочной среде?

23. Что такое фолдинг белка? Какие ферменты принимают участие в этом процессе? В чем заключается функция шаперонов и шаперонинов?

ЛАБОРАТОРНЫЕ РАБОТЫ

–  –  –

Биуретовая реакция на пептидную группу (реакция Пиотровского) Принцип метод. Основан на способности пептидной группы в белках и полипептидах (–СО–NH–), а также связи типа (–СН=NH–) образовывать в щелочной среде с ионами Сu2+ комплексное соединение фиолетового цвета с красным или синим оттенком в зависимости от числа пептидных связей в белке .

Биуретовая реакция положительна с белками и пептидами, имеющими не менее двух пептидных связей. С ди- и трипептидами реакция не устойчива .

Биуретовую реакцию дают небелковые вещества, содержащие не менее двух пептидных групп, например, производное мочевины – биурет Н2N–CO–NH–CO–NH2, давшее название этой реакции, и некоторые другие .

В сильнощелочной среде пептидные группы полипептидов переходят в енольную форму, которая и взаимодействует с ионами Cu 2+, образуя окрашенный биуретовый комплекс.

Схема протекания биуретовой реакции:

–  –  –

Реактивы: 4 % раствор белка; 10 % раствор NaOH; 1 % раствор СuSO4 .

Ход работы. В пробирку наливают 1 мл 4 % раствора белка, равный объем раствора NaOH и 1–2 капли раствора CuSO4. Появляется красноили сине-фиолетовое окрашивание .

Нингидриновая реакция на -аминогруппу Нингидриновую реакцию используют в хроматографии для выявления аминокислот. Их количественное определение в автоматических анализаторах проводят путем измерения окраски, возникающей при взаимодействии последовательно выделяющихся с хроматографической колонки аминокислот с нингидрином .

Принцип метода. Реакция обусловлена наличием в аминокислотах аминогруппы в -положении. Белки, полипептиды и -аминокислоты образуют при кипячении с нингидрином соединение синего или синефиолетового цвета. Нингидриновая реакция является одной из наиболее чувствительных для обнаружения -аминогрупп .

Сущность реакции заключается в том, что -аминокислоты и пептиды, взаимодействуя с нингидрином, подвергаются окислительному дезаминированию и декарбоксилированию. В зависимости от среды образуются различные продукты реакции.

Механизм реакции сложен, но схематично его можно представить следующим образом:

O

–  –  –

Реактивы: 1 % раствор глицина; 4 % раствор белка; 0,1 % раствор нингидрина .

Ход работы. В одну пробирку наливают 1–2 мл раствора глицина, в другую – столько же раствора белка. В обе пробирки добавляют раствор нингидрина (в первую – 5–6, во вторую – 10–12 капель), нагревают одну минуту. В пробирке с раствором глицина быстро появляется синефиолетовое или фиолетовое окрашивание. Пробирку с белком нагревать надо до появления красновато-фиолетового окрашивания; Пролин (или 4гидроксипролин) с нингидрином дает желтое окрашивание .

–  –  –

Реактивы: 3 % раствор фенола; концентрированная HNO3; яичный белок; 10 % раствор NaOH .

Ход работы. К 1 мл раствора фенола аккуратно (по стенке пробирки) приливают 2–3 капли концентрированной HNO3 и осторожно нагревают .

Появляется желтое окрашивание. В другую пробирку наливают 1 мл яичного белка, прибавляют 2–3 мл концентрированной HNO3 и аккуратно нагревают. Выпадает осадок, который при нагревании желтеет. После охлаждения в пробирки аккуратно (по стенке) приливают 10 % раствор NaOH до появления оранжевого или желто-оранжевого окрашивания .

Реакцию cледует проводить под тягой!

Реакция Шульце-Распайля на триптофан Принцип метода. Фруктоза в присутствии концентрированной H2SO4 теряет три молекулы воды и превращается в оксиметилфурфурол, который образует с триптофаном окрашенные продукты конденсации .

Реакцию можно проводить как с фруктозой, так и с сахарозой при гидролитическом расщеплении которой образуются равные количества фруктозы и глюкозы .

Реактивы: 4 % раствор белка; 5 % раствор сахарозы;

концентрированная H2SO4 .

Ход работы. К 1–2 мл раствора белка добавляют 6 капель раствора сахарозы и по стенкам пробирки осторожно наслаивают 1 мл концентрированной H2SO4. На границе раздела жидкостей появляется кольцо темно-красного цвета .

Реакция Адамкевича на триптофан Принцип метода. При нагревании триптофан взаимодействует с формальдегидом с образованием бис-2-триптофанилметана, который окисляется до бис-2-триптофанилкарбинола, имеющего краснофиолетовую окраску .

O

–  –  –

бис-2-триптофанилметан Для проведения реакции используют ледяную CH3COOH, в которой как примесь содержится глиоксиловая кислота. В присутствии H2SO4 глиоксиловая кислота превращается в формальдегид .

Реактивы: неразбавленный яичный белок; ледяная CH3COOH;

концентрированная H2SO4 .

Ход работы. В пробирку с двумя каплями свежего неразбавленного яичного белка добавляют 10 капель ледяной CH3COOH и осторожно нагревают до растворения выпавшего осадка, после чего содержимое пробирки охлаждают. Очень аккуратно по стенке, наклонив пробирку, подслаивают (следя чтобы жидкости не смешивались) концентрированную H2SO4. На границе двух слоев возникает характерное окрашенное кольцо .

–  –  –

Реактивы: 4 % раствор белка; 10 % раствор NaOH; спиртовой раствор

-нафтола; 2 % раствор гипобромита натрия .

Ход работы. В пробирке к 1 мл раствора белка прибавляют 2–3 капли раствора NaOH, 1–2 капли спиртового раствора -нафтола и хорошо перемешивают, затем добавляют 3–5 капель раствора гипобромита натрия. Появляется розово-красное окрашивание .

Реакция Фоля на серосодержащие аминокислоты Принцип метода. В молекулах цистеина и цистина сера связана относительно слабо и при щелочном гидролизе легко отщепляется в виде сероводорода, который реагирует со щелочью, образуя сульфид натрия (калия). Сульфид натрия взаимодействует с ацетатом свинца с образованием осадка черного или буро-черного цвета сульфида свинца .

–  –  –

Реактивы: яичный белок;, 2 % раствор желатина; 10 % раствор NaOH; 10 % раствор ацетата свинца .

Ход работы. В одну пробирку наливают 2 мл раствора яичного белка, в другую – столько же раствора желатина. В обе пробирки добавляют 1– 1,5 мл раствора NaOH, осторожно нагревают их до кипения и кипятят 1– 2 мин. После чего в каждую пробирку прибавляют по 2–3 капли раствора ацетата свинца. В пробирке с яичным белком появляется буровато-черное или черное окрашивание, интенсивность которого зависит от концентрации раствора белка и содержания в нем цистеина. Раствор желатина окрашивания не дает. Это свидетельствует о том, что в состав этого белка не входят серосодержащие аминокислоты .

–  –  –

Высаливание белков Белки как высокомолекулярные вещества образуют коллоидные растворы. Растворимость белков в воде определяется наличием гидрофильных групп (несущих заряд или незаряженных) в аминокислотах, входящих в состав белка. Также имеет значение наличие у молекул одноименного суммарного заряда и форма молекул (отношение их длинной и короткой осей). Воздействия, влияющие на гидратацию, заряд или форму белковых молекул, изменяют и их растворимость .

Принцип метода.

Высаливание – обратимая реакция осаждения белков из растворов с помощью концентрированных растворов солей:

NaCl, (NH4)2SO4, MgSO4 .

При высаливании происходит дегидратация макромолекул белка и устранение их заряда. На процесс высаливания влияет гидрофильность, относительная молекулярная масса и заряд белка, поэтому для высаливания различных белков требуется разная концентрация одних и тех же солей. Альбумины осаждаются в насыщенном растворе (NH4)2SO4, а глобулины – в полунасыщенном (NH4)2SO4, так как относительная молекулярная масса глобулинов больше, чем альбуминов .

Высаливание белков является обратимой реакцией, так как осадок белка может вновь растворяться после уменьшения концентрации солей путем диализа или разведения водой .

Реактивы: яичный белок; вода дистиллированная; насыщенный раствор (NH4)2SO4; кристаллический (NH4)2SO4; концентрированная HNO3; кристаллический NaCl .

Ход работы: К 0,5 мл неразбавленного яичного белка прибавляют 2,5 мл воды. При этом образуется небольшое количество белого хлопьевидного осадка глобулинов. В пробирку наливают несколько капель насыщенного раствора (NH4)2SO4, после чего происходит растворение выпавшего глобулина. К 3мл данного раствора яичного белка, содержащего альбумины и глобулины, прибавляют равный объем насыщенного раствора (NH4)2SO4, выпадает осадок глобулинов, который удаляется фильтрованием. К фильтрату добавляют кристаллический (NH4)2SO4 до полного насыщения. При этом выпадает осадок альбуминов. Он также отфильтровывается. С фильтратом следует проделать пробу на полноту осаждения белка с помощью конц. HNO3 .

Обратимость высаливания. К 2 мл раствора белка приливают 2 мл насыщенного раствора (NH4)2SO4, выпадает осадок, который растворяется при последующем прибавлении воды .

Осаждение хлористым натрием и сернокислым магнием. В две пробирки наливают приблизительно по 3 мл белка. Прибавляют до полного насыщения в одну пробирку только измельченный хлористый натрий, в другую - сернокислый магний. Через несколько минут в обеих пробирках появляется осадок глобулинов. Содержимое пробирок отфильтровывают. В фильтратах остаются альбумины, которые в нейтральных растворах не выпадают в осадок даже при полном насыщении NaCl и MgCl2. К фильтрату прибавляют несколько капель разведенной уксусной кислоты; в слабокислой среде выпадают альбумины. Через несколько минут альбумины отфильтровывают .

Проверяют фильтрат на отсутствие белка при помощи биуретовой реакции .

Осаждение белков Денатурация белков (необратимое осаждение) сводится к разрушению структуры белка и потере им биологических свойств. При необратимых реакциях осаждения белки претерпевают глубокие изменения и не могут быть растворены в первоначальном растворителе. К необратимым реакциям относятся осаждение белка солями тяжелых металлов, минеральными и органическими кислотами, алкалоидными реактивами и осаждение при кипячении .

Осаждение белков спиртом, ацетоном Реактивы: 1) белок, 4% р-р; 2) NaCl, порошок; 3) спирт этиловый; 4) ацетон .

Принцип метода: Многие органические растворители осаждают белки из нейтрального или слабокислого раствора. Если к водному раствору белка прибавить, например, этиловый спирт, то можно достигнуть такой концентрации его (неодинакова для различных белков), когда происходит осаждение белка. Механизм действия спирта объясняют связыванием воды, что ведет к дегидратации молекул белка и понижению их устойчивости в растворе. Если при этом присутствует небольшое количество солей (например, NaCl), то осадок образуется полнее и быстрее. Ионы солей связываются коллоидными частицами белка и нейтрализуют их заряд. Это обстоятельство еще более снижает устойчивость раствора белка. Если осаждение проводить на холоду и полученный осадок быстро отделить от спирта, то белок может быть снова растворен в воде, т.е. свойства его в этом случае не изменяются, денатурация не успевает произойти и осаждение обратимо. При стоянии со спиртом белок денатурирует и становится нерастворимым в первоначальном растворителе .

Ход работы: а) Приливают в пробирку 1-2 мл раствора белка, прибавляют щепотку сухого NaCl и взбалтывают. В пробирку постепенно приливают несколько мл этилового спирта и сильно взбалтывают. Через несколько минут выпадает мелкий осадок белка .

б) В пробирку наливают 1 мл раствора белка, по стенке осторожно добавляют 0,5 мл ацетона, на границе соприкосновения обеих жидкостей появляется белое кольцо денатурированного белка .

Осаждение белков солями тяжелых металлов Реактивы: 1) белок, 4% р-р; 2) ацетат свинца, 5% р-р; 3) сульфат меди, 1% р-р; 4) нитрат серебра. 5% р-р .

Принцип метода: Белки легко осаждаются солями металлов (свинца, меди, серебра, ртути и др.), образуя с ними прочные солеобразные и комплексные соединения. В отличие от высаливания солями щелочных и щелочноземельных металлов для осаждения солями тяжелых металлов требуются небольшие концентрации последних. В случае применения уксуснокислого свинца и CuSO4 избыток солей вызывает растворение образованного ими осадка. Такое растворение вызывается адсорбцией избытка ионов металла и перезарядкой белкового комплекса, вследствие чего в раствор переходит комплекс измененного белка с металлом .

Благодаря тому же механизму добавление достаточного количества хлористого натрия вызывает растворение ртутного соединения белка .

Белковые осадки, полученные действием солей тяжелых металлов, однако, нерастворимы в первоначальном растворителе, т.е. в воде или слабых растворах солей .

Таким образом, осаждение белков солями тяжелых металлов следует отнести к необратимым реакциям осаждения, связанным с денатурацией белка. Осадки от солей тяжелых металлов, как правило, нерастворимы даже после удаления солей диализом или растворения водой. Свойством белков связывать тяжелые металлы пользуются в медицинской практике, употребляя белки (молоко, яйца) как противоядие при отравлении солями ртути (сулема), свинца (от недоброкачественной посуды) или меди (от окисления медной посуды), пока эти соли не успели всосаться. Реакции осаждения белков солями тяжелых металлов идут обычно полно (особенно в присутствии щелочных металлов), и ими пользуются не только для выделения белков из раствора, но и для освобождения жидкостей от белков .

Ход работы: В 3 пробирки наливают по 1-2 мл раствора белка .

Прибавляют по каплям в первую пробирку раствор уксуснокислого свинца, во вторую - раствор сернокислой меди, в третью - раствор азотнокислого серебра. Наблюдают образование осадков во всех пробирках. В пробирки с осадками от уксуснокислого свинца и сернокислой меди добавляют избыток этих солей. Наблюдается растворение осадков .

Осаждение белков минеральными кислотами Реактивы: 1) HCl, конц.; 2) H2SO4, конц.; 3) HNO3, конц.; 4. белок, раствор для осаждения .

Принцип метода: Концентрированные минеральные кислоты вызывают необратимое осаждение белков из растворов. Это осаждение объясняется как явлением дегидратации белковых частиц, так и рядом других причин (например, образование комплексных солей белка с кислотами и др.). Избыток минеральной кислоты, за исключением азотной, растворяет выпавший осадок белка .

Ход работы: В три пробирки осторожно наливают приблизительно по 1 мл кислот: в 1-ю соляной, во 2-ю - серной, в 3-ю - азотной. Осторожно вносят во все пробирки приблизительно по 1 мл раствора белка. На границе двух жидкостей наблюдается появление осадка белка в виде небольшого белого кольца. Осторожно встряхивают каждую пробирку .

Происходит растворение осадков в избытке соляной и серной кислот. В пробирке с азотной кислотой осадок при встряхивании не исчезает, т.к. в избытке азотной кислоты он не растворяется .

Осаждение белков алкалоидными реактивами Реактивы: 1) белок, раствор для осаждения; 2) уксусная кислота, 1% р-р; 3) таннин, насыщ. р-р; 4) железосинеродистый калий, 5% р-р .

Принцип метода: Растворы белков могут образовывать осадки при добавлении так называемых алкалоидных реактивов .

К последним относятся таннин, пикриновая кислота, некоторые другие вещества. Эта способность белков к осаждению алкалоидными реактивами объясняется наличием сходных азотистых группировок, как в белках, так и в алкалоидах. Механизм осаждения алкалоидными реактивами заключается в образовании нерастворимых солеобразных соединений с азотистыми основными группами. В этом соединении белок является катионом, алкалоидный реактив - анионом. Вследствие этого осаждение белков алкалоидными реактивами необходимо проводить в кислой среде (частицы белка перезаряжаются и переходят в состояние катионов). В щелочной среде осадки растворяются. Протамины и гистоны осаждаются в нейтральной среде .

Ход работы: В 3 пробирки наливают по 1-2 мл раствора белка и подкисляют их 2-3 каплями 1% р-ра CH3COOH. В одну пробирку приливают 2-3 капли раствора таннина, в другую добавляют 2-3 капли раствора железосинеродистого калия. Взбалтывают после добавления каждой капли. Белок выпадает в осадок .

Осаждение белков органическими кислотами Реактивы: 1) белок, раствор для осаждения; 2) ТХУ, 10% р-р; 3) сульфосалициловая кислота, 20% .

Принцип метода: Белки из растворов могут осаждаться органическими кислотами. Однако разные органические кислоты неодинаково действуют на белок. Трихллоруксусная кислота (ТХУ), сульфосалициловая кислота являются очень чувствительными и специфическими реактивами на белок, широко применяются с этой целью. Осаждение белков с помощью ТХУ в конечной концентрации 2,5часто применяется для полного удаления белка из биологических жидкостей (например, из сыворотки крови), т.к. ТХУ осаждает только белки, а продукты их распада остаются при этом в растворе. Это особенно важно, когда нужно определить отдельно содержание азота белка и азота более низкомолекулярных продуктов: аминокислот, мочевины и др. - так называемый "небелковый азот". В этом случае, если после осаждения белков требуется из фильтрата удалить ТХУ, то это достигается его кипячением, в результате чего ТХУ разлагается на хлороформ и угольный ангидрид, которые улетучиваются .

Ход работы: В пробирку наливают 1-2 мл раствора белка и добавляют несколько капель раствора ТХУ. Наблюдают выпадение белка в осадок. В другую пробирку наливают 1-2 мл раствора белка и добавляют несколько капель раствора сульфосалициловой кислоты. Наблюдают выпадение осадка белка .

Осаждение белков при нагревании Реактивы: 1) белок, раствор для осаждения; 2) уксусная кислота, 1% р-р; 3) уксусная кислота, 10% р-р; 4) хлорид натрия, насыщ. р-р; 5) NaOH, 10% р-р .

Принцип метода: Почти все белки свертываются при нагревании .

Температура свертывания различна для разных белков, и если одни белки коагулируют уже при 50-550С, то некоторые из них выдерживают даже продолжительное кипячение. При свертывании белки денатурируют и переходят в нерастворимое состояние .

Механизм тепловой денатурации связан с перестройкой структуры белковой молекулы, в результате чего белок теряет свои нативные свойства и растворимость. Реакция денатурации протекает постепенно и ускоряется с повышением температуры, поэтому слишком кратковременное нагревание может и не привести к свертыванию .

Присутствие солей и концентрация водородных ионов играют важную роль в свертывании белков при нагревании. Наиболее полная и быстрая коагуляция имеет место в изоэлектрической точке, т.е. при таком рН, когда коллоидные частицы белка теряют свой электрический заряд и становятся наименее устойчивыми в растворе. Для большинства белков изоэлектрическая точка соответствует слабокислой реакции (рН около 5) .

В сильнокислых растворах молекулы перезаряжаются и несут положительный заряд, что повышает их устойчивость. Подобно этому в щелочных растворах стабильность белкового коллоида обусловлена отрицательным зарядом частицы. Поэтому в сильнокислых растворах белки при нагревании могут коагулировать лишь при добавлении достаточного количества какой-либо нейтральной соли .

Ход работы: Наливают в 5 пробирок приблизительно по 2 мл раствора белка. Нагревают содержимое первой пробирки. Образуется осадок белка. Добавляют во вторую пробирку каплю 1% СН3СООН и нагревают. Осадок выпадает скорее и полнее вследствие того, что белок находится в изоэлектрической точке. Добавляют в третью пробирку около 0,5 мл 10% СН3СООН и нагревают, осадка белка не образуется даже при кипячении. Добавляют в четвертую пробирку около 0,5 мл 10% СН3СООН, несколько капель насыщенного раствора хлористого натрия и нагревают. Образуется осадок белка. Добавляют в пятую пробирку около 0,5 мл раствора NaOH и нагревают. Осадок не образуется даже при кипячении .

Определение изоэлектрической точки Реактивы: 1) желатин, 1% р-р; 2) 0,2 М раствор Na2HPO4; 3) 0,1 М раствор лимонной кислоты; 4) этанол .

Принцип метода: Белки следует рассматривать как вещества, содержащие большое количество кислотных и основных групп .

Кислотные группы белка происходят главным образом за счет карбоксильных групп дикарбоновых кислот. Кислую реакцию дают также фенольные, гидроксильные и сульфгидрильные группы .

Щелочные, или оснвные, группы белка – это аминнные, гуанидиновые и имидные группы аминокислот. На кислотно-щелочные свойства белка влияет также характер соединения остатков концевых аминокислот в белковой молекуле. Обладая одновременно кислотными и основными свойствами, белки образуют биполярные ионы .

В щелочных растворах белок играет роль аниона. При потере протона из группы -+NH3, например, при действии NaOH, образуется натриевая соль белка (протеинат натрия) .

В кислых растворах, наоборот, белок играет роль катиона, например, с соляной кислотой получается хлористоводородная соль (протеинхлорид) .

Таким образом, фактором, определяющим поведение белка как аниона или катиона, является концентрация водородных ионов. Ее повышение (кислая среда) уменьшает кислотную диссоциацию белка и переводит его в катион, понижение концентрации водородных ионов, наоборот, подавляет щелочную диссоциацию и переводит белковые частицы в анионы. Однако при определенном значении рН (неодинаковым для различных белков) кислотная диссоциация белковой части становится равной щелочной - число положительных зарядов амфотерного иона белка сравнивается с числом отрицательных зарядов и заряд в целом может стать близким или практически равным нулю. В этих условиях белок находится в изоэлектрическом состоянии и в электрическом поле не будет обнаруживать передвижение ни к катоду, ни к аноду. рН раствора, при которой белок находится в изоэлектрическом состоянии, называется изоэлектрической точкой белка. В этой точке белок находится почти целиком в виде амфотерных ионов, несущих равные положительный и отрицательный заряды, тогда как при других концентрациях водородных ионов у белка имеется преимущественно положительный или отрицательный заряд. Растворы белков в изоэлектрической точке наименее устойчивы. В этом случае отталкивание одноименно заряженных частиц, повышающее устойчивость раствора, прекращается и в качестве стабилизирующего фактора действует лишь гидратная (водная) оболочка белка. Для большинства белков изоэлектрическая точка близка к нейтральной среде, но немного сдвинута в кислую сторону. Это объясняется тем, что кислотные свойства у них преобладают над щелочными и в нейтральной среде они реагируют как слабые кислоты. Молекула таких белков содержит больше свободных карбоксильных групп, чем амидных, а при гидролизе дает преобладание дикарбоновых и других кислореагирующих групп над теми, у которых преобладают основные свойства. Некоторые белки, наоборот, относительно богаче аминными группами и в своем составе содержат больше остатков диаминокислот. В нейтральном растворе они ведут себя как слабые основания. Такие белки (например, гистоны и протамины) имеют изоэлектрическую точку при слабощелочной среде реакции .

Определение изоэлектрической точки удобно произвести на примере желатина .

Ход работы: В 6 пробирок наливают 0,2 М р-р двузамещенного фосфорнокислого натрия и 0,1 М р-р лимонной кислоты в количествах, указанных в таблице. В каждую пробирку к 1 мл заготовленной буферной смеси приливают по 0,5 мл 1 % р-ра желатина, перемешивают и добавляют по 2 мл этилового спирта. Содержимое пробирок вновь перемешивают и оставляют на 5 мин. Через 5 минут отмечают, в какой пробирке и при таком рН произошло наибольшее помутнение раствора .

Отсутствие мути отмечают знаком минус (-), наличие и степень мутности

- одним или двумя знаками плюс (+). Результаты фиксируют в виде таблицы .

–  –  –

Диализом называется процесс разделения высокомолекулярных и низкомолекулярных веществ с помощью полупроницаемых мембран (коллодий, целлофан, пергамент и др.). Обладая большим диаметром, белковые молекулы не способны проникать через такие мембраны, в то время как частицы низкомолекулярных веществ легко проходят через них .

Реактивы: 1) альбумин, 3 % р-р; 2) (NH4)2SO4, насыщенный р-р; 3) BaCl2, 5 % р-р; CuSO4; 4) биуретовый реактив; 5) реактив Несслера; 6) 1% NH4OH .

Ход работы:

1. В пробирку наливают 2 мл р-ра альбумина и прибавляют к раствору 1 каплю насыщенного р-ра сульфата аммония. Из листа целлофана, намоченного водой, делают мешочек (диализатор) и выливают в него содержимое пробирки. Края мешочка зажимают между двумя стеклянными палочками, прижатыми друг к другу резиновыми колечками, надетыми на концы палочек. Мешочек помещают в стакан с дистиллированной водой, укладывают палочки на края стакана. Уровень жидкости в мешочке должен быть ниже жидкости в стакане .

2. Через 1 час от начала диализа берут в 2 пробирки по 1 мл жидкости из стакана и проводят следующие определения:

а) на присутствие SO42-: добавляют в первую пробирку 3-4 капли 5 % р-ра BaCl2 и наблюдают образование осадка BaSO4 в виде белой мути .

б) на присутствие белка: проделывают биуретовую реакцию .

в) на присутствие аммиачного азота: добавить несколько капель реактива Несслера. При наличии аммиачного азота проявится желтое окрашивание. Для контроля проделать такую же реакцию с раствором NH4OH. Реактив Несслера состоит из двойной соли йодистой ртути и йодистого калия (HgI2, KI), растворенной в растворе КОН. Аммиак с реактивом Несслера дает соединение – йодистый меркураммоний, которое при малых количествах аммиака в растворе окрашивает его в желтый цвет, при значительных – в красно-желтый .

–  –  –

3. Жидкость из мешочка (диализат) сливают в пробирку, отмеряют 10 капель диализата и с ним тоже проделывают биуретовую реакцию .

Обессоливание белкового раствора методом гель-фильтрации Низкомолекулярные вещества из белкового раствора можно достаточно быстро и полно уловить с помощью гель-фильтрации .

Хроматографическую колонку наполняют гелем, набухшим в воде или буферном растворе. Разделение веществ этим методом основано на различии в размерах молекул. Крупные молекулы не проникают в поры гранул геля и выходят из колонки в первую очередь, в то время как небольшие молекулы попадают через поры гранулы, вследствие чего задерживаются на колонке и движутся с меньшей скоростью. Метод гельфильтрации часто называют разделением веществ по принцип молекулярного сита .

Свойствами молекулярного сита обладают многие пористые материалы. Наиболее часто для этих целей применяют органические полимеры с трехмерной структурой. Например, гели полисахарида декстрана (коммерческое название сефадексы). Существует несколько типов сефадексов, различающихся как размерами, так и количеством пор и величиной гранул. Это позволяет применять их для разделения веществ с разными размерами молекул. Благодаря высокому содержанию гидроксильных групп гранулы сефадекса легко набухают, образуя гель .

Чем выше способность геля к набуханию, тем больше номер сефадекса .

Для освобождения белковых растворов от солей обычно используют сефадекс марки G-25 .

Реактивы: 1) р-р белка; 2) K2CrO4, 5% р-р; 3) биуретовый реактив .

Ход работы:

Нанесение раствора белка. Перед нанесением раствора белка на гель, открывают кран на колонке и наблюдают за уменьшением столбика воды над слоем сефадекса. Как только над поверхностью геля остается слой жидкости толщиной 1-2 мм, кран закрывают и пипеткой аккуратно наносят на гель 1 мл белкового раствора, в который предварительно добавляют раствор K2CrO4. Кран открывают и следят за проникновением раствора в гель. Снова закрывают кран, стенки колонки ополаскивают 1 мл дистиллированной воды, открывают кран и позволяют жидкости впитаться в гель. Затем кран закрывают, и, стараясь не взмучивать гель, аккуратно добавляют пипеткой по стенке 4-6 мл дистиллированной воды .

Сбор фракций. В 12 пробирок отмеряют по 1 мл биуретового реактива. К колонке приливают воду и открывают кран. Собирают по 10 капель в пробирки, содержащие биуретовый реактив. Наблюдают изменение окраски в порциях элюата, содержащего белок .

Выход хромата калия отмечают по появлению желтого окрашивания раствора в очередной пробирке .

Гель в колонке отмывают водой до полного удаления хромата калия .

После этого колонка вновь готова к употреблению .

Оформление работы: описывают принцип метода, результаты опыта заносят в таблицу:

–  –  –

Отсутствие окраски обозначают знаком "–", появление окраски – знаком "+", несколько знаков "+" указывают на значительную интенсивность окраски. Выводы, полученные из результатов опыта, также заносят в протокол .

Распределительная хроматография аминокислот на бумаге Этот метод широко используется для разделения смеси аминокислот, для качественного обнаружения отдельных аминокислот. Достоинством этого метода является то, что он позволяет исследовать ничтожное количество вещества .

Разделение аминокислот основано на их различной растворимости в нескольких несмешивающихся жидкостях (фазах). Одной из жидкостей служит вода, которая прочно ассоциируется с молекулами целлюлозы и образует неподвижную фазу. Менее полярные водонасыщенные органические растворители (изобутиловый, изопропиловый, бутиловый спирт, фенол и др.) составляют подвижную фазу. Подвижный органический растворитель поднимается по полоске бумаги, растворяет нанесенные на бумагу аминокислоты и увлекает их за собой. Скорость перемещения аминокислот на бумаге зависит от степени их растворимости в подвижных и неподвижных фазах. Чем больше растворимость аминокислот в водной фазе и чем меньше ее растворимость в неводной фазе, тем медленнее движется аминокислота по сравнению с фронтом органического растворителя. Иными словами, аминокислоты с объемными неполярными боковыми цепями (Гли, Лей, Иле, Фен, Трп, Вал, Мет, Тир), перемещаются быстрее, чем аминокислоты с более короткими боковыми цепями (Про, Ала, Гли) или с полярными боковыми цепями (Тре, Глу, Сер, Арг, Асп, Гис, Лиз, Цис) .

Положение отдельных аминокислот на хроматографической бумаге обнаруживают при помощи цветной реакции с нингидрином .

Идентификация отдельных аминокислот на хроматограмме проводят путем нанесения на ту же хроматограмму "свидетелей" - растворов отдельных аминокислот. Можно также идентифицировать аминокислоты по величине Rf, равной отношению пути, пройденного аминокислотой (от места нанесения) (а) к расстоянию, пройденному растворителем (от места смеси аминокислот до фронта растворителя) (в) Rf = Коэффициент Rf - величина, характерная для каждой аминокислоты и постоянная при данных условиях опыта (растворитель, температура, сорт бумаги) .

Возможны разные варианты хроматографии на бумаге: нисходящая, восходящая, радиальная .

Реактивы: 1) смесь растворителей н-бутанол : уксусная кислота : вода (12:3:5); 2) раствор нингидрина в ацетоне, 0,2%; 3) смесь аминокислот; 4) растворы аминокислот-«свидетелей» .

Ход работы:

1. Квадрат хроматографической бумаги размером 11 11 см делят диагоналями на 4 части. В центре пересечения диагоналей описывается окружность радиусом 10 мм, стороны квадрата нумеруют. На середину каждой их четырех дуг, ограниченных диагоналями, наносят микропипеткой пятнышко (2-3 мм в диаметре) из аминокислот "свидетелей" и анализируемую смесь аминокислот .

2. В центре квадрата иглой проделывают отверстие и в него вставляют фитиль, скатанный из небольшого треугольника фильтровальной бумаги в виде трубочки .

3. На дно чашки петри наливают 10-15 мл смеси растворителей (бутанол, уксусная кислота, вода) так, чтобы было покрыто дно чашки .

Квадрат помещают на чашку Петри так, чтобы он лежал на ее краях .

Фитилек должен касаться дна чашки Петри. Чашку Петри накрывают крышкой и оставляют при комнатной температуре. По фитильку растворитель поднимается вверх, распределяется по бумаге от центра к периферии листа. Когда фронт растворителя дойдет до краев чашки Петри (через 1 час), хроматограмму снимают, отмечают карандашом фронт растворителя, помещают ее на крышку чашки Петри и ставят в сушильный шкаф при температуре 100 - 1300С на 5 минут (до исчезновения запаха растворителя). Высушенную хроматограмму проявляют 0,2 % раствором нингидрина в ацетоне и вновь помещают в сушильный шкаф. Через несколько минут на хроматограмме появляются пятна, указывающие положение аминокислот .

4. Для каждой аминокислоты рассчитывают коэффициент распределения Rf. Аминокислоты анализируемой смеси идентифицируют, сравнивая их с Rf аминокислоты - свидетеля .

Оформление работы: Принцип метода бумажной хроматографии коротко записывают в протоколе. Полученную хроматограмму вклеивают в тетрадь, после расчета аминокислот смеси и свидетелей на хроматограмму наносят названия аминокислот смеси .

Лабораторная работа 4 .

ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ БЕЛКА

БИУРЕТОВЫМ МЕТОДОМ

Реактивы: 1) белок, 0,25% р-р; 2) биуретовый реактив; 3. белок, раствор неизвестной концентрации .

Принцип метода: При взаимодействии белков в щелочной среде с сернокислой медью развивается фиолетовое окрашивание вследствие образования комплексной медно-нартиевой соли белка .

Построение калибровочного графика

Ход работы: Для построения калибровочного графика в качестве стандартного раствора белка используют 0,25 % раствор альбумина .

Пробы после составления тщательно перемешивают и оставляют на 30 минут при комнатной температуре. Их фотометрируют на ФЭКе в кюветах шириной 1 см против контрольной пробы. Светофильтр зеленый ( =495-565 нм). Строят калибровочный график, откладывая на оси абсцисс содержание белка в пробе (мг), на оси ординат - экстинкцию соответствующей пробы .

–  –  –

Ход работы: Для определения берут 2 параллельные пробы белка с неизвестной концентрацией (по 3 мл) и контрольную пробу (3 мл воды) .

Добавляют в каждую по 2 мл биуретового реактива и дальше поступают как при построении калибровочной кривой. Расчет белка ведут по калибровочной кривой .

ТЕСТЫ, УПРАЖНЕНИЯ, ЗАДАЧИ

–  –  –

4. Между какими приведенными ниже парами аминокислот возможно:

1. Образование водородных связей;

2. Гидрофобное взаимодействие;

3. Ионное взаимодействие;

А. Гис и Глу; Б. Вал и Тир; В. Мет и Гис; Г. Асн иСер;

Д. Вал и Иле; Е. Фен и Лей; Ж. Ала и Тре; З. Лиз и Глу .

–  –  –

6. Содержание отрицательно заряженных групп в молекуле аминокислоты в изоэлектрической точке:

А. больше содержания положительно заряженных групп ;

Б. меньше содержания положительно заряженных групп;

В. равно содержанию отрицательно заряженных групп .

7. Значение рН в изоэлектрической точке (выберите ответы для 1 и 2)

1. Лизина; 2. Глутаминовой кислоты:

А. больше значения рН в изоэлектрической точке глицина;

Б. меньше значения рН в изоэлектрической точке глицина;

В. равно значению рН в изоэлектрической точке глицина .

8. В процессе гидролиза белка:

А. уменьшается количество свободных карбоксильных групп;

Б. увеличивается количество свободных аминогрупп;

В. резко падает рН раствора;

Г. образуются пептидные связи;

Д. выделяется газообразный азот .

9. Ковалентные связи:

А. осуществляют связь между полипептидной и небелковой частями сложных белков;

Б. образуются при соединении аминокислот в полипептидную цепь;

В. поддерживают -складчатую структуру полипептидной цепи;

Г. поддерживают -спиральную конфигурацию полипептидной цепи .

10. Денатурация белка сопровождается:

А. нарушением нативной структуры белка;

Б. разрывом ковалентных связей;

В. уменьшением количества внутримолекулярных водородных связей;

Г. уменьшением молекулярной массы;

Д. потерей биологической активности;

Е. нарушением первичной структуры белка .

–  –  –

12. Установите все возможные соответствия между факторами денатурации и повреждаемыми связями и взаимодействиями:

1. Ионы тяжелых металлов; А. водородные связи;

2. Неорганические кислоты Б. гидрофобные (концентрированные); взаимодействия;

–  –  –

цистеина .

Какие качественные реакции на функциональные группы аминокислот и белков и в какой последовательности необходимо провести, чтобы определить в каких пробирках находятся растворы перечисленных веществ?

18. Имеются два раствора: белка А с концентрацией 1 моль/л и белка В с концентрацией 2 моль/л. После проведения биуретовой реакции (в одинаковых условиях) интенсивность окраски одинаковая. Что можно сказать о длине полипептидной цепи А и В?

19. Имеются два раствора белка А: (I) и (II) .

После проведения биуретовой реакции (в одинаковых условиях) интенсивность окраски раствора (I) в 2 раза больше, чем интенсивность окраски раствора (II). Что можно сказать концентрации этих растворов?

20. Из каких аминокислот и в результате какой реакции (напишите уравнение) образуются диамины:

Путресцин NH2–(CH2)3–CH2–NH2;

Кадаверин NH2–(CH2)4–CH2–NH2 .

21. При наследственной заболевании фенилкетонурия происходит накопление продуктов окислительного и неокислительного дезаминирования фенилаланина. Напишите уравнения реакций и назовите образующиеся продукты .

22. Какая функциональная группа обеспечивает трипептиду глутатиону возможность участия в окислительно-восстановительных процесах?

Напишите уравнение реакции окисления глутатиона .

23. Глобулины крови и имеют различные значения pI:

- 4,8; - 5,2; Какой из глобулинов будет наиболее эффективно связывать ионы меди (II)? Почему?

24. Протеолитический фермент трипсин катализирует гидролиз пептидных связей, карбонильная группа которых принадлежит остаткам положительно заряженных диаминомонокарбоновых кислот .

Три пептида обработали трипсином:

–  –  –

Определите, какие аминокислоты соответствуют пятнам под номерами 1 – 4? Проведите необходимые измерения и рассчитайте коэффициент Rf для каждой аминокислоты. Расположите аминокислоты в порядке увеличения растворимости в воде .

26. Третичная структура белка формируется за счет образования различных типов связей и взаимодействий между боковыми цепями аминокислотных остатков. Определите на данном рисунке, какие типы связей были образованы?

27. После проведения гель-фильтрации белкового экстракта была получена фракция с определенной молекулярной массой (гомогенный препарат). Эта фракция была подвергнута электрофоретическому анализу, позволяющему разделять белки по соотношению масса/заряд. На рисунке представлена электрофореграмма, на которой были выявлены три фракции, отличающиеся электрофоретической подвижностью .

«-» катод

–  –  –

Что можно сказать о качественном составе белковой фракции, полученной после гель-фильтрации? Какие аминокислоты преобладают во фракциях а,б и в ?

ГЛАВА 2. ФЕРМЕНТЫ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ФЕРМЕНТОВ

Энзимология (от греч. en zyme – в дрожжах) – наука о ферментах (от лат. fermentatio – брожение), их структуре, механизмах действия и путях регуляции их активности .

Ферменты представляют собой природные биокатализаторы. В настоящее время в биологических системах обнаружено несколько тысяч индивидуальных ферментов, 3709 из них – выделено, изучено и внесено в специальную базу данных. Подсчитано, что живая клетка может одновременно содержать до 1000 различных ферментов, каждый из которых ускоряет ту или иную химическую реакцию. В химическом плане большинство ферментов имеют белковую природу, однако из этого правила есть исключение – рибозимы .

Рибозимы – низкомолекулярные молекулы РНК, способные осуществлять низкотемпературный катализ. Считается, указано ранее, что именно рибозимы катализируют реакции, сопровождающие созревание тРНК и рРНК; не исключается их участие в процессинге и сплайсинге мРНК .

Механизм каталитического действия рибозимов окончательно не изучен, но зафиксирована возможность образования рибозимсубстратного комплекса и полное подчинение процесса законам ферментативной кинетики .

Предполагается, что именно рибозимы занимали центральное место в химическом катализе процессов, связанных со становлением жизни на Земле, и лишь потом к ним присоединились ферменты белковой природы .

Ферменты как биокатализаторы имеют черты сходства и различия с неорганическими химическими катализаторами .

К свойствам, объединяющим ферменты с другими катализаторами, относят:

1. способность катализировать только термодинамически возможные процессы .

2. ускорение наступления состояния равновесия обратимого процесса, при отсутствии возможности смещения равновесия в сторону прямой или обратной реакции .

3. способность образовывать с реагирующими веществами (субстратами реакции) высокореакционные промежуточные соединения .

4. высвобождение в неизменном виде после завершения катализируемого процесса .

К свойствам, характеризующим ферменты как особый тип катализаторов, относят:

1. высокую активность ферментов по сравнению с неорганическими катализаторами. Известно, например, что ионы железа ускоряют разложения пероксида водорода на воду и молекулярный кислород .

Атомы того же железа, но в составе фермента каталазы действуют в 10 млрд. раз эффективнее, и всего 1 мг железа в ферменте способен заменить в данной реакции 10 тонн неорганического железа .

2. способность ферментов функционировать в очень мягких условиях: относительно низкая температура, физиологические значения рН и давления. Так, гидролитический распад белка до аминокислот в присутствии неорганических катализаторов (концентрированных кислот и щелочей) осуществляется при температуре 100 С за несколько часов .

Этот же процесс при каталитическом действии протеаз протекает за несколько минут при температуре 30-40 С .

3. высокую специфичность действия ферментов .

4. высокую способность реагировать на различные регуляторные воздействия .

5. свойства, обусловленные белковой природой большинства ферментов (термолабильность, зависимость активности от величины рН среды и др.) .

Внутри клетки ферменты, как правило, содержатся и функционируют в строго определенных органеллах. Внутриклеточная локализация фермента непосредственно связана с той функцией, которую выполняет данный компартмент клетки .

Так, ферменты гликолиза находятся в цитозоле, ферменты цикла Кребса и -окисления жирных кислот – в матриксе митохондрий, ферменты окислительного фосфорилирования – во внутренней мембране митохондрий и т.д .

Многие ферменты благодаря их строго определенному расположению в клетке используются как маркеры тех или иных внутриклеточных структур. Так, маркерами плазматических мембран являются Na+,K+-АТФаза и аденилатциклаза; маркером цитозоля – лактатдегидрогеназа; аппарата Гольджи – галактозилтрансфераза;

лизосом – кислая фосфатаза; пероксисом – каталаза и оксидаза Dаминокислот; эндоплазматического ретикулума – глюкозо-6-фосфатаза и НАДФН-цитохром с – редуктаза; митохондрий – глутаматдегидрогеназа .

СТРУКТУРА ФЕРМЕНТОВ

По строению ферменты бывают однокомпонентными – простыми, и двухкомпонентными – сложными, имеющими в составе дополнительный компонент небелковой природы .

Белковая часть двухкомпонентных ферментов (холоферментов) называется апоферментом, небелковая – кофактором. Соединение белковой и небелковой части сложного фермента осуществляется за счет ионных и водородных связей и гидрофобных взаимодействий .

Функциями кофакторов являются:

1. участие в акте катализа,

2. осуществление контакта между ферментом и субстратом,

3. стабилизация апофермента, особенно в присутствии денатурирующих агентов .

Апофермент, в свою очередь, усиливает каталитическую активность небелковой части и определяет специфичность действия ферментов .

Характерной особенностью сложных ферментов является то, что ни апофермент, ни кофактор по отдельности не обладают каталитической активностью, только их комплекс проявляет ферментативные свойства .

Область фермента, в которой происходит связывание и превращение субстрата, называется активным центром. Активный центр образуется определенными боковыми функциональными группами аминокислот полипептидной цепи (чаще всего это SH-группа цистеина, ОН-группа серина, -аминогруппа лизина, имидазольное кольцо гистидинасвободные концевые карбоксильные группы), в двухкомпонентных ферментах в него входят определенные участки небелкового компонента. В активном центре фермента условно выделяют несколько зон. Участок активного центра, контактирующий с подвергающимися превращению фрагментами молекул субстрата, то есть принимающий непосредственное участие в синтезе или расщеплении химических связей субстрата, называют каталитическим центром. Участок активного центра, контактирующий с неподвергающимися превращению фрагментами субстрата и укрепляющий его в активном центре, называется зоной связывания (контактным участком) .

Активные центры ферментов расположены в углублениях на поверхности фермента. Микросреда активного центра отличается от остального окружения фермента более низкой диэлектрической проницаемостью, что облегчает протекание реакций с переносом заряда, и повышенной микровязкостью, ограничивающей свободу вращательного движения группировок активного центра .

Многие ферменты обладают аллостерическими центрами, которые служат для контакта с аллостерическими регуляторами их активности .

Многие ферменты могут быть представлены несколькими изоферментами и множественными формами. Изоферменты – это группа ферментов, выполняющих идентичную каталитическую функцию у представителей одного биологического вида, но отличающихся по структуре и ряду физико-химических свойств, что связано с генетически детерминированными различиями в первичной структуре .

Множественные формы ферментов – это группа ферментов, выполняющих идентичную каталитическую функцию у представителей одного биологического вида, но отличающихся по особенностям посттрансляционной модификации .

МЕХАНИЗМ ФЕРМЕНТАТИВНОГО КАТАЛИЗА

Для протекания любой химической реакции необходимо, чтобы реагирующие молекулы пришли в контакт друг с другом, однако не каждое столкновение молекул сопровождается их взаимодействием .

Реакция протекает только в том случае, если молекулы обладают достаточным запасом кинетической энергии. Энергию, необходимую для достижения переходного активированного состояния, или тот избыток энергии по сравнению со средней энергией молекул при данной температуре, которым они должны обладать, чтобы вступить в реакцию, называют энергией активации. Чем меньше энергия активации конкретной химической реакции, тем быстрее протекает этот процесс, т.к. вступить во взаимодействие могут молекулы с меньшим запасом энергии .

Высокие скорости ферментативных реакций являются в конечном счете результатом снижения ферментами энергии активации катализируемых ими реакций .

Снижение энергии активации ферментативной реакции достигается благодаря:

1. многостадийности ферментативных процессов (рисунок 2.1);

2. особым физико-химическим условиям среды активного центра (высокая микровязкость, низкая диэлектрическая проницаемость);

3. эффекту сближения и ориентационному эффекту, имеющим место благодаря стерическому и топохимическому соответствию фермента и субстрата;

4. индуцированному соответствию структуры активного центра фермента переходному состоянию субстрата (эффект Фишера) и возникновению напряжения в молекуле субстрата .

5. полифункциональностью кислотно-основного и ковалентного ферментативного катализа .

Рисунок 2.1 – Стадии ферментативного катализа .

Специфичность действия ферментов. Ферменты обладают высокой специфичностью действия, что существенно отличает их от неорганических катализаторов. Различают ферменты с относительной (групповой) и абсолютной специфичностью. Так, пепсин в одинаковой степени расщепляет белки животного и растительного происхождения, различающиеся как по химическому строению, так и по аминокислотному составу. Однако пепсин не расщепляет ни углеводы, ни липиды, так как мишенью его действия является пептидная связь .

Абсолютной специфичностью действия называют способность фермента катализировать превращение одного единственного субстрата Примерами таких ферментов могут служить аргиназа, расщепляющая аргинин, уреаза, катализирующая распад мочевины и др .

Помимо химической специфичности, ферменты могут проявлять и стерическую специфичность. Установлено, что при действии на субстраты, содержащие асимметричный атом углерода, ферменты катализируют превращение только одного оптического изомера .

Стереоспецифичность, как правило, бывает абсолютной, так как фермент обычно неспособен обеспечивать превращение соответствующих оптических антиподов .

В тех случаях, когда субстрат представлен симметричной молекулой, а продукт реакции содержит хиральный центр, под действием фермента почти всегда образуется один оптический изомер, т.е .

происходит асимметричный синтез. Например, при восстановлении пирувата лактатдегидрогеназой образуется только L-лактат .

Специфичность ферментов может определяться не только DLизомерией, но и другими типами стереоизомерии. Если субстрат имеет цис-конфигурацию, то фермент, как правило, не взаимодействует с трансизомером данного соединения, и наоборот. Например, фумараза может катализировать реакцию образования малата из фумарата, но не из малеата .

Между тем, существуют ферменты, одинаково хорошо катализирующие превращение всех стереоизомеров в результате способности преобразовывать имеющиеся изомеры в рацемическую смесь. В случае DL-изомерии соответствующие ферменты называют рацемазами (лактатрацемаза животных, аланин- и треонинрацемаза бактерий), в случае цис-транс-изомерии – цис-транс-изомеразы (ретиненизомераза сетчатки глаза, малеил-ацето-ацетат-изомераза печени) .

Некоторые ферменты способны различать химически идентичные группы в симметричных молекулах. Например, в реакции Сx2yz Cx'xyz (где строчные буквы обозначают группы, присоединенные к атому углерода), фермент может действовать только на один из двух химически неразличимых х-групп. Примерами ферментов, обладающих подобной специфичностью действия, могут служить глицеринкиназа, цитратсинтаза и аконитаза .

Благодаря высокой специфичности действия ферменты обеспечивают протекание с высокими скоростями лишь определенных химических реакций из огромного разнообразия возможных превращений в клетке и целостном организме, регулируя, тем самым, интенсивность обмена веществ .

ФЕРМЕНТНЫЕ СИСТЕМЫ И ПРИНЦИПЫ ИХ ОРГАНИЗАЦИИ

Ферментная система (мультимолекулярный ферментный комплекс) представляет собой совокупность ферментов, катализирующих последовательные стадии превращения определенного субстрата .

Типичными примерами ферментных систем являются пируватдегидрогеназная и -кетоглутаратдегидрогеназная системы окислительного декарбоксилирования пирувата и -кетоглутарата животных, соответственно, синтетаза жирных кислот дрожжей, дыхательная цепь митохондрий и хлоропластов .

Отличительными особенностями подобных систем является:

1. пространственная и функциональная ассоциация ферментов в комплексе;

2. обеспечение ферментной системой определенной последовательности прохождения промежуточных стадий во времени, обусловленной порядком расположения ферментов в пространстве, т.е .

ферментная система фактически представляет собой путь превращения субстрата в пространстве и во времени;

высокая молекулярная масса комплекса (2·106 - 10·106 Dа) .

3 .

По особенностям организации мультиферментные системы можно разделить на 3 группы:

1. в простейшем случае отдельные ферменты системы растворены в цитоплазме и работают независимо друг от друга .

Небольшие молекулы субстратов, обладающие высокой скоростью диффузии, легко переходят от одного фермента к другому;

2. в более организованных системах отдельные ферменты могут ассоциироваться друг с другом и функционировать совместно. Примером подобной системы может служить синтетаза жирных кислот дрожжей, представляющая собой систему из 7 ферментов, молекулы которых объединены в тесно ассоциированный недиссоциирующий комплекс .

Ферменты, составляющие данный комплекс по отдельности оказываются неактивными .

Биологический смысл существования систем подобной организации заключается в сокращении расстояния, на которое молекулы субстрата должны диффундировать по мере протекания отдельных стадий метаболического цикла;

3. к наиболее высокоорганизованным относятся ферментные системы, связанные с крупными надмолекулярными структурами, такими как биологические мембраны и рибосомы (дыхательная цепь митохондрий) .

СПОСОБЫ ВЫРАЖЕНИЯ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТА

Единица активности фермента – количество фермента, которое в стандартных условиях катализирует превращение 1 мкмоль субстрата в 1 мин (1 МЕ = 1 мкмоль/мин) .

1 КАТАЛ – количество фермента, способное в течение 1 с обеспечить превращение 1 моля субстрата в стандартных условиях .

1 КАТАЛ = 6 · 107 МЕ .

Удельная активность – число единиц ферментативной активности, приходящееся на 1 мг белка (1 мкмоль/мг белка · мин) .

Молекулярная ативность – число молей субстрата, которые подвергаются превращению молекулой фермента за 1 мин .

Активность каталитического центра – число молекул субстрата, которые претерпевают превращение за 1 мин в расчете на 1 каталитический центр .

Число оборотов фермента – число молекул субстрата, претерпевающих превращение за 1 мин в расчете на 1 активный центр или 1 активную молекулу фермента. Для большинства ферментов число оборотов составляет 1-10 тысяч в мин .

РЕГУЛЯЦИЯ БИОСИНТЕЗА ФЕРМЕНТОВ. ИНДУКЦИЯ И РЕПРЕССИЯ ФЕРМЕНТОВ

Общую теорию регуляции синтеза белка разработали Ф. Жакоб и Ж. Моно. Сущность этой теории сводится к выключению или включению генов, т.е. к возможности или невозможности проявления их способности передавать закодированную в структурных генах ДНК генетическую информацию на синтез специфических белков. Эта теория, доказанная на бактериях, у которых показана возможность индукции ферментов (синтез ферментов de novo) при добавлении в питательную среду субстратов этих ферментов. Добавление конечных продуктов реакции, образование которых катализируется этими же ферментами, напротив, вызывает уменьшение количества синтезируемых ферментов .

Это явление получило название репрессии синтеза ферментов .

Согласно теории Ф. Жакоба и Ж. Моно, в биосинтезе белка у бактерий участвуют структурные гены, ген-регулятор, ген-оператор (рисунок 2.2). Структурные гены определяют первичную структуру синтезируемого белка, т.е. являются основой для биосинтеза мРНК, которая служит матрицей для биосинтеза белка .

Синтез мРНК контролируется геном-оператором, он служит пусковым механизмом для функционирования структурных генов, и локализован на крайнем отрезке структурного гена (структурных генов), регулируемого им. Координированная 1 оператором группа структурных генов образует оперон. Считывание генетического кода начинается с промотора – участка ДНК, расположенного рядом с геном-оператором и являющегося точкой инициации для синтеза мРНК .

Функционирование оперона находится под контролем генарегулятора. Связь между структурными генами и геном-регулятором осуществляется при помощи белка-репрессора, который считывается с гена-регулятора. Репрессор имеет сродство к гену-оператору и обратимо соединяется с ним в комплекс. Образование такого комплекса приводит к блокированию синтеза мРНК и, следовательно, синтеза белка, т.е .

функция гена-регулятора состоит в том, чтобы через белок-репрессор прекращать деятельность структурных генов, синтезирующих мРНК .

Рисунок 2.2 – Структура и функционирование оперона (по Ф .

Жакобу и Ж. Моно) .

Описанный механизм был доказан в опытах на E.сoli на примере синтеза -галактозидазы (лактазы), расщепляющей молочный сахар на глюкозу и галактозу. Дикий штамм E. coli обычно растет на глюкозе .

Если вместо глюкозы в питательную среду добавить лактозу (новый источник энергии и углерода), то штамм не будет расти, пока не будут синтезированы соответствующие ферменты (адаптивный синтез). При поступлении в клетку лактозы (индуктор), молекулы ее связываются с белком-репрессором и блокируют связь между репрессором и геномоператором. Ген-оператор и структурные гены при этом начинают снова функционировать и синтезировать необходимую мРНК, которая обеспечивает синтез -галактозидазы. Одновременно ген-регулятор продолжает вырабатывать репрессор, но он блокируется новыми молекулами лактозы, поэтому синтез фермента продолжается. Как только молекулы лактозы будут полностью расщеплены, репрессор освобождается и связывает ген-оператор, блокируя синтез мРНК, а следовательно, синтез -галактозидазы .

У высших животных синтез ферментов de novo наблюдается реже. В настоящее время он описан для тирозинтрансаминазы, серин- и треониндегидротазы, триптофанпирролазы (их количество возрастает в ответ на обильный прием белковой пищи), а также гидроксилаз эндоплазматического ретикулума (при поступлении в организм ядов, алкалоидов, фармакологических средств) .

Кроме того, было показано, что концентрация многих ферментов в клетках резко снижается при повышении содержания конечных продуктов, образующихся в цепи ферментативных реакций. Такой эффект, получивший название репрессии синтеза ферментов, часто наблюдается в реакциях биосинтеза. В этих случаях молекулы репрессора, также образующиеся по команде гена-регулятора, являются неактивными и сами по себе не обладают способностью подавлять деятельность гена-оператора и, следовательно, всего оперона, но приобретают такую способность после образования комплекса с конечным или одним из конечных продуктов биосинтетического процесса .

РЕГУЛЯЦИЯ КАТАЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ

Основными способами регуляции активности уже синтезированных ферментов являются:

1. аллостерическая регуляция;

2. регуляция путм посттрансляционной ковалентной модификации молекулы фермента;

3. регуляция ограниченным протеолизом .

4. изменение физико-химических условий внутриклеточной среды;

5. регуляция посредством белок-белковых взаимодействий .

Аллостерическая регуляция. Помимо активного центра в молекуле фермента может присутствовать также аллостерический центр, представляющий собой пространственно удалнный от активного центра участок молекулы, с которым нековалентно связываются определенные, часто низкомолекулярные вещества (эффекторы, или модификаторы), структурно отличающиеся от молекул субстрата. Присоединение эффектора к аллостерическому центру приводит к изменению третичной (четвертичной) структуры фермента и, соответственно, конфигурацию активного центра, вызывая снижение или повышение ферментативной активности .

Эффектор, вызывающий снижение активности фермента, называют отрицательным эффектором, или ингибитором. Эффектор, вызывающий повышение активности ферментов, называют положительным эффектором, или активатором. Ферменты, активность которых подвергается аллостерической регуляции, называются аллостерическими ферментами .

Аллостерическая регуляция ферментов обратима: отсоединение эффектора восстанавливает исходную каталитическую активность фермента .

Регуляция каталитической активности ферментов путм ковалентной посттрансляционной модификации .

Посттрансляционная модификация ферментов является одним из типов регуляции, определяющим интенсивность процессов обмена веществ многоклеточного организма .

Посттрансляционная модификация включает в себя следующие преобразования молекулы фермента:

1. ограниченный протеолиз,

2. фосфорилирование и дефосфорилирование,

3. метилирование и деметилирование,

4. гликозилирование и дегликозилирование,

5. уридилирование и деуридилирование,

6. аденилирование и деаденилирование,

7. АДФ-рибозилирование,

8. гидроксилирование по остаткам пролина и лизина,

9. ацетилирование,

10.карбоксилирование остатков глутамата и аспартата,

11.фарнезилирование остатков цистеина .

Регуляция активности ферментов ограниченным протеолизом .

Некоторые ферменты, функционирующие в желудочно-кишечном тракте и в плазме крови (ферменты системы свертывания крови), синтезируются в виде неактивных предшественников и активируются только в результате гидролиза одной или нескольких пептидных связей, что приводит к отщеплению части белковой молекулы предшественника. В результате в оставшейся части белковой молекулы происходит конформационная перестройка и формируется активный центр фермента .

Данный процесс впервые описан в 50-х гг. 20 в. К. ЛиндергстремомЛангом и получил название ограниченного протеолиза .

Наиболее быстрый и широко распространнный способ ковалентной модификации ферментов – их обратимое фосфорилирование и дефосфорилирование по ОН-группам аминокислот .

Присоединение остатка фосфорной кислоты протеинкиназой или его отщепление фосфатазой приводит к изменению конформации активного центра и его каталитической активности. При этом результат может быть двояким: одни ферменты при фосфорилировании активируются, другие, напротив, становятся менее активны Активность самих протеинкиназ и фосфатаз регулируется гормонально, что позволяет быстро изменять активность ключевых ферментов метаболических путей в зависимости от условий внешней и внутренней среды .

Регуляция функционирования ферментных систем .

Ферментные системы обладают способностью поддерживать необходимую скорость суммарного процесса преобразования исходного субстрата. Это достигается благодаря способности конечного продукта ферментного комплекса оказывать ингибирующее действие на первый фермент системы. В результате скорость всего процесса в целом определяется стационарной концентрацией конечного продукта .

Примером может служить регуляция функционирования ферментной системы, катализирующей превращение L-треонина в Lизолейцин (рисунок 3.2). Первый фермент этой последовательности реакций – L-треониндезаминаза – даже взятый в высокоочищенном виде, подвержен сильному ингибирующему действию L-изолейцина (конечного продукта процесса) и не ингибируется ни одним из промежуточных продуктов. Очевидно, что если в данной системе накопится количество изолейцина, превышающее определенный допустимый уровень, то первая ферментативная реакция, ведущая к его образованию, окажется заингибированной. Такой тип ингибирования конечным продуктом называют ингибированием по типу обратной связи, или ретро-ингибированием .

Физико-химические факторы, влияющие на скорость ферментативных реакций Скорость ферментативной реакции определяют по количеству молей субстрата, превращаемых в стандартных условиях (25 С, оптимальное значение рН, полное насыщение фермента субстратом) в единицу времени, или по количеству молей продукта реакции, образующихся в единицу времени в этих условиях .

Скорость ферментативной реакции, измеренная при соблюдении стандартных условий, обозначается Vmax и называется максимальной скоростью ферментативной реакции .

Влияние концентрации субстрата на скорость ферментативной реакции. Как показано на рисунке 2.3, скорость ферментативной реакции линейно возрастает с увеличением концентрации субстрата. При достижении состояния насыщения фермента субстратом скорость ферментативной реакции достигает значения Vmax и кривая идет параллельно оси абсцисс .

В некоторых случаях увеличение концентрации субстрата, которое вначале приводило к увеличению скорости реакции, вызывает затем ее снижение. Данное явление получило название субстратного торможения (рисунок 2.4).

Среди основных причин субстратного торможения выделяют:

0.25 скорость реакции,

–  –  –

1. уменьшение сродства фермента к субстрату или образование неактивного фермент-субстратного комплекса при присоединении к активному или аллостерическому центру фермента добавочных молекул субстрата .

2. связывание избытком субстрата молекул активатора данного фермента или конкурирование субстрата с активатором за связывание с молекулой фермента .

3. нарушение избытком субстрата связывания кофермента с белковой частью сложного фермента .

–  –  –

Рисунок 2.4 – Зависимость скорости реакции от концентрации субстрата при субстратном торможении Влияние концентрации фермента на скорость катализируемой реакции .

Зависимость скорости реакции от концентрации фермента является линейной (рисунок 2.5, график 1) .

скорость реакции, ммоль/мин

–  –  –

Нелинейная зависимость при высоких концентрациях фермента (рисунок 2.5, график 2) наблюдается вследствие нехватки субстрата или активатора, агрегации молекул фермента, приводящей к маскировке активных центров. Отсутствие прямо пропорциональной зависимости при небольших концентрациях фермента может быть результатом присутствия в инкубационной среде токсических примесей, связывающихся с ферментом и инактивирующих его .

Влияние величины рН на скорость ферментативной реакции .

Графическая зависимость скорости большинства ферментативных реакций от величины рН имеет колоколообразную форму (рисунок 2.6) .

активность фермента, %

–  –  –

Рисунок 2.6– Зависимость скорости реакции от величины рН То значение рН, при котором скорость реакции максимальна, называется оптимумом рН (таблица 3 .

1); при отклонении рН в любую сторону от этого значения скорость реакции снижается .

–  –  –

Чувствительность ферментов к изменению рН определяется наличием в их составе ионогенных групп. Состояние ионизации функционально важных групп влияет на каталитическую активность фермента. Во многих случаях к ионизации способны и определенные группы субстрата, что также оказывает влияние на значение оптимума рН данной ферментативной реакции. Кроме того, рН может оказывать косвенное влияние на активность фермента, дестабилизируя его структуру, нарушать прочность связи апофермента с кофактором, изменяя состояние активаторов и ингибиторов фермента .

Влияние температуры на скорость ферментативной реакции .

Зависимость каталитической активности фермента от температуры выражается типичной кривой, представленной на рисунке 2.7 .

скорость реакции,

–  –  –

Рисунок – 2.7. Влияние температуры на активность фермента По характеру кривой видно, что до некоторого значения температуры каталитическая активность фермента растет, причем на каждые 10 С примерно в 2 раза повышается скорость преобразования субстрата. В то же время постепенно возрастает количество инактивированного фермента за счет денатурации его белковой части. При температуре выше 50 С денатурация фермента резко усиливается и, хотя скорость реакции продолжает расти, активность фермента, выражающаяся количеством превращенного субстрата, падает .

Температура, при которой каталитическая активность фермента максимальна, называется его температурным оптимумом .

Температурный оптимум для различных ферментов неодинаков. В общем случае для ферментов животного происхождения он лежит между 40 и 50 С, для ферментов растительного происхождения - между 50 и 60 С .

Однако есть ферменты с более высоким температурным оптимумом, например, у папаина оптимум соответствует 80 С. В то же время у каталазы оптимальная температура катализа находится между 0 и 10 С, при более высоких температурах происходит активное окисление фермента и его инактивация .

Влияние ингибиторов на активность ферментов Ингибитор – вещество, специфически уменьшающее скорость ферментативной реакции .

Классификация ингибиторов (по Э. Уэббу):

1. Ингибиторы, связывающиеся с апоферментом .

ингибиторы, связывающие функциональные группы фермента .

ингибиторы, изменяющие третичную и четвертичную структуру фермента .

ингибиторы, специфически связывающиеся с определенным участком апофермента (активный центр, аллостерический центр) .

ингибиторы, неспецифически адсорбирующиеся на белке .

2. Ингибиторы, образующие комплекс с субстратом, который хуже связывается с ферментом или подвергается каталитическому превращению с меньшей скоростью .

3. Ингибиторы, связывающие кофермент .

4. Ингибиторы, связывающие активатор .

5. Ингибиторы, взаимодействующие с фермент-субстратными комплексами .

6. Ингибиторы, связывающие низкомолекулярные соединения, участвующие в поддержании четвертичной структуры фермента .

Взаимодействие ингибитора с ферментом может быть обратимым или необратимым. Критерием обратимости (необратимости) на практике служит восстановление (невосстановление) активности фермента при диализе или сильном разведении раствора, содержащего фермент и ингибитор .

Особенностью обратимого торможения является быстрое установление и наличие равновесия между фермент-ингибиторным комплексом и свободными ферментом и ингибитором. Иными словами, для обратимого ингибирования степень торможения, определяющаяся количеством фермента, связанного с ингибитором, не зависит от времени, а определяется концентрацией ингибитора и его сродством к ферменту .

Для необратимого ингибирования характерно развитие реакции во времени и возрастание степени торможения фермента с течением времени. Поэтому даже при небольшой концентрации ингибитора, сопоставимой с концентрацией фермента, можно добиться полного связывания фермента с ингибитором и полного торможения катализа .

Обратимое ингибирование активности фермента подразделяется на:

конкурентное, неконкурентное, бесконкурентное и смешанное .

К конкурентному ингибированию относят обратимое снижение скорости ферментативной реакции, вызванное ингибитором, связывающимся с активным центром фермента и препятствующим образованию фермент-субстратного комплекса. Такой тип ингибирования наблюдают, когда ингибитор - структурный аналог субстрата, в результате возникает конкуренция молекул субстрата и ингибитора за место в активном центре фермента. В этом случае с ферментом взаимодействует либо субстрат, либо ингибитор, образуя комплексы фермент-субстрат (ES) или фермент-ингибитор (EI). При формировании комплекса фермента и ингибитора (EI) продукт реакции не образуется .

Неконкурентным называют такое ингибирование ферментативной реакции, при котором ингибитор взаимодействует с ферментом в участке, отличном от активного центра. Неконкурентные ингибиторы не являются структурными аналогами субстрата. Присоединение неконкурентного ингибитора вызывает изменение конформации молекулы фермента таким образом, что нарушается взаимодействие субстрата с активным центром фермента, что приводит к снижению скорости ферментативной реакции .

Бесконкурентное ингибирование наблюдается в том случае, когда ингибитор обратимо взаимодействует с ферментом только после образования фермент-субстратного комплекса. Образующийся в этом случае тройной комплекс фермент-субстрат-ингибитор не подвергается дальнейшему превращению, в результате чего скорость реакции замедляется .

Смешанное ингибирование сочетает в себе конкурентное и неконкурентное торможение. Ингибитор, присоединяясь в активном центре фермента, изменяет сродство фермента к субстрату и, одновременно, каталитическую активность фермента .

Специфическую группу ингибиторов ферментов, привлекающих огромное внимание в последнее время, составляют ингибиторы белковой природы. Они блокируют действие ферментов за счет белок-белковых взаимодействий, в результате которых экранируется активный центр фермента. Особенно активно данные ингибиторы регулируют активность протеиназ клетки, что оказывает влияние на обмен веществ в целом, поскольку под действием ингибиторов протеиназ тормозится переход проферментов в их активные формы, отщепление сигнальных пептидов и других пептидных фрагментов при созревании белков, блокируются реакции протеолиза, ведущие к образованию биологически активных пептидов (рилизинг-факторов, гормонов) .

Влияние активаторов на активность ферментов .

К числу природных активаторов ферментов относятся ионы Cl- и ионы многих металлов. Показано, что 15 различных катионов металлов, а именно Na+, K+, Rb+, Cs+, Mg2+, Ca2+, Zn2+, Cd2+, Cr3+, Cu2+, Mn2+, Fe2+, Co2+, Ni2+, Al3+ и NH4+ активируют один или несколько ферментов .

Например, ионы Mg2+ - обычный активатор киназ, синтетаз и ферментов, катализирующих гидролиз ангидридов фосфорной кислоты. Mn2+ активирует креатинфосфокиназу, малатдегидрогеназу, глутаматсинтетазу, люциферазу (таблица) .

Иногда для активации фермента требуются одновременно 2 иона, обычно с различной валентностью. Например, для активации пантотенатсинтетазы требуются ионы Mg2+ или Mn2+ и, кроме того, K+ или NH4+ .

Таблица. 2.2. Некоторые ферменты, активируемые металлами

–  –  –

Описано несколько механизмов активации ферментов ионами металлов:

1. металл является необходимым компонентом активного центра фермента .

2. металл функционирует как мостик между ферментом и субстратом, удерживая последний в активном центре фермента .

(Al3+)

3. поливалентный катион металла поддерживает электрокинетический потенциал фермента .

4. ионы металла удаляют ингибитор, присутствующий в ферментном препарате, связывая его в виде комплекса или вызывая его выпадение в осадок .

КЛАССИФИКАЦИЯ И НОМЕНКЛАТУРА ФЕРМЕНТОВ

Энзимология довольно долго не располагала строгой научной номенклатурой ферментов. Наименования ферментов давали по случайным признакам (тривиальная номенклатура), по названию субстрата (рациональная), по химическому составу фермента и, наконец, по типу катализируемой реакции и характеру субстрата .

Примерами тривиальной номенклатуры могут служить названия таких ферментов, как пепсин (от греч. пепсис – пищеварение), трипсин (от греч. трипсис – разжижаю), папаин (от названия дынного дерева Carica papaja, из сока которого он выделен) .

Наибольшее распространение получила рациональная номенклатура, согласно которой название фермента составляется из названия субстрата и характерного окончания -аза. Так, фермент, ускоряющий реакцию гидролиза крахмала, получил название амилаза (от греч. амилон – крахмал), гидролиза липидов – липаза (от греч .

липос – жир), гидролиза белков – протеаза, гидролиза мочевины – уреаза (от греч. уреа – мочевина) и т.д .

В 1961 г. Международная комиссия по номенклатуре ферментов приняла новый проект номенклатуры ферментов, построенный на строго научных принципах. Согласно этой номенклатуре название фермента состоит из химического названия субстрата и названия реакции, осуществляемой данным ферментом .

Если катализируемая ферментом реакция сопровождается переносом группы атомов от субстрата к акцептору, название фермента включает также химическое название акцептора. Например, фермент, катализирующий реакцию переаминирования между L-аланином и кетоглутаратом, называется L-аланин: -кетоглутаратаминотрансферазой. В этом названии отмечены сразу 3 особенности реакции: 1) субстратом является L-аланин, 2) акцептором служит кетоглутарат, 3) от субстрата к акцептору передается аминогруппа .

В связи со значительным усложнением научных названий в новой номенклатуре, в ряде случаев допускается использование тривиальных и рациональных названий ферментов .

В 1972 г. комиссией по номенклатуре биохимических соединений Международного союза теоретической и прикладной химии были предложены "Правила номенклатуры ферментов", имеющие кодовое четырхзначное цифровое обозначение, где первая цифра обозначает класс фермента, вторая цифра (подкласс) уточняет природу преобразуемой группы или модифицируемой связи, третья (подподкласс)

- уточняет природу дополнительных участников реакции (например, донора и акцептора) и четвртая - порядковый номер фермента в данной подгруппе .

Например, шифр уреазы выражается цифрами 3.5.1.5. Это означает, что уреаза относится к 3-ему классу ферментов, все представители которого катализируют реакции гидролиза. Вторая цифра говорит о том, что уреаза принадлежит к 5-ому подклассу этого класса, куда относятся ферменты, ускоряющие гидролиз связей типа С-N, не являющихся пептидными. Третья цифра (1) указывает на принадлежность уреазы к подподклассу, представители которого ускоряют гидролиз линейных амидов. Последняя цифра (5) - это порядковый номер уреазы в этом подподклассе .

Общий перечень классов ферментов:

1. оксидоредуктазы – ферменты, ускоряющие окислительновосстановительные реакции .

2. трансферазы – ферменты, ускоряющие реакции переноса функциональных групп .

3. гидролазы – ферменты, ускоряющие реакции гидролитического распада .

4. лиазы (синтазы) – ферменты, ускоряющие негидролитическое отщепление от субстратов определенных групп атомов с образованием двойной связи или присоединение групп атомов по двойной связи .

5. изомеразы – ферменты, ускоряющие пространственные или структурные перестройки в пределах одной молекулы .

6. лигазы (синтетазы) – ферменты, ускоряющие реакции синтеза, сопряженные с распадом макроэргов .

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ

1. Классификация и номенклатура ферментов .

2. Активный центр фермента, его строение, роль в биокатализе .

3. Структурная организация ферментов, роль белковой и небелковой части сложных ферментов .

4. Специфичность ферментов, виды специфичности .

5. Единицы активности ферментов .

6. Изоферменты и множественные формы ферментов .

7. Стадии ферментативного катализа. Механизм действия ферментов .

8. Кинетика ферментативных реакций .

9. Ферментные системы и регуляция их функционирования .

10. Ингибиторы ферментов. Классификация ингибиторов .

11. Активаторы ферментов. Механизмы активации ферментов ионами металлов .

ЛАБОРАТОРНЫЕ РАБОТЫ

–  –  –

Ход работы. 50 г пекарских дрожжей тщательно растирают в ступке с кварцевым песком, наносят тонким слоем на стеклянную пластинку и высушивают при комнатной температуре. Высушенные дрожжи растирают в порошок. Для извлечения сахаразы к полученному порошку приливают небольшими порциями 100 мл дистиллированной воды при постоянном перемешивании .

Полученную смесь помещают в термостат при 30 С на 1 ч. Затем смесь тщательно перемешивают и фильтруют через складчатый фильтр .

В полученном фильтрате обнаруживают сахаразную активность .

Обнаружение сахаразной активности

Реактивы:

1. фелинговая жидкость;

2. 2 % раствор сахарозы .

Ход работы. В две пробирки наливают по 0,5 мл раствора дрожжевой сахаразы. Содержимое одной из них кипятят для разрушения фермента и охлаждают. Затем в обе пробирки добавляют по 3 мл раствора сахарозы и инкубируют в течение 15 мин при комнатной температуре. По истечении указанного времени в обе пробирки добавляют по 2 мл фелинговой жидкости и нагревают до кипения. В пробирке с активным ферментом образуется красный осадок закиси меди, что указывает на присутствие глюкозы, образовавшейся из сахарозы в ходе ферментативной реакции. В пробирке, где фермент подвергся термоинактивации, осадка закиси меди не образуется .

Лабораторная работа 2 .

ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ И КИСЛОТНЫЙ ГИДРОЛИЗ

КРАХМАЛА

Ферментативный гидролиз крахмала Ферментативный гидролиз крахмала проводят в присутствии фермента амилазы. -амилаза катализирует гидролиз (14)гликозидных связей крахмала, в результате чего увеличивается число свободных гликозидных гидроксильных групп, проявляющих восстанавливающие свойства, что можно проследить с помощью реакции Троммера или реакции Фелинга .

Рис. 2.8 – Гидролиз крахмала ферментом -амилаза

–  –  –

Реактивы:

1. раствор Люголя;

2. 0,5 % раствор крахмала;

3. 5 % раствор NaOH;

4. 5 % раствор CuSO4;

5. препарат амилазы (1 таблетку коммерческого препарата Мезим растолочь в ступке пестиком и растворить в 100 мл дистиллированной воды) .

Ход работы. На предметное стекло, под которое подложен лист белой бумаги, наносят 2 ряда из 6 отдельных капель раствора Люголя. В одну пробирку наливают 3 мл 0,5 % раствора крахмала и 1 мл препарата амилазы, в другую – 3 мл раствора крахмала. Обе пробирки помещают в водяную баню (термостат), предварительно прогретую до 37 С. Каждые 2 мин берут глазными пипетками из каждой пробирки каплю жидкости и наносят ее на каплю раствора Люголя .

Сначала синее окрашивание будет проявляться при добавлении капель, взятых из обеих пробирок, затем только при добавлении капель из пробирки без амилазы. Капля содержимого из пробирки, в которой протекает ферментативный гидролиз, будет окрашиваться раствором Люголя в красно-бурый цвет, затем в желтый и, наконец, перестанет давать окрашивание .

Наблюдают также наличие опалесценции в контрольной пробирке (без амилазы) и ее отсутствие в пробирке, содержащей фермент .

Кислотный гидролиз крахмала

Реактивы:

1. 0,5 % раствор крахмала;

2. 10 % раствор Н2SO4;

3. 5 % раствор NaOH;

4. 5 % раствор CuSO4 .

Ход работы. В небольшой стакан наливают 15 мл раствора крахмала (обратить внимание на наличие опалесценции раствора!) и 5 мл 10 % раствора серной кислоты. Жидкость в стакане кипятят на водяной бане 10 мин, добавляя по мере выкипания дистиллированную воду .

Содержимое стакана охлаждают (обратить внимание на отсутствие опалесценции!) и нейтрализуют добавлением 10 капель 5 % раствора NaOH. С 2 мл гидролизата проводят реакцию Троммера .

Реакция Троммера. Для этого к гидролизату добавляют равный объем (2 мл) 5 % раствора NaOH. Затем по каплям приливают раствор CuSO4 до появления неисчезающей мути Cu(OН)2 голубого цвета. Смесь нагревают на кипящей водяной бане до образования кирпично-красного окрашивания, обусловленного оксидом меди (I) .

–  –  –

Специфичность действия амилазы

Реактивы:

1. 2 % раствор сахарозы;

2. 0,5 % раствор крахмала;

3. 5 % раствор NaOH;

4. 5 % раствор CuSO4;

5. препарат амилазы (1 таблетку коммерческого препарата Мезим растолочь в ступке пестиком и растворить в 100 мл дистиллированной воды);

Ход работы. В одну пробирку наливают 5 мл раствора крахмала, в другую – 5 мл раствора сахарозы. В обе пробирки добавляют по 1 мл препарата амилазы и инкубируют 10 мин при 37 °С на водяной бане, после чего проводят реакцию Троммера с содержимым обеих пробирок (см. выше) .

Убеждаются, что под действием амилазы произошел гидролиз крахмала, но не сахарозы .

–  –  –

4. 5 % раствор CuSO4;

5. препарат дрожжевой сахаразы .

Ход работы. В одну пробирку наливают 5 мл раствора крахмала, в другую – 5 мл раствора сахарозы. В обе пробирки добавляют по 1 мл препарата сахаразы и инкубируют 10 мин при 37 °С на водяной бане, после чего проводят реакцию Троммера с содержимым обеих пробирок (см. выше) .

Убеждаются, что под действием амилазы произошел гидролиз сахарозы, но не крахмала .

–  –  –

ВЛИЯНИЕ рН, ТЕМПЕРАТУРЫ, АКТИВАТОРОВ И

ИНГИБИТОРОВ НА АКТИВНОСТЬ АМИЛАЗЫ

Влияние величины рН на активность амилазы Активность амилазы максимальна в почти нейтральной среде (рН 6.8) и подавляется как кислотами, так и щелочами .

Реактивы:

1. 0,5 % раствор крахмала;

2. раствор Люголя;

3. 0,1 н раствор НСl;

4. препарат амилазы (1 таблетку коммерческого препарата Мезим растолочь в ступке пестиком и растворить в 100 мл дистиллированной воды);

5. буферные растворы с рН 1,2: 6,8; 10,0 .

Ход работы. В три пронумерованные пробирки вносят по 3 мл буферных растворов с рН 1,2: 6,8; 10,0, соответственно. В каждую пробирку добавляют по 1 мл препарата амилазы и по 2 мл раствора крахмала, содержимое пробирок хорошо перемешивают. Пробирки инкубируют 10 мин при 37 °С. Подкисляют содержимое второй и третьей пробирок, добавив соответственно 1 и 2 мл раствора соляной кислоты (реакция на крахмал с йодом протекает только в кислой среде), и проводят реакцию с реактивом Люголя .

Влияние температуры на активность амилазы

Реактивы:

1. 0,5 % раствор крахмала;

2. раствор Люголя;

3. 5 % раствор NaOH;

4. препарат амилазы (1 таблетку коммерческого препарата Мезим растолочь в ступке пестиком и растворить в 100 мл дистиллированной воды);

5. 5 % раствор CuSO4 .

Ход работы. В четыре пронумерованные пробирки вносят по 4 мл раствора крахмала и по 1 мл препарата амилазы. Первую пробирку быстро помещают в кипящую водяную баню, вторую – в лед, третью – в термостат при 37 °С, четвертую оставляют при комнатной температуре .

Через 10 мин содержимое каждой пробирки разделяют на две приблизительно равные части .

С одной частью проводят пробу на крахмал: добавляют 2 капли раствора Люголя – синее окрашивание свидетельствует о наличии негидролизованного крахмала. С другой частью проводят реакцию Троммера (см. выше). Появление желтого окрашивания, переходящего в кирпично-красное, свидетельствует о наличии восстанавливающих углеводов (глюкозы), появившихся после полного расщепления крахмала .

Влияние активаторов и ингибиторов на активность амилазы

Реактивы:

1. 0,5 % раствор крахмала;

2. раствор Люголя;

3. 1 % раствор NaCl;

4. препарат амилазы (1 таблетку коммерческого препарата Мезим растолочь в ступке пестиком и растворить в 100 мл дистиллированной воды);

5. 5 % раствор CuSO4 .

Ход работы. Берут три пронумерованные пробирки. В первую наливают 10 капель дистиллированной воды, во вторую – 8 капель воды и 2 капли раствора NaCl, в третью – 8 капель воды и 2 капли раствора CuSO4. В каждую пробирку добавляют по 10 капель препарата амилазы, тщательно перемешивают. Затем во все пробирки добавляют по 5 капель раствора крахмала, вновь перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 10 мин. Затем во все пробирки добавляют по 1 капле раствора Люголя .

Анализируют результаты: активатором амилазы является раствор NaCl (2-я пробирка), ингибитором (3-я пробирка) .

Лабораторная работа 5. ПОЛУЧЕНИЕ УРЕАЗЫ ИЗ СОЕВОЙ МУКИ

Уреаза – фермент, расщепляющий мочевину на аммиак и углекислый газ. Уреаза в больших количествах содержится в семенах сои, белой акации, в микроорганизмах. У позвоночных животных она отсутствует .

Получение уреазы

Реактивы:

1. серный эфир;

2. ацетон .

Ход работы. Бобы сои размалывают на кофейной мельнице и хорошо растирают в ступке пестиком. Муку высыпают в колбу и встряхивают в течение 10 мин с серным эфиром для обезжиривания, после чего смесь фильтруют на воронке Бюхнера. Обезжиренную муку высушивают при комнатной температуре, распределяя тонким слоем на стеклянной пробирке .

20 г обезжиренной соевой муки настаивают в 100 мл дистиллированной воды в течение 15 ч на холоду, после чего фильтруют через складчатый фильтр. Полученный фильтрат вливают в 4-ехкратный объем ацетона. Выпавший осадок, содержащий активную уреазу, высушивают при комнатной температуре .

Определение уреазной активности

Реактивы:

1. 1 % водный раствор мочевины;

2. 1 % спиртовой раствор фенолфталеина;

3. 0,01 % раствор уреазы .

Ход работы. В пробирку наливают 5 мл раствора мочевины, 3 капли спиртового раствора фенолфталеина и 0,1 мл раствора уреазы .

Пробирку помещают в термостат (38 С) на 30 мин. Смесь окрашивается в малиново-красный цвет, ощущается запах выделяющегося аммиака .

–  –  –

ВЫДЕЛЕНИЕ И ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ

АЛКОГОЛЬДЕГИДРОГЕНАЗЫ ИЗ ПЕКАРСКИХ ДРОЖЖЕЙ

Алкогольдегидрогеназа – цинксодержащий металлофермент, катализирующий обратимое окисление спиртов до альдегидов или

–  –  –

Получение алкогольдегидрогеназы

Реактивы:

1. 66 ммоль/л раствор Na2HPO4;

2. ацетон;

3. 1 ммоль/л К-фосфатный буфер, рН 7,5;

4. (NH4)2SO4 (крист.);

5. насыщенный раствор (NH4)2SO4;

6. полунасыщенный раствор (NH4)2SO4 .

Ход работы. 50 г сухих дрожжей заливают 150 мл 66 ммоль/л раствора Na2HPO4 и термостатируют при 37оС в течение 2 ч (периодически перемешивая до получения однородной суспензии). Затем суспензию охлаждают до комнатной температуры и центрифугируют 30 мин при 18 000 g. Центрифугат нагревают до 55оС на водяной бане, термостатируют в течение 15 мин, а затем охлаждают на льду. После охлаждения центрифугируют 7 мин при 40 000 g. Центрифугат помещают в ледяную баню и добавляют предварительно охлажденный ацетон (50 мл ацетона на каждые 100 мл дрожжевого экстракта) .

Затем смесь центрифугируют при 18 000 g в течение 5 мин на холоду. К центрифугату добавляют еще 55 мл ацетона на каждые 100 мл дрожжевого экстракта и центрифугируют повторно при 40 000 g в течение 5 мин .

Осадок суспендируют в 40 мл дистиллированной воды и диализуют против 1 л фосфатного буфера в течение 3 часов при непрерывном перемешивании. Очищенный препарат алкогольдегидрогеназы используют для определения активности .

Определение активности алкогольдегидрогеназы

Реактивы:

1. 60 ммоль/л Na-фосфатный буфер, рН 8,5;

2. этанол;

3. 15 ммоль/л НАД+ ;

4. изопропанол .

Ход работы. В кювету для спектрофотометра помещают реакционную смесь следующего состава: 2,25 мл дистиллированной воды, 0,5 мл натрий-фосфатного буфера (рН 8,5), 0,1 мл раствора НАД+, 0,05 мл ферментого препарата,0,1 мл этилового спирта. Смесь перемешивают и измеряют оптическую плотность в кварцевой кювете при 340 нм (контроль вместо этилового спирта содержит 0,1 мл бидистиллированной воды). Через 30 с повторно измеряют оптическую плотность при 340 нм и рассчитывают активность фермента по закону Бугера-Ламберта-Бера, принимая во внимание, что коэффициент молярной экстинкции при 340 нм для НАДН 6,22.103М-1см-1 .

–  –  –

ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ПЕРОКСИДАЗЫ

В КАРТОФЕЛЕ

Пероксидаза – фермент, катализирующий окисление пероксидом водорода различных полифенолов и ароматических аминов:

пероксидаза восстановленный субстрат + H2O2 окисленный субстрат + 2Н2О .

Реактивы:

1. 1 % раствор пирогаллола;

2. 2 % раствор пероксида водорода .

Ход работы. 10 г сырого картофеля натереть на терке, выжать сок. К 2 мл полученного сока добавить 1 мл раствора пирогаллола и 2 капли 2 % раствора пероксида водорода. Наблюдают постепенное исчезновение первоначальной синей окраски раствора и выпадение бурого осадка пурпурогаллина .

–  –  –

ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ КАТАЛАЗЫ

ПО А. Н. БАХУ И А. И. ОПАРИНУ

Реактивы:

1. 0.1 н раствор перманганата калия;

2. 10 % раствор серной кислоты;

3. 0,1 н раствор пероксида водорода;

4. кальций углекислый (крист.) .

Ход работы. 2 г свежего растительного материала (зеленый лист, морковь, картофель) растирают в ступке пестиком, постепенно добавляя 5 мл дистиллированной воды. Для нейтрализации рН к полученной смеси добавляют кристаллы углекислого кальция (на кончике шпателя) .

После растирания смесь переносят в мерную колбу и доливают дистиллированной водой до 100 мл. Смесь оставляют на 30 мин при комнатной температуре, после чего фильтруют через складчатый фильтр .

К 25 мл 0,1 н раствора пероксида водорода добавляют 20 мл вытяжки фермента. Через 30 мин реакцию останавливают добавлением 5 мл 10 % раствора серной кислоты и титруют смесь 0,1 н раствором перманганата калия до образования устойчивого розового окрашивания .

Отмечают количество миллилитров раствора перманганата калия, израсходованного на титрование пероксида водорода, неизрасходованного в ходе ферментативного процесса .

Параллельно ставят контрольный опыт с 20 мл ферментного раствора, инактивированного 5-минутным нагреванием на кипящей водяной бане. После охлаждения контрольного раствора к нему добавляют 25 мл 0,1 н пероксида водорода, инкубируют 30 мин при комнатной температуре. Реакцию останавливают добавлением 5 мл 10 % серной кислоты и титруют 0,1 н раствором перманганата калия, отмечая необходимое для титрование его количество .

Расчет количества пероксида водорода, разложенного ферментом, ведется по разности опытного и контрольного определения .

Ход ферментативного процесса описывается уравнением:

5 Н2О2 + 2 КМnO4 + 3 H2SO4 2 MnSO4 + K2SO4 + 5 O2 + 8 H2O .

1 мл 0,1 н раствора перманганата калия соответствует 1,7 мг пероксида водорода, поскольку: Э · н / 1000 = 17 · 0,1 / 1000 = 0,0017 г, или 1,7 мг .

Пример расчета. Приготовлена вытяжка каталазы из 1,25 г моркови в 100 мл дистиллированной воды. На титрование опытной пробы затрачено 15,5 мл раствора перманганата калия, на титрование контрольной – 30,2 мл данного реагента. Количество разложившегося пероксида водорода соотавляет 30,2 – 15,5 = 14,7 мл 0,1 н раствора перманганата калия, т.е. 14,7 · 1,7 мг = 24,99 мг пероксида водорода .

Количество пероксида водорода, которое может быть разложено каталазой в 1 г моркови, равно 24,99 · 100 / 20 · 1,25 = 99,96 мг .

ТЕСТЫ, УПРАЖНЕНИЯ И ЗАДАЧИ

1. Размерностью константы Михаэлиса является:

А. моль/л; Б. КАТАЛ/кг; В. моль/с; Г. мин .

2. Абсолютная специфичность характерна для:

А. пептидазы; Б. уреазы; В. пепсина; Г. фосфатазы .

3. Белковая часть двухкомпонентных ферментов называется:

А. холоферментом; В. коферментом;

Б. апоферментом; Г. простетической группой .

4. Группа ферментов, выполняющих у данного вида млекопитающих сходную каталитическую функцию, но отличающихся особенностями строения вследствие посттрансляционной модификации первичного белкового продукта, называется:

А. изоферментами;

Б. множественными формами ферментов;

В. конформационно различными формами;

Г. полимерными формами .

–  –  –

7. Скорость ферментативной реакции, измеренная в стандартных для фермента условиях (25 °С, оптимум рН и др.), называется:

А. максимальной скоростью;

Б. начальной скоростью;

В. удельной скоростью;

Г. полумаксимальной скоростью .

8. Приведенный график Лайнуивера-Бэрка соответствует случаю:

А. конкурентного ингибирования;

Б. неконкурентного ингибирования;

В. бесконкурентного ингибирования;

Г. смешенного ингибирования .

–  –  –

10. Автором гипотезы об индуцированном соответствии субстрата и фермента является:

А. Д. Кошланд; Б. Д. Браун; В. Э. Фишер; Г. А. Данилевский .

11. Ферменты, катализирующие реакции синтеза с использованием молекул АТФ, называются:

А. лиазы; Б. лигазы; В. гидролазы; Г. оксидоредуктазы .

12. Удельной активностью фермента называется:

А. активность 1 мг чистого фермента;

Б. активность 1 ммоль чистого фермента;

В. активность 1 каталитического центра;

Г. активность в оптимальных для фермента условиях .

–  –  –

А. конкурентного ингибирования;

Б. неконкурентного ингибирования;

В. бесконкурентного ингибирования;

Г. смешенного ингибирования .

14. Степень сродства фермента к субстрату выражается через:

А. субстратную константу;

Б. константу Михаэлиса;

В. константу диссоциации;

Г. уравнение Михаэлиса-Менте

15. Ферменты увеличивают скорость реакции, т.к.:

А. изменяют свободную энергию реакции;

Б. уменьшают скорость обратной реакции;

В. изменяют состояние равновесия реакции;

Г. уменьшают энергию активации;

Д. избирательно увеличивают скорость прямой реакции, но не увеличивают скорость обратной реакции .

16. В лаборатории выделили фермент лизоцим и определили его активность при различных значениях рН среды. Установили, что ферментативная активность лизоцима максимальна при 5,2 и уменьшается как при снижении, так и при повышении этого значения .

Укажите возможную причину этого явления:

А. изменение конформации молекулы фермента;

Б. утрата комплементарности активного центра и субстрата;

В. изменение ионизации функциональных групп фермента;

Г. гидролиз пептидных связей фермента;

Д. уменьшение свободной энергии реакции .

17. Экспериментально доказано, что активный центр лизоцима содержит аминокислотные остатки глутаминовой и аспарагиновой кислот, необходимых для катализа. Какие группы в составе субстрата функционально важны для фермента?

А. Аминогруппы. Г. Алкильные группы .

Б. Карбоксильные группы. Д. Гидроксильные группы .

В. Тиогруппы .

18. Нормальные клетки способны превращать аспарагиновую кислоту в аспарагин. Некоторые лейкозные клетки лишены этой способности. Добавление аспарагиназы (фермента, расщепляющего аспарагин) в кровь больных лейкозом может привести к гибели раковых клеток. Какой вид специфичности проявляет аспарагиназа?

А. Относительную. Б. Абсолютную. В. Стереоспецифичность .

19. Вам даны 4 пробирки с продуктами ферментативного гидролиза крахмала. Проделав реакцию с реактивом Люголя, получили следующие окраски: 1. синяя, 2. бурая, 3. желтая, 4. фиолетовая. В какой пробирке произошел полный гидролиз крахмала?

А. В 1. Б. Во 2. В. В 3. Г. В 4 .

Напишите какие вещества образовались в этих пробирках?

20. Количество фермента, катализирующее в оптимальных условиях превращение 1 мкмоль субстрата в 1 мин, называется:

А. 1 КАТАЛ; В. удельная активность фермента;

Б. 1 оборот фермента; Г. 1 МЕ .

21. Ферменты, катализирующие реакции негидролитического расщепления субстрата, называются:

А. лиазы; Б. лигазы; В. гидролазы; Г. оксигеназы .

22. Карбоксипептидаза обладают следующим видом специфичности:

А. абсолютной; Б. относительной; В. стереоспецифичностью .

23. -амилаза расщепляет А. пептидные связи; Г. -1,4-гликозидные;

Б. дисульфидные связи; Д. -1,6-гликозидные .

В. гликозамидные;

24. Фермент, гидролизующий лактозу, имеет тривиальное название:

А. лактаза; Б. лактолиаза; В. лактогидротаза; Г. лактомутаза .

25. Какой из нижеперечисленных ферментов не относится к гидролазам?

А. Амилаза. Б. Трипсин. В. Каталаза. Г. Холинэстераза. Д. Пепсин .

26. Укажите возможные функции металлов в ферментативном катализе:

А. участвуют в связывании фермента с субстратом;

Б. способствуют связыванию эффектора с аллостерическим центром;

В. участвуют в связывании фермента с коферментом;

Г. стабилизируют четвертичную структуру фермента .

27. Снижение активности фермента в присутствии конкурентных ингибиторов происходит в результате:

А. взаимодействия ингибитора с функциональными группами аминокислот активного центра;

Б. взаимодействия ингибитора с функциональными группами аминокислот вне активного центра;

В. взаимодействия ингибитора с функциональными группами аминокислот аллостерического центра;

Г. уменьшения количества фермент-субстратного комплекса;

Д. конформационных изменений молекул фермента .

28. Фермент сахараза может катализировать следующие реакции:

Сахароза + Н2О глюкоза + фруктоза;

Раффиноза + Н2О глюкоза + фруктоза + галактоза .

А. Изобразите в виде графиков (в одной системе координат) зависимость скорости реакции, катализируемой сахаразой, от концентрации сахарозы (Km = 0,05 ммоль/л) и раффинозы (Km = 2,0 ммоль/л), если считать Vmax одинаковой (10 ммоль л-1 мин -1) .

Б. Отметьте на графиках Vmax и Km .

В. В каком случае при одинаковой концентрации субстратов (0,1 ммоль/л) скорость ферментативной реакции будет больше? Ответ поясните .

29. На схеме изображен активный центр фермента:

А. Б .

1 - - (СН2)2-СООСН2-ОН <

–  –  –

3 - - СН2 - 3- -СН2 - -ОН

- Назовите аминокислоты, функциональные группы которых входят в активный центр фермента .

- Какие типы связей могут образовываться между аминокислотыми остатками, формирующими активный центр фермента и функциональными группами субстрата?

30. Изобразите в виде графика зависимость скорости реакции от концентрации субстрата. Отметьте на графике Vmax и Km. Дайте определение этим величинам. Используя данные о зависимости скорости реакции (V) от концентрации субстрата (S), представленные в таблице, определите значения Vmax и Km .

–  –  –

31. Подтвердите или опровергните следующие утверждения:

А. специфичность действия сложных ферментов определяется коферментом;

Б. активный центр фермента состоит из субстрат-связывающего и каталитического участков;

В. активность фермента не зависит от концентрации субстрата;

Г. ферменты ускоряют протекание как прямой, так и обратной реакции;

Д. скорость ферментативной реакции увеличивается с увеличением рН среды;

Е. пищеварительные ферменты обладают абсолютной специфичностью действия;

Ж. смесь ферментов можно разделить на отдельные ферменты методом высаливания сульфатом аммония;

З. ферменты могут обладать стереоспецифичностью;

И. константа Михаэлиса выражается в единицах концентрации субстрата;

К. изоферменты катализируют одну и ту же химическую реакцию;

Л. первая цифра в шифре фермента обозначает принадлежность к классу;

М. в основе классификации ферментов лежит тип катализируемой реакции;

Н. лигазы осуществляют расщепление углеводородной цепи по двойным связям;

О. действие конкурентных ингибиторов на ферменты сопровождается изменением константы Михаэлиса;

П. ингибирование ферментов – необратимый процесс;

Р. препараты очищенных ферментов используются в терапевтических целях;

С. за скоростью ферментативной реакции можно наблюдать по изменениям происходящим с коферментом данного фермента .

32. Назовите коферменты, структура которых схематически изображена ниже:

А. изоаллоксазин-рибитол-фосфорный остаток-фосфорный остатокрибоза-аденин;

Б. никатинамид-рибоза-фосфорный остаток-фосфорный остатокрибоза-аденин .

33. Рассчитайте удельную активность ацетилхолинэстеразы, если 5 мг фермента за 30 с расщепляют 200 мкмоль ацетилхолина .

34. Выберите и укажите правильный порядок событий, происходящих в процессе ферментативного катализ:

1. возникает индуцированное соответствие между активным центром фермента и субстрата .

2. субстрат приближается к активному центру фермента .

3. происходит образование продуктов реакции .

4. выход продуктов из активного центра фермента .

5. происходит увеличение прочности связей в субстрате .

6. происходит дестабилизация связей в субстрате .

35. Какие утверждения можно отнести к ферментам, а какие к неорганическим катализаторам? Подберите соответствующие пары .

1. Очень чувствительны к небольшим изменениям рН .

2. Большое количество самых разнообразных химических реакций может протекать с участием одного и того же катализатора .

3. Не расходуются в процессе химической реакции .

4. Как правило, не теряют каталитических свойств при высоких температурах .

5. Обладают способностью к регуляции .

6. Требуется незначительное количество для достижения высокой скорости реакции .

А. Характерно для ферментов .

Б. Характерно для небиологических катализаторов .

В. Характерно для тех и других .

Г. Не характерно ни для одной из групп катализаторов

–  –  –

37. Подберите каждому утверждению (1,2,3,4) соответствующий ответ (А,Б,В,Г):

1. увеличивают энергию активации; 2. в процессе реакции не расходуются; 3. неспецифичны; 4. ингибируются аналогами субстрата .

–  –  –

38. Могут ли реакции, имеющие различную энергию активации, при одинаковой температуре идти с одинаковой скоростью?

39. Температура 37 С, рН 7,5 – оптимальные условия для действия лактатдегидрогеназы (ЛДГ), катализирующей превращение:

СООН СООН

С = О + НАДН + Н+ НАД+ СНОН + СН3 СН3

–  –  –

Объясните причины уменьшения активности фермента при:

- при повышении температуры до 60С

- при хранении фермента в буферном растворе с рН 5,0

- при снижении в клетке соотношения НАД+/НАДН +Н+

40. Перечислите возможные объяснения влияния температуры на скорость ферментативной реакции .

41. Перечислите факторы, обусловливающие уменьшение энергии активации в присутствии ферментов .

42. Как изменяется скорость реакции при уменьшении энергии активации? Какова скорость реакции, когда энергия активации равна нулю?

ГЛАВА 3. ВИТАМИНЫ И КОФЕРМЕНТЫ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА И КЛАССИФИКАЦИЯ ВИТАМИНОВ

Витамины (от лат. Vita - жизнь) – группа органических низкомолекулярных соединений разнообразной химической природы, необходимых для осуществления жизненно важных биохимических и физиологических процессов, синтез которых у организма данного вида отсутствует или ограничен. Витамины являются внутриклеточными антиоксидантами, регулируют обмен кальция, участвуют в акте зрения, регулируют рост и дифференцировку клеток, участвуют в механизме свертывания крови и др .

Витамины обладают высокой биологической активностью и требуются в небольших количествах – от нескольких мкг до десятков мг в день. В организме отдельные представители витаминов выполняют функцию коферментов или являются их предшественниками .

Потребность человека и различных животных в витаминах неодинакова. Некоторые витамины, такие как тиамин, рибофлавин, пантотеновая кислота, пиридоксаль и пиридоксамин и некоторые другие, необходимы как катализаторы химических реакций для каждой живой клетки. Другие витамины нужны не всем животным, так, например, L-аскорбиновая кислота необходима человеку, обезьянам и морской свинке, а остальные животные не нуждаются в ее поступлении из внешней среды, т.к. способны к самостоятельному биосинтезу; поэтому для этих животных аскорбиновая кислота не является витамином .

В природе биосинтез витаминов, как правило, осуществляется растениями и микроорганизмами; многие витамины для самих растений являются биокатализаторами в обмене веществ. Менахиноны и кобаламин синтезируются только микроорганизмами .

Классификация витаминов По мере открытия отдельных витаминов они обозначались буквами латинского алфавита и назывались в зависимости от их биологической роли, например витамин Е – токоферол (по-гречески «токос» – деторождение, «ферро» – несущий), витамин А – аксерофол (ксерофтальмия – заболевание глаз) и т.п. В дальнейшем буквенное обозначение пришлось расширить, так как выделялись новые индивидуальные вещества близкого, аналогичного или нового биологического действия; поэтому к буквам были присоединены цифровые обозначения. Данное обозначение витаминов прочно вошло в нашу жизнь, хотя правильнее называть их, используя рациональные названия, отражающие их химическую природу .

Помимо буквенной классификации, применяется физическая классификация витаминов, разделяющая их на две большие группы по признаку растворимости в воде или жирах: водорастворимые и жирорастворимые. Жирорастворимые витамины - витамин A, витамин D, витамин E, витамин K, витамин F, витамин N (липоевая кислота);

водорастворимые витамины - витамин В1 (тиамин), витамин В2 (рибофлавин), витамин В3 (пантотеновая кислота), витамин В4 (холин), витамин В5 (никотинамид), витамин В6 (пиридоксин), витамин В7 (биотин, витамин Н), витамин В8 (инозит), витамин В9 (фолиевая кислота), витамин В10 (парааминобензойная кислота), витамин В11 (Lкарнитин), витамин В12 (цианкобаламин), витамин В13 (оротовая кислота), витамин В14 (пиррол-хинолин хинон), витамин В15 (пангамовая кислота), витамин С, витамин Р, витамин U .

Такая классификация не отражает химического строения витаминов. Кроме того, она не совсем верна, так как способность витаминов растворяться в воде или жирах может изменяться на противоположную за счет введения в него липофильных или гидрофильных групп, не влияющих на его биологическую активность .

Например, водорастворимая аскорбиновая кислота может быть превращена в жирорастворимое соединение за счет этерификации ее какой-либо высшей жирной кислотой. Гидрофобный витамин А при превращении его в фосфорный эфир становиться гидрофильным .

Существует класификация витаминов, основанная на их принадлежности к опредленному классу органических соединений (смотри таблицу 3.1) .

Таблица 3.1 – Классификация витаминов по химическим свойствам Витамины алифатического ряда L-аскорбиновая кислота Пантотеновая кислота S-Метилметионин-сульфония хлорид (витамин U) Липоевая кислота Липоамид

–  –  –

Можно классифицировать витамины по их способности выполнять коферментую функцию .

В данном пособии мы предлагаем вам познакомиться с витаминами и коферментами на основании следующей класификаци: витамины, имеющие коферментые формы, витамины, для которых коферментые формы не установлены и коферменты, не являющиеся витаминами .

Таблица 3.2 Классификация витаминов и коферментов

–  –  –

ПРОВИТАМИНЫ

Витамины не всегда поступают в организм в готовом, активном виде. В отдельных случаях вместо витаминов организм животных может удовлетворяться получением органических соединений, которые также в нем не синтезируются, однако в процессе обмена веществ способны переходить в витамин. Такие вещества называются провитаминами .

Такими провитаминами являются каротиноиды, они широко распространены в растительном мире. Среди каратиноидов провитаминами являются соединения, содержащие в своей молекуле структурную часть ретинола, в который они переходят в процессах метаболизма .

Другую большую группу представляют стерины, содержащие двойные связи. Эти стерины при облучении кожи ультрафиолетовыми лучами солнечного или искусственного света переходят в кальциферолы (витамины группы D) .

К провитаминам можно отнести никотиновую кислоту, переходящую в никотинамид .

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА И КЛАССИФИКАЦИЯ КОФЕРМЕНТОВ

Коферменты – органические природные соединения, необходимые для осуществления каталитического действия ферментов. Большинство ферментов состоят из белкового компонента (апофермента) и кофермента, имеющего сравнительно небольшую молекулярную массу .

Сами по себе коферменты каталитически неактивны, так же, как и апоферменты без коферментов. Коферменты обладают как минимум двумя функциональными группами или реакционноспособными участками, обуславливающими специфическое связывание с апоферментом с одной стороны и с субстратом – с другой. Эти вещества, как правило, содержат системы сопряженных -связей и (или) гетероатомы. Наличие гетероатомов в молекуле кофермента создает благоприятные условия для регулирования распределения электронной плотности в фермент-субстратных комплексах путем протонирования и депротонирования. Кофермент в ходе химической реакции способствует созданию необходимой электронной плотности на том или ином атоме реагирующей системы. В этом разделе будут рассмотрены коферменты, в состав которых входят как витамины, так и другие другие органические соединения, не относящиеся к витаминым .

Функции коферментов

1. Непосредственное участие в каталитическом процессе. Кофермент может работать как катализатор, который после каждого превращения субстрата регенерируется в исходное соединение. Такими кофакторами являются пиридоксаль-5-фосфат, тиаминдифосфат, ФАД, ФМН, биоцитин и др. Либо кофермент выступает как косубстрат, при этом в процессе реакции он окисляется, а его перевод в исходную форму осуществляет уже другой фермент в сопряженной реакции .

2. Активация и перенос молекулы субстрата от одного фермента к другому. Кофермент взаимодействует с субстратом с образованием довольно прочного промежуточного соединения, которое взаимодействует с активным центром другого фермента, где и происходит окончательно превращение субстрата. Кофермент при этом регенерирует в свою исходную форму .

Классификация коферментов По способам взаимодействия с апоферментом различают растворимые коферменты и простетические группы .

Растворимый кофермент присоединяется к молекуле фермента во время реакции, химически изменяется и затем снова освобождается .

Первоначальная форма растворимого кофермента регенерируется во второй, независимой реакции .

Простетической группой называют кофермент, который прочно связан с апоферментом (обычно ковалентными связями) и во время реакции постоянно находится в активном центре фермента. После освобождения субстрата регенерация простетической группы происходит при взаимодействии с другим коферментом или субстратом .

По химической структуре коферменты подразделяются на три класса:

1. коферменты алифатического ряда (глутатион, липоевая кислота и др.)

2. коферменты гетероциклического ряда (пиридоксальфосфат, тетрагидрофолиевая кислота, нуклеозидфосфаты и их производные (КоА, ФМН, ФАД, НАД и др.), металлопорфириновые гемы и др .

3. коферменты ароматического ряда (убихиноны) .

По функциональному признаку коферменты делятся на две группы:

1. окислительно-восстановительные коферменты

2. коферменты переноса групп .

БИОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ ВИТАМИНОВ И КОФЕМЕНТОВ

Основной специфической функцией водорастворимых витаминов в организме является образование коферментов. Из жирорастворимых витаминов лишь витамины К и А2 осуществляют коферментную функцию, а остальные являются учасниками определенных физиологических процессов. Знание функций витаминов позволяет понять причину возникновения патологий, связанных с нарушением метаболизма веществ. Общим положением является то, что дефицит того или иного витамина приводит к снижению активности соответствующего фермента и, следовательно, к торможению ферментативной реакции .

Отсутствие в организме витамина приводит к развитию болезни, которую называют авитаминозом. Если болезнь возникает вследствие отсутствия нескольких витаминов, е называют полиавитаминозом .

Авитаминоз характеризуется определенной развернутой клинической картиной. Цинга, рахит, бери-бери, пеллагра, злокачественная анемия и др. имеют типичные симптомы .

Авитаминозы в настоящее время встречаются довольно редко .

Чаще организм испытывает относительный недостаток какого-либо витамина; такое заболевание называют гиповитаминозом. К гиповитаминозам относят состояния умеренного дефицита со стртыми неспецифическими проявлениями (потеря аппетита, усталость, раздражительность) и определенными симптомами (кровоточивость десен, гнойничковые заболевания кожи и т.д.) .

Чрезмерное поступление в организм некоторых витаминов может вызвать заболевание, называемое гипервитаминозом. Особенно в этом отношении опасны витамины D и А. Водорастворимые витамины, как правило гипервитаминозы не вызывают, их избыток просто выводится из организма .

Организм является сбалансированной саморегулирующейся системой и отсутствие в нем какого-либо соединения влечет за собой нарушение баланса за счет блокирования отдельных метаболических процессов. Признаки авитаминоза проявляются не сразу, поскольку на начальном этапе дефицита какого-либо витамина происходит компенсация, корректирующая метаболизм. Если дефицит витамина устранен, организм возвращается в нормальное состояние. В том случае, если отсутствие витамина или его нехватка длится долго, развивается авитаминоз, в тяжелых, затяжных случаях приводящий к летальному исходу .

ВИТАМИНЫ, ОБРАЗУЮЩИЕ КОФЕРМЕНТЫЕ ФОРМЫ

Тиамин (витамин В1) Витамин В1, тиамин или 3-[(4-амино-2-метил-5пиримидинил)метил]-5-(2-гидроксиэтил)-4-метилтиазолия хлорид состоит из двух гетероциклических колец – аминопиримидинового и тиазолового, содержащего активную группу витаминиа – карбанион .

–  –  –

Активной формой тиамина является тиаминпирофосфат (ТПФ) .

Тиаминпирофосфат Молекула ТПФ имеет подвижный атом водорода во втором положении тиазольного кольца. Атом углерода, расположенный между атомами азота и серы в тиазольном кольце легко ионизуется с образованием карбаниона. Положительно заряженная форма ТПФ легко взаимодействует с карбонильными соединениями .

ТПФ входит в состав двух сложных ферментных систем – пируват- и -кетоглутаратдегидрогеназных комплексов, катализирующих окислительное декарбоксилирование пировиноградной и -кетоглутаровой кислот. Окислительное декарбоксилирование ПВК происходит в матриксе митохондрий и является одной из ключевых реакций в обмене углеводов. ТПФ принимает участие в первой стадии этого процесса в составе пируватдегидрогеназы. Продукты реакции либо высвобождаются в виде альдегидов, либо переносятся на липоамидные остатки, как показано на рисунке 5.1 .

Ацетил-КоА, образующийся в результате работы пируватдегидрогеназного комплекса, частично используется как субстрат для ацетилирования холина. При недостаточном поступлении тиамина пировиноградная и молочная кислоты накапливаются в тканях, нарушается синтез ацетилхолина, вследствие чего ухудшаются функции ряда систем, в первую очередь, нервной, сердечнососудистой и пищеварительной .

ТПФ является коферментом транскетолазы пентозофосфатного пути окисления углеводов, где участвует в переносе гликоальдегидного радикала от кетосахаров на альдосахара .

Рисунок 5.1 Взаимодействие ТПФ с 2-кетокислотами и перенос ацильной группы на липоамид Помимо участия в ферментативных реакциях, тиамин может выполнять и некоферментные функции .

Полагают, что он участвует в кроветворении, на это указывает наличие врожденных тиаминзависимых анемий, поддающихся лечению высокими дозами этого витамина .

Известна его роль в стероидогенезе .

Для перевода тиамина в активную форму необходим магний .

Недостаточность Гиповитаминоз, вызванный тиамином сопровождается снижением аппетита и тошнотой. Отмечаются неврологические расстройства, к которым относятся нарушение периферической чувствительности, ощущение «ползания мурашек», невралгии. Характерна забывчивость, особенно на недавние события. Отмечается слабость сердечной мышцы, проявляющаяся тахикардией даже при незначительных нагрузках .

Тиаминовая недостаточность сопровождается нарушением структуры и функций митохондрий .

Болезнь бери-бери возникает при значительном дефиците тиамина и характеризуется крайне тяжелым течением.

Болезнь имеет две формы:

сухую (нервно-паралитическую) и отечную (сердечную). Причем в обоих случаях поражаются и сердечно сосудистая и нервная системы, но в разной степени .

В настоящее время гораздо чаще встречается синдром ВерникеКорсакова. Недостаточность тиамина в этом случае вызывается комбинацией ряда различных факторов, таких как неправильное питание (в частности при замене пищи алкоголем), сниженная усвояемость и повышенная потребность. Хотя синдром Вернике-Корсакова связан преимущественно с алкоголизмом, он также иногда наблюдается у людей, которые постятся, или которые страдают хронической тошнотой .

Симптомы варьируют от слабого расстройства и депрессии до психозов и комы. Если лечение не начать вовремя, может наступить необратимое повреждение памяти .

Гипервитаминоз не описан. Избыток принятого витамина быстро выводится с мочой .

Основные природные источники Болше всего тиамина содержится в сушеных пивных дрожжах .

Другими источниками тиамина являются мясо (свинина, баранина, говядина), птица, цельные зерновые злаки, орехи, бобовые растения, сушеные бобы и животная пища. В процессе перемола пшеницы в белую муку или при полировки коричневого риса с образованием белого риса зерна злаковых теряют тиамин, содержащийся в отрубях .

Суточная потребность Рекомендуемая доза для взрослых составляет 1,0-1,1 мг для женщин и 1,2-1,5 мг для мужчин .

Взаимодействие Вещества, содержащиеся в таких продуктах как кофе, чай, свежая рыба и некоторых злаковых культурх, действуют как антагонисты данного витамина. Не рекомендуется одновременное парентеральное введение витамина B1 с пиридоксином (витамином B6) и цианокобаламином (витамином В12), а также с пенициллином, стрептомицином или никотиновой кислотой. Сульфаниламиды и спиртосодержащие препараты нарушают нормальное всасывание витамина B1. Антагонистом тиамина является холин. Антибиотики, серосодержащие лекарства, оральные контрацептивы, антацидные средства могут приводить к снижению уровеня тиамина в организме .

Рибофлавин (витамин В2) Витамин В2, рибофлавин или 6,7-диметил-9Dрибитилизоаллоксазин. В основе молекулы рибофлавина лежит гетероциклическое соединение изоаллоксазин (сочетание бензольного, пиразинового и пиримидинового колец), к которому в положении 9 присоединен пятиатомный спирт рибитол .

Основное участие рибофлавина в обмене веществ состоит в том, что они входит в состав коферментов флавинмононуклеотида (ФМН) и флавинидениндинуклеотида (ФАД). Обычно оба соединения ковалентно связаны с ферментами. Активной группой обоих коферментов является флавин (изоаллоксазин), имеющий сопряженную систему из трех колец, которая может при восстановлении принимать два электрона и два протона. В ФМН к флавину присоединен фосфорилированный полиол рибит. ФАД состоит из ФМН, связанного с аденозинмонофосфатом (АМФ) .

ФМН синтезируется в организме животных из свободного рибофлавина и АТФ при участии специфического фермента рибофлавинкиназы. Из синтезированного ФМН в дальнейшем при участии специфического АТФ-зависимого фермента ФМНаденилилтрансферазы синтезируется ФАД .

Флавопротеины, содержащие ФМН и ФАД в качестве коферментов, катализируют два типа химических реакций. Первый тип – реакции, в которых фермент осуществляет прямое окисление с участием кислорода (дегидрирование – отщепление электронов и протонов) исходного субстрата или промежуточного метаболита. К ферментам этой группы относятся оксидазы L- и D-аминокислот, глициноксидаза, альдегидоксидаза, ксантиноксидаза и др. Второй тип – реакции переноса электронов и протонов не от исходного субстрата, а от восстановленных пиридиновых коферментов. Ферменты этой группы играют главную роль в биологическом окислении .

ФМН входит в состав I-го дыхательного комплекса, а ФАД – в состав II-го. ФАД является коферментом пируват- и оксоглутаратдегидрогеназных комплексов (наряду с ТПФ и другими коферментами ФАД осуществляет окислительное декарбоксилирование соответствующих кетокислот). Как кофермент ФАД входит также в состав ацил-КоА-дегидрогеназы и участвует в реакциях окисления жирных кислот в митохондриях .

Рибофлавиновые коферменты играют важную роль в превращениях пиридоксина (витамина В6) и фолиевой кислоты в активные коферментные формы, и превращениях триптофана в никотиновую кислоту .

Недостаточность К специфическим проявлениям недостаточности рибофлавина относятся воспалительные процессы в слизистых оболочках. Слизистая губ и полости рта становится сухой, язык приобретает ярко-красный цвет, в углу рта появляются трещины. Отмечается повышенное шелушение эпителия кожи, особенно на лице. Конъюнктива глаза теряет блеск из-за сухости, вызываемой закупоркой слезного канала слущивающимся эпителием. Роговица прорастает сосудами (компенсаторная реакция на недостаточность дыхательной функции роговицы) и затем мутнеет. Отмечается катаракта (помутнение хрусталика) .

Недостаточность рибофлавина рассматривается как тератогенная, поскольку беременные крысы, получающие недостаточное количество рибофлавина рожали детенышей с многочисленными аномалиями .

Гипервитаминоз не описан. При введении больших доз витамина В2 избыточного накопления флавинов в тканях не происходит, так как рибофлавин быстро выделяется с мочой .

Основные природные источники Рибофлавин является одним из наиболее широко распространенных витаминов. Рибофлавин содержится во всех клетках животных и растений, но лишь немногие продукты являются богатыми источниками данного витамина. Наибольшая концентрация рибофлавина обнаруживается в дрожжах и печени, но наиболее распространенными диетическими источниками рибофлавина являются молоко и молочные продукты, мясо, яйца, овощи и зелень. Рибофлавин из животных продуктов усваивается лучше, чем из растительных источников. В коровьем, овечьем и козьем молоке не менее 90% рибофлавина находится в свободной форме, в большинстве других источников он обнаруживается связанным с белками .

Суточная потребность В настоящее время рекомендуемая доза составляет 1,2-1,3 мг для женщин и 1,4-1,8 мг для мужчин .

Взаимодействие Некоторые медицинские препараты, такие как уабаин (препарат, применяемый при лечении застойной сердечной недостаточности), теофилин (релаксант гладкой мускулатуры, диуретический стимулятор и стимулятор центральной нервной системы), пенициллин и борная кислота замещают рибофлавин при связывания с белком и, тем самым, нарушают его транспорт к центральной нервной системе. Пробенецид (средство от подагры) ингибирует желудочно-кишечное всасывание рибофлавина и его секрецию в почечных канальцах. Негативное влияние на всасывание или метаболизм рибофлавина оказывают фенотиазины (сильные транквилизаторы), барбитураты, стрептомицин и пероральные контрацептивы. Хлоропромазин (антипсихотическое средство) является структурным аналогом рибофлавина и препятствует образованию ФАД .

Антагонист рибофлавина галоктофлавин используется для создания экспериментальной модели рибофлавиновой недостаточности .

Тироксин и трийодтироксин стимулируют синтез ФМН и ФАД у млекопитающих. Антихолинергические препараты усиливают связывание рибофлавина, обеспечивая более длительное нахождение его в участке связывания .

Пантотеновая кислота (витамин В3) Витамин В3 или пантотеновая кислота состоит из остатков 2,4диокси-3,3-диметилмаслянной кислоты и -аланина .

–  –  –

Пантотеновая кислота является незаменимым компонентом кофермента А и ацилпереносящего белка, играющих ключевую роль в метаболизме углеводов, белков и жиров. Она вовлечена в реакции, обеспечивающие клетку энергией, принимает участие в синтезе стеролов (например, холестерола), ряда гормонов (роста, стресса и половых), нейротрансмиттеров (ацетилхолина), фосфолипидов, порфирина (компонента гемсодержащих белков), антител, а также принимает участие в метаболизме лекарств (например, сульфаниламидов) .

Кофермент А является водорастворимым коферментом ацилтрансфераз – ферментов, катализирующих реакции переноса ацильных групп. Сокращенно его обозначают как КоА (СоА). В организме КоА образуется из пантотеновой кислоты (витамин В3), цистеамина и АТФ. С химической точки зрения КоА представляет собой эфир пантетеина по -гидроксильной группе пантоевой кислоты и 3фосфоаденозин-5-дифосфата по 5-дифосфатной группе .

Пантетеин состоит из трех компонентов, связанных амидными связями: пантоевой кислоты, -аланина и цистеамина. Пантотеновая кислота, образованная из пантоевой кислоты и -аланина, в организме человека играет роль витамина В3.

Кофермент А является акцептором ацильных групп в реакциях окислительного декарбоксилирования кетокислот, в ходе которых образуются 6-S-ацилдигидролипоамиды:

Тиоэфиры, какими являются ацил-КоА, представляют собой активированные формы карбоновых кислот. Ацильный остаток ацилКоА легко переносится на другие молекулы.

Например, при взаимодействии ацил-КоА с 3-глицерофосфатом образуются фосфатидные кислоты:

Производное витамина В3 S-сульфопантетеин является необходимым компонентом для роста бифидобактерий .

Недостаточность Недостаточность пантотеновой кислоты практически не встречается, так как она синтезируется микрофлорой кишечника. При назначении добровольцам антивитамина проявления недостаточности пантотеновой кислоты характеризовались психоэмоциональной неустойчивостью, склонностью к обморокам, изменением походки, парастезиями, чувством жжения стоп. Вторичная недостаточность витамина развивается при многих хронических заболеваниях, длительном применении диуретиков и алкоголизме .

Гипервитаминоз не описан .

Основные природные источники Пантотеновая кислота широко представлена в продуктах питания. Е особенно много в дрожжах, печени, почках, сердце, мозге, в таких продуктах как яйца, молоко, овощи, бобовые и цельные зерновые продукты .

Суточная потребность Суточная потребность – 10– 15 мг .

Взаимодействие Адекватные количества пантотеновой кислоты необходимы для нормального поглощения и метаболизма фолиевой кислоты .

Другие применения Пантенол часто используется в качестве косметического продукта .

В составе средств по уходу за кожей пантенол способствует поддержанию кожи увлажненной и способствует ее питанию, а также стимулирует рост клеток и восстановление ткани, кроме того он устраняет воспалительные процессы и покраснение кожи. Как увлажнитель и кондиционер в продуктах ухода за волосами, он защищает их и способствует восстановлению повреждений, вызываемых химическими или механическими воздействиями и способствует блеску волос .

Никотиновая кислота (витамин РР, витамин В5, ниацин) Витамин В5 (витамин РР или никотиновая кислота) является пиридин-3-карбоновой кислотой. Практически весь витамин В5, имеющийся в организме, представлен никотинамидом и функционирует в составе коферментов – НАД+ и НАДФ+ .

–  –  –

Значение витамина определяется чрезвычайно многогранной ролью этих коферментов: НАД+ является коферментом дегидрогеназ, катализирующих реакции окисления глюкозы, жирных кислот, глицерина, аминокислот, является коферментом дегидрогеназ цикла Кребса (исключая сукцинатдегидрогеназу). НАДФ+ – донор водорода в реакциях синтеза жирных кислот, холестерина, стероидных гормонов и некоторых других соединений, а также компонент монооксигеназной цепи микросомального окисления, выполняет функцию детоксикации антибиотиков и других чужеродных веществ .

Никотиновые коферменты переносят гидрид-ион (:Н) и действуют всегда в растворимой форме. Активной группой этих коферментов является никотинамид. НАД+ передает восстановительный эквивалент из катаболического пути в дыхательную цепь и тем самым участвует в энергетическом обмене. HАДФН(Н+), напротив, является самым важным восстановителем при биосинтезе .

НАД+ и НАДФ+ являются аллостерическими регуляторами ферментов энергетического обмена, в частности, ферментов цикла Кребса, а также реакций глюконеогенеза .

Недостаточность При нехватке в рационе витамина В5, а также триптофана, развивается такое заболевание как пеллагра. К симптомам пеллагры относятся дерматоз, деменция, диарея и нервные расстройства. Очаги дерматозных раздражений наиболее часто возникают в таких местах как запястья, локти и шея. В верхней части пищеварительного тракта наблюдаются глоссит и стоматит. На ранней стадии пеллагры могут иметь место тошнота и рвота .

Основные природные источники Никотинамид и никотиновая кислота широко распространены в природе. В растениях чаще содержится никотиновая кислота, в то время как в животных организмах чаще содержится никотинамид .

Дрожжи, печень, мясо птицы, орехи и бобовые растения - основной источник ниацина среди пищевых продуктов. В меньшем количестве они содержатся в молоке и листьях овощей. Никотиновая кислота может синтезироваться в организме человека из триптофана .

Суточная потребность Суточная потребность в витамине составляет 20—25 мг .

Взаимодействие Дефицит меди в организме может тормозить процесс преобразования триптофана в ниацин. Лекарственный препарат "пеницилламин" также вызывает торможение преобразования триптофана в ниацин в биохимических процессах у человека, возможно, благодаря, в какой-то части, хелатирующему действию меди, входящей в состав пеницилламина .

Лекарственные препараты "рифампин" и "изониазид" (противотуберкулзные) тормозят усвоение ниацина .

Пиридоксин (витамин В6) Витамином В6 фактически являютя три соединения – производные 3-оксипиридина, обладающие одинаковой витаминной активностью: пиридоксин (пиридоксол), пиридоксаль и пиридоксамин:

Эти соединения отличаются друг от друга природой замещающей группы в положении 4 пиридинового ядра .

Основная метаболическая функция пиридоксина – коферментная .

Витамин В6 характеризуется исключительно широким спектром биологического действия. Он принимает участие в регуляции белкового, углеводного и липидного обмена, биосинтезе гема и биогенных аминов, гормонов щитовидной железы и других биологически активных соединений .

Коферментные функции выполняют только фосфорилированные производные пиридоксаля и пиридоксамина:

Пиридоксальфосфат Пиридоксаминофосфат

Фосфорилирование пиридоксаля и пиридоксамина катализируют специфические киназы. Синтез пиридоксальфосфата, например, катализирует пиридоксалькиназа, которая наиболее активна в ткани мозга. В реакциях трансаминирования и декарбоксилирования аминокислот происходит взаимопревращение пиридоксальфосфата и пиридоксаминфосфата .

Пиридоксальфосфат – наиболее важный кофермент в метаболизме аминокислот в реакциях переаминирования, катализируемых аминотрансферазами. При переаминировании аминогруппа аминокислоты переносится на 2-кетокислоту. Из аминокислоты при этом образуется 2-кетокислота, а из первоначальной кетокислоты аминокислота. Переносимая NH2-группа временно присоединяется к связанному с ферментом пиридоксальфосфату, который вследствие этого переходит в пиридоксаминофосфат .

I – шиффово основание 1, II – шиффово основание 2, III – оксокислота, IV – пиридоксальфосфат .

В отсутствие субстратов альдегидная группа пиридоксальфосфата ковалентно связана с остатком лизина трансаминазы. Этот тип соединения, найденный также в родопсинах, относится к альдиминам или шиффовым основаниям, во время реакции аминокислота вытесняет остаток лизина и образуется новый альдимин. Затем за счет изомеризации происходит перемещение двойной связи. Полученный кетимин гидролизуется до 2-кетокислоты и пиридоксаминфосфата. Во второй части реакции те же стадии протекают в противоположном направлении: пиридоксаминфосфат и вторая 2-кетокислота образуют кетимин, который иэомеризуется в альдимин. Наконец, отщепляется вторая аминокислота и регенерируется кофермент .

Пиридоксальфосфат принимает участие и в других реакциях аминокислот, таких, как декарбоксилирование и дегидратирование .

Помимо каталитического действия, пиридоксальфосфат участвует в процессе активного транспорта некоторых аминокислот через клеточные мембраны, ему присуща функция регулятора конформационного состояния гликогенфосфорилазы – главного регулируемого фермента, осуществляющего распад гликогена .

Недостаточность При недостатке пиридоксина в рационе питания может возникнуть гипохромическая анемия (аномальное снижение содержания гемоглобина в эритроцитах) и потеря способности превращать триптофан в никотиновую кислоту. Нехватка витамина вызывает также очаговое выпадение волос, потерю аппетита, тошноту, растрескивание в углах рта, болезненность языка, язвы во рту, конъюнктивит, депрессию, нервозность, раздражительность, головокружение, онемение, чувство покалывания или ощущение ударов током, сонливость, утомляемость, слабость, плохое заживление ран, общие боли, нарастающая заторможенность .

Основные природные источники В пищевых продуктах витамин В6 обычно связан с белками .

Пиридоксол обнаруживается главным образом в растениях, а пиридоксаль и пиридоксамин главным образом обнаруживаются в животных тканях. Превосходными источниками пиридоксина являются цыплята, коровья печень, свинина и телятина. Хорошими источниками пиридоксина также являются ветчина и рыба (тунец, форель, палтус, сельдь, лосось), орехи (арахис, грецкий орех), хлеб, крупа и цельные зерна злаковых .

Суточная потребность В сутки человек должен получать 2-2,2 мг пиридоксина .

Взаимодействие Прием алкоголя увеличивает потребность в дополнительном поступлении витамина В6, поскольку алкоголь увеличивает скорость разрушения пиридоксальфосфата, уменьшая запасы этого необходимого кофермента в организме. Изониазид, препарат, используемый при лечении туберкулеза, связывает витамин и инактивирует его .

Пеницилламин, препарат, известный под коммерческим наименованием купрамина и используемый при лечении ревматоидного артрита, также связывает и инактивирует этот витамин .

Препараты для лечения болезни Паркинсона могут быть инактивированы витамином В6, и поэтому, повышенные дозы витамина могут снизить эффективность лекарств. Курение также снижает уровень витамина В6 в организме .

Некоторые витамины группы В (ниацин, рибофлавин, биотин) могут являться синергистами пиридоксина. Ниацин и рибофлавин требуются для взаимопревращений различных форм витамина В6 .

Биотин (витамин В7, витамин Н) Биотин (5-[(3aS,4S,6aR)-2-оксогексагидро-1H-триено[3,4d]имидазол-4-ил]валерьяновая кислота) состоит из тетрагидроимидазольного и тетрагидротиофенового кольца, в тетрагидротиофеновом кольце один из атомов водорода замещен на валериановую кислоту .

–  –  –

Биотин образует кофермент биотин-N-карбоксилат, реагируя с гидрокарбонатом (НСО3-) в присутствии АТФ .

Биотин-N-карбоксилат содержит активированную форму диоксида углерода, которая может быть перенесена на другую молекулу – реакции карбоксилирования, сопряженные с распадом АТФ. Второй тип реакций

– реакции транскарбоксилирования (протекающие без участия АТФ), при которых субстраты обмениваются карбоксильной группой .

Примерами биотинзависимых реакций являются образование оксалоацетата из пирувата и синтез малонилКоА из ацетил-КоА.:

С помощью первой реакции осуществляется непрерывное пополнение щавелевоуксусной кислоты, необходимой для работы цикла Кребса. Вторая реакция – важнейший этап в биосинтезе жирных кислот .

Третья реакция обеспечивает утилизацию пропионовой кислоты, образующейся при -окислении жирных кислот с разветвленным углеродным скелетом или нечетным числом атомов углерода. Эти реакции протекают при участии следующих биотин-зависимых ферментов: пируваткарбоксилазы, катализирующей АТФ-зависимое образование оксалацетата из пирувата и НСО3-; ацетил-Ко Акарбоксилазы – первого фермента в реакциях биосинтеза жирных кислот; пропионил-КоА-карбоксилазы, участвующей в окислении жирных кислот с нечетным числом углеродных атомов; метилкротоноил-КоА-карбоксилазы ключевого фермента окислительного распада лейцина. Всего обнаружено девять ферментативных систем в организме, для работы которых необходим биотин. В ферментах биотин присоединяется амидной связью к -аминогруппе лизина .

Витамин обладает инсулиноподобной активностью – снижает уровень глюкозы в крови, и является важным источником серы, необходимой для роста волос, ногтей, кожи .

Для превращения биотина в активную форму необходим магний .

Недостаточность У человека дефицит биотина встречается крайне редко. В основном это относится к новорожденным, у которых микрофлора кишечника еще не сформирована, а также к взрослым после длительного курса антибиотикотерапии, когда микрофлора кишечника существенно подавлена .

При недостатке биотина наблюдаются поражения кожи, бледный гладкий язык, сонливость, депрессия, болезненность и слабость мышц, гипотония, высокий уровень холестерина и сахара в крови, анемия, потеря аппетита и тошнота, ухудшение состояния волос, замедляется рост .

Основные природные источники В малых количествах биотин обнаруживается в большинстве пищевых продуктов. Наиболее богатыми его источниками являются дрожжи, печень и почки. Также много его содержится в яичном желтке, соевых бобах, орехах и крупах. Биотин синтезируется микрофлорой кишечника человека .

Суточная потребность Суточная потребность составляет около 150-200 мкг .

Взаимодействие Авидин, содержащийся в белке сырого яйца, связывается с биотином и препятствует его всасыванию в кровь. Алкоголь ослабляет способность к усвоению биотина, и поэтому хроническое злоупотребление алкоголем может привести к дефициту биотина .

Фолиевая кислота (витамин В9) Витамин В9 - это группа родственных соединений, называетмых фолацинами. Они содержат гетероциклф птеридина, остаток раминробензойной кислоты и 1-7 остатков глутаминовой кислоты .

Фолиевая кислота поддерживает иммунную систему, способствуя нормальному образованию белых кровяных телец. Регулирует формирование нервных клеток эмбриона, что крайне важно для нормального развития. Ежедневный прием фолиевой кислоты на ранних сроках беременности может предупредить в 75% случаев такие дефекты нервного ствола плода, как аненцефалия и расщепление позвоночника .

Кроме того, фолиевая кислота предотвращает преждевременные роды, рождение недоношенных детей и преждевременный прорыв околоплодной оболочки .

Активной формой фолата в организме является тетрагидрофолиевая кислота (ТГФК). ТГФ образуется из фолиевой кислоты в результате двойного гидрирования птеринового кольца. ТГФ является коферментом, который может переносить С1-остатки в различных степенях окисления. С1-фрагменты присоединяются к атомам N5, N10 или к обоим атомам азота в виде мостика. Наиболее важными производными тетрагидрофолата, переносящими С1-фрагменты, являются 10N-формил-ТГФ, 5N,10N-метилен-ТГФ и 5N-метил-ТГФ .

Формильное производное ТГФ используется в качестве донора формильных групп, в первую очередь в биосинтезе пуриновых нуклеотидов. Метиленовое производное ТГФ является исходным для образования формильного и метильного производных ТГФ. Метильное производное ТГФ осуществляет метилирование главным образом по сульфгидрильным группам метаболитов .

Ниже приведены структурные фрагменты С1-производных ТГФ (R

– заместитель, структура которого одинакова в ТГФ и фолиевой кислоте:

Переносимый ТГФ C1-фрагмент играет важную роль, например, в синтезе пуриновых нуклеотидов, дезокситимидинмонофосфата и метионина .

Недостаточность Ранние симптомы дефицита по фолату неспецифичны и могут проявляться в виде утомляемости, раздражительности и потере аппетита .

Тяжелый дефицит по фолатам всегда приводит в течение короткого промежутка времени к мегалобластической анемии, заболеванию, при котором костный мозг производит гигантские незрелые эритроциты .

При недостаточности фолатов отмечаются слабость, головная боль, обмороки, бледность кожи, красный саднящий язык, диарея. Больные раздражительны, враждебны, у них плохая память, паранойя .

Основные природные источники Фолаты широко представлены в разнообразных пищевых продуктах .

Наиболее богатым источником являются печень, темно-зеленые листовые овощи, бобы, пшеничные проростки и дрожжи .

Суточная потребность Потребность в фолатах составляет 180 мкг для женщин и 200 мкг для мужчин .

Взаимодействие Ряд химиотерапевтических агентов (например, метотрексат, триметоприм, пириметамин) ингибируют фермент дигидрофолат редуктазу, которая необходима для метаболизма фолатов .

Многие лекарства могут влиять на абсорбцию, утилизацию и сохранность фолатов. Среди этих лекарств находятся пероральные контрацептивы, алкоголь, холестирамин (лекарство, применяемое для понижения уровня холестерина в крови), такие антиэпилептические агенты как барбитураты и дифенилгидантоин, а также сульфазалазин, который является одним из сульфонамидов, используемых для лечения неспецифического язвенного колита. Кроме того, лекарства, снижающие кислотность в кишечнике, такие как антациды и современные противоязвенные лекарства, как было показано, влияют на абсорбцию фолиевой кислоты .

Кобаламин (Витамин В12) Витамин B12 имеет самую сложную по сравнению с другими витаминами структурную формулу. Основу структуры молекулы витамина представляет собой корриновое кольцо. Коррин во многом аналогичен порфирину (составная часть гема, хлорофилла и цитохромов), но отличается от порфирина тем, что два пиррольных цикла в составе коррина соединены между собой непосредственно, а не метииновыми мостиком. В центре корриновой структуры располагается ион кобальта. Четыре координационных связи кобальт образует с атомами азота. Ещ одна координационная связь соединяет кобальт с диметилбензимидазольным нуклеотидом. Последняя, шестая координационная связь кобальта остатся свободной: именно по этой связи и присоединяется цианогруппа, гидроксильная группа, метильный или 5'-дезоксиаденозильный остаток с образованием четырх вариантов витамина B12: цианокобаламин, гидроксикобаламин и две коферментные формы витамина B12 – метилкобаламин и 5дезоксиаденозилкобаламин .

R=CH3 – Метилкобаламин R=CN – Цианокобаламин

В организме человека только два фермента используют витамин в качестве кофермента. Метилмалонил-КоА-мутаза – фермент, использующий в качестве кофактора аденозилкобаламин. Этот фермент осуществляет реакции переноса атомов, при которых атом водорода переносится непосредственно с одной группы на другую, при этом замещение происходит по алкильной группе, спиртовому атому кислорода или аминогруппе. В результате реакции из L-метилмалонилКоА получается сукцинил-КоА. Эта реакция является важным звеном в цепи реакций биологического окисления белков и жиров .

Второй фермент – 5-метилтетрагидрофолатгомоцистеинметилтрансфераза (метионинсинтетаза), из группы метилтрансфераз, использующий в качестве кофактора метилкобаламин. Этот фермент катализирует реакции переноса метильной группы (-CH3) между двумя молекулами. В частности, катализирует превращение аминокислоты гомоцистеина в аминокислоту метионин .

При уменьшении содержания в диете витамина В12 синтез метионина метионинсинтазой снижается, это приводит к накоплению 5метил-ТГФК, т. е. исчерпывается пул кофермента ТГФК. Таким образом, даже при условии вполне достаточного общего уровня фолатов создается их функциональный дефицит – уменьшается содержание формил- и метиленпроизводных ТГФК. Как раз эти производные, а точнее, приносимые ими одноуглеродные радикалы, необходимы для синтеза предшественников нуклеиновых кислот. Этот феномен получил название секвестрация пула ТГФК. Данный пример описывает тесную взаимосвязь между двумя витаминами – фолиевой кислотой и кобаламином. Этим и обусловлена схожесть симптомов заболевания при дефиците какого-либо из них .

Недостаточность Недостаточность кобаламинов возникает вследствие низкого содержания их в пище при вегетарианской диете и тем более — при голодании. Отсутствие витамина В12 приводит к мегобластической анемии. Симптомы недостаточности кобаламинов выражаются в слабости, утомляемости, возникновении одышки при физических усилиях, покалывании и онемении в конечностях (парестезии), воспалении языка (глоссите), потере аппетита и веса, потере чувства обоняния и вкуса .

Основные природные источники Синтез кобаламинов в природе осуществляется исключительно микроорганизмами. Животные и растительные клетки такой способностью не обладают. Основные пищевые источники витамина — печень, мясо (в нем витамина в 20 раз меньше, чем в печени), морские продукты Суточная потребность Суточная потребность — 3 мкг .

Взаимодействие Всасывание кобаламинов затрудняет алкоголь, недостаток витамина В6 (пиридоксина), холестерамин, парааминоуксусная кислота .

Витамин С в больших количествах может повлиять на способность адсорбировать витамин В12 из пищи .

Оротовая кислота (витамин В13) Оротовая кислота (1,2,3,6-тетрагидро-2,6-диоксо-4пиримидинкарбоксиловая кислота) .

Оротовая кислота Оротовая кислота содержиться в грудном молоке. Особенно ее много (больше в 4–5 раз) в молозиве, которое выделяется у роженицы в первые 3–5 дней после родов. В молозиве она составляет основную массу (до 90% сывороточных белков), и само ее название происходит от греч. ors — молозиво. У взрослого человека оротовая кислота частично синтезируется в организме и является непосредственным предшественником синтеза нуклеиновых кислот, в частности, на стадии образования пиримидиновых оснований — главных составляющих дезоксирибонуклеиновой и рибонуклеиновой кислот .

Оротовая кислота обладает мощной метаболической активностью .

Основная роль оротовой кислоты — участие в биосинтезе пиримидиновых нуклеотидов уридинмонофосфата и цитидинмонофосфата, что обеспечивает стимуляцию синтеза белка .

Биосинтез оротовой кислоты в естественных условиях осуществляется из аспарагиновой кислоты. Особенно активно метаболические процессы с ее участием протекают в нервной системе и сердечной мышце, где ее эффекты характеризуются одновременным повышением синтеза как белка, так и связанной с ним АТФ .

Участие оротовой кислоты в метаболизме углеводов заключается во влиянии преимущественно на обмен галактозы. Витамин В13 принимает участие в синтезе метионина, важной аминокислоты для детоксикационной функции печени, синтезе катехоламинов и нейромедиаторов. Стимулируя обмен белка в организме, она способна нормализовать функцию печени, ускорить восстановление ее клеток после отравлений, в период приема больших количеств лекарственных средств из разных групп, особенно химиотерапевтических, являющихся мощными ингибиторами синтеза белкового обмена и оказывающих цитолитическое действие .

Кроме белкового и углеводного обмена оротовая кислота принимает участие в регуляции липидного обмена за счет того, что она способствует удержанию основного виновника атеросклероза – холестерола в коллоидном состоянии, что препятствует его отложению в сосудистой стенке и образованию склеротических бляшек .

Оротовая кислота участвует в превращениях фолиевой и пантотеновой кислот, в метаболизме цианокобаламина (витамин В12) .

Недостаточность Случаев недостаточности не описано, так как витамин B13 синтезируется организмом в достаточном количестве .

Основные природные источники Оротовая кислота содержится в дрожжах, печени, молочных продуктах .

Суточная потребность Суточная потребность в витамине B13 составляет 300 мг .

Взаимодействие Оротовая кислота назначается с целью улучшения переносимости лекарственных препаратов: антибиотиков, сульфаниламидов, резохина, делагила, стероидных гормонов .

Аскорбиновая кислота (витамин С) Аскорбиновая кислота (гамма-лактон 2,3-дегидро-L-гулоновой кислоты) представляет собой лактон кислоты со структурой, близкой структуре L-глюкозы .

Аскорбиновая кислота Аскорбиноая кислота занимает доминирующее положение во вне- и внутриклеточной антиоксидантной защите.

Таое действие аскорбиновой кислоты объясняется ее способность образовывать обратимую редокс систему:

Биохимические свойства аскорбиновой кислоты связаны с ее способностью вступать в окислительно-восстановительные реакции. Она принимает участие в переносе атомов водорода и электронов. При окислении (дегидрировании) аскорбиновой кислота сначала образуется свободный радикал, а затем дегидроаскорбиновая кислота, которая, в свою очередь, преобразуется в 2,3-дикетогулоновую кислоту. Первые реакции являются обратимыми, а образование 2,3-дикетогулоновой кислоты – необратимая реакция .

Важной функцией аскорбата является восстановление свободного радикала токоферола (витамина Е), благодаря чему предупреждается окислительная деструкция этого главного антиоксиданта клеточных мембран. Как антиоксидант аскорбиновая кислота необходима для образования активных форм фолиевой кислоты, защиты железа гемоглобина и оксигемоглобина от окисления, поддержания железа цитохромов Р450 в восстановленном состоянии .

Витамин С участвует в процессах всасывании железа из кишечника и освобождении его от связи с транспортным белком крови — трансферрином при поступлении в ткани. Он способен включаться в работу дыхательной цепи митохондрий, являясь донором электронов для цитохрома с .

Витамин С активно участвует в обезвреживании токсинов, антибиотиков и других чужеродных для организма соединений, осуществляемых оксигеназной системой цитохромов Р450. В составе оксигеназной системы микросом витамин С играет роль прооксиданта, т .

е., как и в реакциях гидроксилирования, обеспечивает образование Fe2+ свободных радикалов кислорода (так называемое аскорбатзависимое ПОЛ). Взаимодействие аскорбата с ионами железа или меди в присутствии пероксида водорода вызывает мощный прооксидантный эффект, поскольку при этом образуется гидроксильный радикал (ОН ), инициирующий реакции ПОЛ .

Аскорбиновая кислота является кофактором целого ряда реакций гидроксилирования:

гидроксилирование дофамина в норадреналин, гидроксилирование парагидроксифенилпирувата в гомогентизиновую кислоту;

гидроксилирование триптамина в 5-окситриптамин;

гидроксилирование пролина в гидроксипролин и лизина в гидроксилизин в коллагеновых белках (является кофактором пролилгидроксилазы);

гидроксилирование -бутиробетаина в карнитин;

гидроксилирование кортикостероидов .

Недостаточность Ранними симптомами начинающейся недостаточности витамина С является ощущение усталости, снижение аппетита, подверженность простудным заболеваниям. Характерно легкое появление синяков (кровоизлияний) на коже. Кровоточивость десен — уже достаточно позднее проявление гиповитаминоза С. Глубокий дефицит витамина С приводит к заболеванию цингой. Главным симптомом цинги является нарушение проницаемости капилляров, обусловленное недостаточностью гидроксилирования пролина и лизина в коллагене, и нарушение синтеза хондроинтинсульфатов. Отсюда и такие клинические проявления гиповитаминоза как кровоточивость десен, расшатывание зубов, отеки и боли в суставах, поражение костей, бледность кожных покровов, нарушение заживления ран. Мышечная слабость цинготного больного является следствием быстро развивающейся недостаточности карнитина, обеспечивающего энергетику миоцитов. При гиповитаминозе С развивается железодефицитная анемия из-за нарушения всасывания железа и использования его запасов при синтезе гемоглобина. При недостатке аскорбата снижается также участие фолиевой кислоты в пролиферации костномозговых клеток, что усугубляет течение анемии .

Гиповитаминоз С всегда сопровождается ослаблением иммунозащитных сил организма, а также усилением реакций свободнорадикального окисления, лежащих в основе патогенеза множества заболеваний — лучевой болезни, рака, атеросклероза, диабета и др .

Основные природные источники Основными источниками витамина С являются растения. Особенно много аскорбиновой кислоты в перце, хрене, ягодах рябины, чрной смородины, земляники, клубники, в апельсинах, лимонах, мандаринах, капусте (как свежей, так и квашенной), в шпинате .

Суточная потребность Необходимо около 60 мг в сутки .

Взаимодействие Ряд химических соединений, действию которых подвергается человек, такие, как загрязнители воздуха, промышленные токсины, тяжелые металлы, табачный дым, а также некоторые фармакологически активные соединения, в частности, антидепрессанты и диуретики могут привести к увеличению потребности в витамине С. Это также имеет место в при наличии определенных вредных привычек, например, при злоупотреблении алкоголем, курении .

Присутствие других антиоксидантов типа витамина Е и -каротина поддерживает защитное антиоксидантное действие витамина С .

Липоевая кислота (витамин N) Липоевая кислота (1,2-дитиолан-3-пентановая кислота) в составе молекулы содержит два атома серы по С6 и С8 положениям .

Атом углерода в С6 положении является хиральным, и молекула существует в виде двух энантиомеров R-(+)-липоевой кислоты и S-( )липоевой кислоты, а также в виде рацемической смеси R/S-липоевой кислоты. Только R-(+)-энантиомер существует в природе и является важнейшим кофактором четырех митохондриальных ферментных комплексов: пируватдегидрогеназного комплекса, альфакетоглутаратдегидрогеназного комплекса, дегидрогеназы кетокислот с разветвленной цепью, ацетондегидрогеназного комплекса .

–  –  –

В этих реакциях липоевая кислота выполняет роль переносчика электронов и ацильных групп. В липоевой кислоте функцию окислительно-восстановительного центра выполняет внутримолекулярный дисульфидный мостик. Активная липоевая кислота ковалентно связана с остатком лизина (R') молекулы фермента .

Липоевая кислота — идеальный антиоксидант. Обнаружена ее высокая эффективность в защите организма от повреждающего действия радиации и токсинов. Она устраняет свободные радикалы, образующиеся при окислении пирувата в митохондриях, реактивирует другие антиоксиданты — витамины Е и С, а также тиоредоксин и глутатион .

Липоевая кислота увеличивает эффективность утилизации глюкозы клетками, ингибирует деградацию инсулина, снижает уровень гликозирования белков, что делает ее эффективной при борьбе с сахарном диабете .

Недостаточность Гипо- и гипервитаминозы липоевой кислоты для человека не описаны .

Основные природные источники Наиболее богаты липоевой кислотой дрожжи, мясные продукты, молоко .

Суточная потребность Суточная потребность предположительно 1—2 мг .

Витамин К Витамин К – это группа соединений сходного строения, производных 2-метил-1,4-нафтохинона. Эти соединения имеют метилированный нафтохиноновый фрагмент с переменной по числу звеньев алифатической боковой цепью в положении 3 .

В природе найдены только два витамина группы К: Витамин К1 – филлохинон, содержит 4 изопреноидных звена, одно из которых является ненасыщенным. Витамин К2 – менахинон, боковая цепь может состоять из разного числа изопреноидных остатков. Витамин К3 – менадион (2метил-1,4-нафтохинон) является синтетическим витамином.

Кроме витамина К3 в настоящее время существует ряд других синтетических аналогов витамина К, обладающих антигеморрагическим действием:

витамин К4 (2-метил-1,4-нафтогидрохинон), витамин К5 (2-метил-4амино-1-нафтогидрохинон), витамин К6 (2-метил-1,4диаминонафтохинон), витамин К7 (3-метил-4-амино-1нафтогидрохинон) .

–  –  –

Биологическая роль витамина К заключается в том, что он является коферментом -глутаматкарбоксилазы, карбоксилирующей глутаминовую кислоту с образованием -карбоксиглутаминовой кислоты .

Са2+-связывающей

-Карбоксиглутаминовая кислота является аминокислотой, которая необходима для функционирования кальцийсвязывающих белков. К таковым относятся: факторы свертывающей системы крови — IX, VII, X и протромбин; регуляторные белки (протеин С и протеин S), нуждающиеся в -карбоксиглутаминовой кислоте для Са-индуцированного взаимодействия с поверхностью клеточной мембраны; белки минерализации костной ткани (костный карбоксиглутаминовый протеин и другие); витамин-К-зависимый сократительный белок хвостика сперматозоида .

Общей особенностью всех витамин-К-зависимых белков является формирование белковой сеточки, образованной -карбоксилутаминовой кислотой, связанной с кальцием. Такая сеть впервые была описана для протромбина. Протромбин в присутствии Са2+ связывается с мембраной, что является необходимым условием для реализации процесса свертывания крови .

Недостаточность Случаи недостаточного потребления витамина К с пищей достаточно редки. Гораздо чаще недостаточность развивается после длительного лечения антибиотиками, сопровождаемого различными ограничениями в приеме пищи .

Основные природные источники Витамин К известен во многих формах. Витамин К1 (филлохинон, фитонадион) обычно содержится в растениях. Витамин К2 (менахинон), обладающий примерно 75 % активности витамина К1, синтезируется бактериями в кишечнике человека и различных животных. Витамин К3 (менадион) является синтетическим веществом, которое может быть преобразовано в К2 в кишечнике .

Витамина К много в капусте, зеленых томатах, шпинате, ягодах рябины. Из животных продуктов его источником является печень .

Суточная потребность Потребность — приблизительно 0,1 мг в сутки Взаимодействие Антикоагулянты (кумарин и инданедион) подавляют рециркуляцию витамина К. Антибиотики, болезни кишечника, минеральное масло и радиация подавляют всасывание витамина К. Большое количество витамина Е может усилить антикоагулянтное действие антагонистов витамина К таких, как варфарин. У пациентов с синдромом пониженного всасывания жиров или заболеваниями печени также есть риск развития недостаточности витамина К .

ВИТАМИНЫ, ДЛЯ КОТОРЫХ КОФЕРМЕНТЫЕ ФОРМЫ НЕ

УСТАНОВЛЕНЫ

Холин (витамин В4) Витамин В4 или холин представляет собой аминоэтиловый спирт, содержащий у атома азота три метильные группы:

Холин является структурным компонентом таких фосфолипидов, как фосфатидилхолин и сфингомиелины, которые в свою очередь входят в структуру биологических мембран. Холин служит предшественником в образовании важнейшего медиатора нервной системы – ацетилхолина .

Недостаточность При дефиците холина появляются раздражительность и нервные срывы, возникают гастрит и диарея, повышается артериальное давление, ухудшается работа печени, происходит замедление роста .

Основные природные источники Холин входит в состав многих пищевых продуктов. Растительные продукты содержат меньше холина, чем продукты животного происхождения. В последних содержание холина пропорционально содержанию в них фосфолипидов. Лучшим источником холина среди продуктов животного происхождения является яичный желток. Холин содержится также в печени, мозге, поджелудочной железе. Из растительных продуктов лучшим источником его являются зеленые листья и бобовые. В злаках холин находится в зародышевой части зерна .

Суточная потребность Дневная норма потребления холина – 0,15-1 г .

Взаимодействие При дефиците холина в рационе снижается и количество карнитина .

Фенобарбитал (использующийся для предотвращения эпилептических припадков) и метотрексат (препарат для лечения рака и ревматоидного артрита) влияют на способность всасывать холин через кишечный тракт .

Инозитол (витамин В8) Инозитол (цис-1,2,3,5-транс-4,6-циклогексанол) представляет собой циклический шестиатомный спирт циклогексана:

–  –  –

Инозитол входит в состав фосфатидилинозитолов, содержащихся в мембранах всех тканей, особенно богата ими мозговая ткань .

Фофорилированные формы инозита, прежде всего инозитол-1,4,5трифосфат (ИТФ), являются посредниками в реализации действия некоторых гормонов. ИТФ способствует высвобождению ионов кальция из кальцисом .

Инозитол участвует в активации процессов, активно расщепляющих ацилглицерины, таким образом препятствуя их поступлению и отложению в печени, снижает уровень холестерола в крови, поддерживает эластичность стенок артерий, участвует в обеспечении нормальной работы нервных клеток, мозга, печени, поджелудочной железы и органов зрения. Кроме этого инозитол обладает антисклеротическим эффектом, стимулирует и поддерживает развитие сперматозоидов, поддерживает жизнеспособность клеток спинного мозга, активизирует рост волос, препятствует их выпадению, а также оказывает явно выраженный успокоительный эффект .

Недостаточность У животных, находящихся на инозит дефицитной диете, кроме специфического облысения, наблюдаются нервно-трофические расстройства, нарушение координации движений, судороги конечностей и полная потеря зрения. Недостаточность инозита у человека не описана .

Основные природные источники Инозит содержится во многих пищевых продуктах. Особенно богаты им орехи, цитрусовые фрукты, бобовые, овощи, злаковые культуры, печень и сердце животных, молоко и молочные продукты .

Инозитол вырабатывается самим организмом, преимущественно из глюкозы, содержащейся в его тканях и органах .

Суточная потребность Суточная потребность составляет приблизительно 1,0-1,5 г .

Взаимодействие Инозит способен связывать кальций, цинк и железо в кишечнике, препятствуя их нормальному усвоению. Потребность в инозитоле возрастает у алкоголиков, диабетиков и тех, кто пьет кофе. Разрушают инозит и некоторые медикаменты (например, сульфамиды) .

Пара-аминобензойная кислота (витамин В10) Коферментные функции витамина В10 или пара-аминобензойной кислоты (ПАБК) не установлены, хотя она и обладает широким спектром физиологического действия на организм. Являясь составной частью фолиевой и фолиновой кислот, парааминобензойная кислота способствует синтезу пуринов и пиримидинов, а, следовательно, РНК и ДНК. Она оказывает влияние на обмен некоторых биогенных аминов .

ПАБК повышает тонус кожи, предупреждает преждевременное ее увядание. Это соединение используют практически во всех солнцезащитных лосьонах и кремах. Под воздействием ультрафиолетовых лучей она подвергается превращениям, которые помогают синтезировать вещества, стимулирующие выработку меланина

– пигмента, обеспечивающего появление загара. Витамин В10 поддерживает естественную окраску волос и обеспечивает их рост .

Недостаточность При недостатке витамина В10 ухудшается состояние волос, возникают кожные заболевания; появляется повышенная утомляемость, раздражительность, головные боли; наблюдаются нарушения функции органов пищеварения; повышается чувствительность к ультрафиолетовым лучам .

Основные природные источники ПАБК содержится во многих продуктах, но более всего в печени, почках, молочных продуктах, яичном желтке, рисе, пивных дрожжах, картофеле, моркови, рыбе и орехах Суточная потребность для взрослого человека - 100 мг .

Взаимодействие В медицине широко используются аналоги парааминобензойной кислоты, обладающие антагонистическим действием, – сульфаниламиды .

Они применяются при инфекционных заболеваниях в качестве бактериостатических средств. Фолиевая кислота необходима для роста многих бактерий, поскольку она является предшественником пуринов, участвующих в образовании РНК и ДНК. Предшественником фолиевой кислоты является парааминобензойная кислота. Таким образом, недостаток у бактерий парааминобензойной кислоты блокирует их рост .

В организме человека фолиевая кислота не синтезируется. Клетки организма не используют сульфаниламиды вместо парааминобензойной кислоты. Поэтому сульфаниламиды на клетки организма человека не действуют так, как они действуют на бактерии .

Используются также производные парааминобензойной кислоты (новокаин, анестезин и др.), обладающие местным анестезирующим действием .

L-карнитин (витамин В11) L-карнитин (L-3-гидрокси-4-триметиламмонийбутират):

Карнитин транспортирует длинноцепочечные жирные кислоты в митохондрии, где происходит их -окисление до ацетил-КоА .

Происходит это следующим образом: ацил~SКоА с помощью карнитинацилКоА-трансферазы или карнитин-пальмитоил-трансферазы, связывается с карнитином с образованием ацил-карнитина. Транслоказа переносит ацил-карнитин в митохондриальный матрикс, где карнитин заменяется на ацильную группу с участием KoA-SH. Образующийся ацил-SKoA становится доступным для окисления или дальнейшего удлинения цепи жирной кислоты. Аналогичную роль выполняет карнитин при транспорте ацетил-SKoA, однако, направленность переноса ацетила противоположная. Тем самым обеспечивается поддержание физиологическою уровня ацетил-КоА в митохондриях – важного условия гомеостазиса метаболических процессов .

Рисунок 5.2 - Перенос жирных кислот с длинным углеводородным радикалом через мембраны митохондрий (Е .

С. Северин, Т.Л. Алейникова, Е.В .

Осипов "Биологическая химия" изд."Медицина" 2000 г.) Функция карнитина не ограничивается транспортом ацильных остатков. Имеются данные, что это соединение стимулирует внешнесекреторную функцию поджелудочной железы, активирует сперматогенез .

Недостаточность Дефицит витамина В11 проявляется в виде хронической усталости, ожирения, раздражительности, астении, нарушений работы сердца, повышения артериального давления, непереносимости физических нагрузок .

Основные природные источники Карнитина много в мясе и молочных продуктах .

Суточная потребность Ежедневная норма потребления - 300 мг .

Взаимодействие Для превращения аминокислот лизина и метионина в карнитин необходим витамин B6 .

Пангамовая кислота (витамин В15) Особое значение витамина B15 или пангамовой кислоты заключается в синтезе креатинфосфата, обеспечивающего нормальную сократительную способность мышц и улучшающего энергетические процессы в целом. При его участии происходит интенсификация тканевого дыхания, поэтому он используется для улучшения состояния при острых и хронических интоксикациях .

Пангамовая кислота

Пангамовая кислота обладает липотропными свойствами. Это свойство делает ее необходимой для нормализации липидного обмена, снижает риск развития заболеваний печени .

Недостаточность Недостаток витамина В15 приводит к нервным расстройствам и заболеваниям сердечно-сосудистой системы .

Основные природные источники Наибольшее содержание пангамовой кислоты обнаружено в семенах злаковых растений и в ядрах косточковых плодов. Источниками пангамовой кислоты также являются пивные дрожжи и печень .

Суточная потребность Норма потребления витамина В15 - 2 мг в сутки .

Взаимодействие Пангамат кальция оказался эффективным при гепатитах средней тяжести и малоэффективным при циррозах. Сведения об участии пангамовой кислоты в окислении этанола послужили основанием для использования его в терапии хронического алкоголизма. Некоторые авторы наблюдали положительный эффект пангамата кальция при данной патологии .

Витамин Р (флавоноиды) Витамин P – это комплекс биологически активных веществ со сходной биологической активностью: катехины, халконы, дигидрохалконы, флавины, флавононы, изофлавоны, флавонолы и др. В основе их структуры лежит дифенилпропановый углеродный «скелет»

хромона или флавона .

Достаточно изученным является капилляроукрепляющее свойства витамина Р, обусловленное его способностью регулировать образование коллагена (синергизм с витамином С) и препятствовать деполимеризации основного вещества соединительной ткани гиалуронидазой (ингибируют активность фермента). Показана способность флавоноидов умеренно ингибировать фосфолипазы, циклооксигеназу и липоксигеназу и тем самым тормозить каскад арахидоновой кислоты, синтез простагландинов и лейкотриенов .

Флавоноиды являются эффективными антиоксидантами. Благодаря своей полифенольной природе флавоноиды имеют выраженные электрон-донорные свойства, что позволяет им легко вступать в одноэлектронные реакции с различными радикалами с образованием стабильных соединений (хинонов). Другой особенностью флавоноидов является их способность связывать ионы металлов, образуя хелатные комплексы. Благодаря этим хелатирующим свойствам полифенолы могут влиять на сорбцию металлов, регулируя тем самым баланс металлов в организме и, в конечном итоге, внутриклеточный редокс потенциал .

Недостаточность Симптоматика недостаточности биофлавоноидов сводится к явлениям повышенной проницаемости и ломкости капилляров, петехиям (точечным кровоизлияниям), кровоточивости десен .

Основные природные источники Основными источниками витамина Р являются белая кожица перегородок цитрусовых, абрикосы, ежевика, черешня, помидоры, черная смородина, листья зеленого чая, перец красный, капуста, салат, виноград, малина .

Суточная потребность Суточная потребность взрослого человека в витамине Р состоит 25мг .

Взаимодействие Витамин Р и аскорбиновая кислота являются синергистами .

Флавоноиды способны эффективно связывать ионы металлов переменной валентности .

Витамин U (метилметионин сульфоний хлорид) Витамин U – метилметионинсульфоний-хлорид ((3-амино-3карбоксипропил)-диметилсульфоний), является производным аминокилоты метионин .

Метилметионин сульфоний хлорид Этот катион является промежуточным метаболитом во многих биосинтетических реакциях из-за наличия сульфониевой функциональной группы. S-Метилметионина особенно много в растениях, где он представлен даже в большем количестве, чем метионин. Подобно метионину он служит донором метильных групп в реакциях синтеза холина (фосфатидилхолинов) и креатина. Важной особенностью проявления действия витамина U является его способность нормализовывать работу желудка, благотворно влиять на слизистую оболочку, стимулируя регенерацию клеток .

Недостаточность Недостаточность витамина у человека не описана, однако имеются данные, что при дифиците витамина U могут наблюдаться повреждения слизистой оболочки желудка .

Основные природные источники Основными источниками поступления витамина U в организм человека являются: сырая капуста, картофель, сельдерей, петрушка, помидоры и зеленый чай. В незначительных количествах этот витамин содержится также и в столовой свекле .

Суточная потребность Суточная потребность - 200 мг .

Ретинол (витамин А) Витамин А – это группа соедиений, включающая ретинол, ретиналь и каратиноиды (провитамины). Все формы витамина А содержат бета-иононное кольцо, к которому присоединена изопреноидная цепь (ретинильная группа) .

–  –  –

Витамин А играет важную роль в разнообразных функциях организма, таких как: он является структурным компонентом клеточных мембран; регулирует рост и дифференцировку клеток эмбриона и растущего организма, а также деление и дифференцировку быстро пролиферирующих тканей, в первую очередь, эпителиальных, хряща и костной ткани; контролирует синтез белков цитоскелета, реакции распада и синтеза гликопротеинов, принимает учатие в транскрипции генов, в кроветворении, участвует в фотохимическом акте зрения; является важнейшим компонентом антиоксидантной защиты организма. Витамин А и ретиноиды стимулируют реакции клеточного иммунитета, в частности, увеличивают активность Т-киллеров .

Одна из самых важных физиологических функций витамина А – участие в зрительном процессе. 11-Цис-ретиналь входит в состав родопсина (пигмент палочек) и иодопсинов (пигменты колбочек) .

Родопсин и иодопсины состоят из белка опсина (разные формы) и ретиналя, который присоединяется к ним через альдегидную группу витамина и свободную NН2-группу лизина с образованием шиффова основания. На свету родопсин расщепляется на белок опсин и ретиналь;

последний подвергается серии конформационных изменений и переходит в транс-форму. Эта изомеризация вызывает нервный сигнал, который по зрительному нерву передается в зрительный центр мозга. В темноте происходит обратный процесс — синтез родопсина, требующий наличия активной формы альдегида — 11-цис-ретиналя, который может синтезироваться из цис-ретинола, или транс-ретиналя, или транс-формы витамина А при участии двух специфических ферментов — дегидрогеназы и изомеразы .

Витамин А также функционирует в совершенно иной роли:

ретиноевая кислота, является важным гормономподобный фактором роста для эпителиальных и других клеток .

Недостаточность Одним из наиболее ранних симптомов недостаточности витамина А является гемералопия (куриная слепота) или нарушение способности различать предметы при тусклом свете. Острая недостаточность вызывает частичную или полную слепоту, состояние, называемое ксерофтальмией .

Дерматиты сопровождаются патологической пролиферацией, кератинизацией и слущиванием эпителия. Отслаивание эпителия слезных каналов может приводить к их закупорке и уменьшению смачивания роговицы глаза слезной жидкостью — она высыхает (ксерофтальмия) и размягчается (кератомаляция) с образованием язв и «бельма». Поражение роговицы может развиваться очень быстро, так как нарушение защитных свойств эпителия приводит к присоединению вторичной инфекции .

Витамин А называется также витамином роста. Особенно демонстративно отставание в росте и гибель животного при недостатке ретинола прослеживаются у хищников, которые не способны синтезировать этот витамин из каротинов .

Гипервитаминоз Хроническое отравление витамином наблюдается при регулярном употреблении высоких доз витамина, больших количеств рыбьего жира .

Случаи острого отравления со смертельным исходом наблюдали при употреблении в пищу печени акулы, белого медведя, морских животных (печень и жировая ткань — основные депо витамина) .

Для гипервитаминоза А характерны следующие симптомы:

воспаление роговицы глаза, гиперкератоз, потеря аппетита, тошнота (при остром отравлении — рвота), понос, головные боли, боли в суставах, увеличение печени. Развивается общее истощение организма .

Основные природные источники Витамин А встречается в природе в двух основных видах - в виде ретинола, содержащегося только в животных источниках, и каротиноидов (провитаминов), содержащихся только в растительных источниках. каротин является предшественником витамина А. Расщепление одной молекулы -каротина специфическим кишечным ферментом приводит к образованию двух молекул витамина А .

Большое количество бета-каротина содержится в моркови, желтых и зеленых овощах: в шпинате, брокколи, тыкве, абрикосах и дыне. Ретинол содержится в печени, яичном желтке, рыбе, цельном молоке, сливочном масле и сыре .

Суточная потребность Суточная потребность в витамине А составляет 800 мкг для женщин и 1000 мкг для мужчин .

Витамин E (токоферола ацетат) Витамин Е – это группа жирорастворимых соедиений .



Pages:   || 2 | 3 |



Похожие работы:

«Литературоведение УДК 82.0 (470.621) ББК 83.3 (2=Ады) А 23 Агержанокова С.Р. Кандидат филологических наук, ведущий научный сотрудник отдела литературы Адыгейского республиканского института гуманитарных исследовани...»

«Ответы на задание отборочного этапа Олимпиады "Ломоносов-2015" по биологии 5 – 9 классы Тестовая часть Разминочное задание состоит из одного вопроса, правильное решение которого оценивалось 2 баллами. После отпра...»

«I. Аннотация 1. Цели и задачи дисциплины Целями освоения дисциплины является формирование способности использовать представления о закономерностях воспроизведения и индивидуального развития биологических объектов для решения задач профессиональной деятельности.Задачами освоения дисциплины являются: 1. Изучение...»

«Министерство образования и науки Российской Федерации Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования ПЕТРОЗАВОДСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ эколого-биологический факультет, кафедра общей химии ИЛЫШЕВА АЛЬБИН...»

«Академия наук СССР Дальневосточное отделение Биолого-почвенный институт АМУРО-УССУРИЙСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ ВСЕСОЮЗНОГО ОРНИТОЛОГИЧЕСКОГО ОБЩЕСТВА ЖУРАВЛИ ПАЛЕАРКТИКИ (Биология, морфология, распространение) СБОРНИК НАУЧНЫХ ТРУДОВ Отв. редактор...»

«УДК 581.195.7:632.11/15 © 2009 Н. И. Шевякова, член-корреспондент НАН Украины Л. И. Мусатенко, Л. А. Стеценко, Н. П. Веденичева, Л. В. Войтенко, В. Ю. Ракитин, академик НАН Украины К. М. Сытник, член-корреспондент Рос. АН Вл. В. Кузнецов Влия...»

«МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ "РОССИЙСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ПЕДАГОГИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ им. А. И. ГЕРЦЕНА" Рабочая программа дисциплины вариативная часть (дисциплины и курсы по...»

«Арифулии Евгений Альбертович СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ НУКЛЕОПРОТАМИНОВОГО ХРОМАТИНА В СПЕРМАТОЗОИДАХ ЧЕЛОВЕКА 03.03.04 клеточная биология, цитология, гистология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук 2 1''^ 1 /Г:' Москва-2012 Работа выполнена в отделе эл...»

«ОГЛАВЛЕНИЕ 1. ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ДИСЦИПЛИНЫ "БИОЛОГИЯ", ЕЕ МЕСТО В СТРУКТУРЕ ОСНОВНОЙ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЙ ПРОГРАММЫ СПЕЦИАЛЬНОСТИ..3 1.1. Цели преподавания дисциплины..3 1.2 . Задачи изучения дисциплины..4 2. КОМПЕТЕНЦИИ ОБУЧАЮЩЕГОСЯ, ФОРМИРУЕМЫЕ В РЕЗУЛЬТАТЕ ОСВОЕНИЯ ДИСЦИПЛИНЫ "БИОЛОГИЯ"...4 2.1. Общек...»

«ГРУНТОВЕДЕНИЕ БИОТЕХНОЛОГИИ В ИНЖЕНЕРНОЙ ГЕОЛОГИИ BIOTECHNOLOGIES IN ENGINEERING GEOLOGY MAKSIMOVICH N.G. МАКСИМОВИЧ Н.Г. Head of the Laboratory of Technogenic Processes Geology and deputy Заведующий лабораторией геологии техногенных процессов и science director of the Institute o...»

«Как "поднять брошенное": Григорий Гурьянов, архитектор, партнер подходы к ревитализации бюро "Практика" промзон 03.02.2017 2 . Промзоны: особенности и потенциал Есть ли жизнь после ПРОМа? Современные города...»

«МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СОВЕТ ПО СТАНДАРТИЗАЦИИ, МЕТРОЛОГИИ И СЕРТИФИКАЦИИ (МГС) INTERSTATE COUNCIL FOR STANDARDIZATION, METROLOGY AND CERTIFICATION (ISC) МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ ГОСТ СТАНДАРТ 32532ФТАЛЕВЫЙ АНГИДРИД Определение содержания в воздушной среде полярографическим методом Издание официальное Москва Стандартинформ кружев...»

«z R \m ?ппп Ha правах рукоппси ВЯТКШ! Александр Иванович РОД К Р А С О Д Н Е В (HE.MEROCALLIS L, BCtJEIlPH 03 00.05 -"Ботаника" АВТОРЕФЕРАТ диссертации, на соискание ученой степени кандидата биологических наук Q \J Новосибирск 2000 Работа выполнена в Центральном сибирском ботаническом саду СО РАН. Науч...»

«/ / I 05002226 ПОСПЕЛОВ АЛЕКСЕЙ ЛЬВОВИЧ РОЛЬ МУТАЦИЙ НЕКОТОРЫХ ГЕНОВ ЕСТЕСТВЕННОГО И ПРИОБРЕТЕННОГО ИММУНИТЕТА В ТЕЧЕНИИ ВПЕРВЫЕ ВЫЯВЛЕННОГО ТУБЕРКУЛЕЗА У ДЕТЕЙ И ПОДРОСТКОВ. 14.03.09 клиническая иммунология, аллергология 03.02.07 генетика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на с...»

«ШАБАНОВА Маргарита Михайловна МНОГОЩЕТИНКОВЫЕ  ЧЕРВИ  СЕМЕЙСТВА  POLYNOIDAE (ANNELIDA,  POLYCHAETA).  СИСТЕМА  И  ФИЛОГЕНИЯ. 03.00.08  -  зоология АВТОРЕФЕРАТ диссертации  на  соискание ученой  степени кандидата  биологических  наук Москва 2004 Работа  выполнена  на  кафедре зоологии  бесп...»

«УДК 66.097:629.113.115 РАЗРАБОТКА АВТОМАТИЗИРОВАННОГО КОМПЛЕКСА ПРОЦЕССА ПРОИЗВОДСТВА АВТОМОБИЛЬНЫХ КАТАЛИЗАТОРОВ Батурина А.Ю., Рыбакова И.Н. Научный руководитель канд. техн. наук Тинькова С.М. Сибирский федеральный университет На дороги ежедневно выезжают миллионы автомобилей, и каждый из них источник...»

«013385 Область техники Настоящее изобретение относится к устройствам и способам для удаления целевых агентов из образца. В частности, настоящее изобретение относится к удалению патогенов из биологических о...»

«МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РФ ФГБОУ ВО "Уральский государственный лесотехнический университет" Институт химической переработки растительного сырья и промышленной экологии (ИХПРСиПЭ) Кафедра химической технологии древесины, биотехнологии и наноматериалов Одобрена: Утверждаю Кафедрой ХТДБиН Директор ИХПРСиПЭ Протокол...»

«ISSN 2076-7099 2011, № 2 Психологический журнал Международного университета природы, общества и человека "Дубна" www.psyanima.ru Сергин В.Я . Сознание и мышление: нейробиологические механизмы // Психологический журнал Международног...»

«Ахапкина Анна Александровна ГЕМОРЕОЛОГИЧЕСКИЕ ПРОФИЛИ И МИКРОЦИРКУЛЯЦИЯ У НОРМОТЕНЗИВНЫХ ЛИЦ С РАЗНЫМ УРОВНЕМ АРТЕРИАЛЬНОГО ДАВЛЕНИЯ 03.03.01 – физиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биол...»

«ИСКАЖЕНИЕ СОБСТВЕННОГО ЭЛЕКТРОМАГНИТНОГО ПОЛЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДОЙ Н.В. Шейкина 1, Н.И. Богатина 2 1-Харьковский национальный университет им В.Н. Каразина, Украина 2-Физико-технический институт низких т...»

«ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ СОЮЗА ССР СПЕРМА БЫКОВ ЗАМОРОЖЕННАЯ МЕТОДЫ БИОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ ГОСТ 2 7 7 7 7 -8 8 (СТ СЭВ 5 9 6 1 -8 7 ) Издание официальное S' Цена 3 коп. ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР ПО СТАНДАРТАМ Москва льняные скатерти УДК 619:611-013.11.001.4:006.35...»

«БИОЛОГИЯ УДК 631 ВЛИЯНИЕ ЗАГРЯЗНЕНИЯ КАДМИЕМ НА ФЕРМЕНТАТИВНУЮ АКТИВНОСТЬ ЧЕРНОЗЕМА ОБЫКНОВЕННОГО © Е. И. Новоселова*, С. А. Башкатов Башкирский государственный университет Россия, Республика Башкортостан, 450076 г. Уфа, ул. Заки Валиди, 32. *Email: novoselova58@mail.ru В работе приведены э...»







 
2018 www.lit.i-docx.ru - «Бесплатная электронная библиотека - различные публикации»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.