WWW.LIT.I-DOCX.RU
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - различные публикации
 

«КАРАМЫШЕВ Алексей Владимирович ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ СИНТЕЗ ПОЛИАНИЛИНА, КАТАЛИЗИРУЕМЫЙ ОКСИДОРЕДУКТАЗАМИ ...»

На правах рукописи

КАРАМЫШЕВ

Алексей Владимирович

ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ СИНТЕЗ ПОЛИАНИЛИНА,

КАТАЛИЗИРУЕМЫЙ ОКСИДОРЕДУКТАЗАМИ

02.00.15 - катализ

03.00.23 - биотехнология

Автореферат

диссертации на соискание учёной степени

кандидата химических наук

Москва – 2007

Работа выполнена на кафедре химической энзимологии Химического факультета

Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова

Научный руководитель:

ведущий научный сотрудник, доктор химических наук, профессор Сахаров Иван Юрьевич

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Ямсков Игорь Александрович доктор химических наук Сергеев Владимир Глебович

Ведущая организация:

Институт Молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН 2007 года в 1600 час на заседании диссертационного

Защита состоится « 29 » мая совета Д501.001.59 по химическим наукам при Московском государственном университете им. М.В.Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские горы, д.1 стр.11, МГУ, Химический факультет, кафедра химической энзимологии, аудитория 202 .

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова Автореферат разослан апреля 2007 года

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук И.К. Сакодынская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы .

В 2000-м году Нобелевская премия по химии была присуждена исследователям Хидеки Сиракава (Hideki Shirakawa, Япония), Алану МакДиамиду (Alan G. McDiarmid, США) и Алану Хигеру (Alan J. Heeger, США) за “открытие и развитие области электронопроводимых полимеров’ .

Электропроводящие полимеры образовали новый класс “синтетических металлов”, обладая исключительными свойствами в сравнении с низкомолекулярными полупроводниками. На настоящий момент они нашли широкое применение в различных областях науки и техники от микроэлектроники (батареи, оптические мониторы) до аналитической практики (сенсоры). Полианилин привлекает наибольшее внимание благодаря своей высокой стабильности и хорошим проводящим характеристикам. Более того, в присутствии хирального индуктора (например, энантиомеров камфорсульфоновой кислоты) он способен образовывать оптически активные вторичные структуры, что может позволить существенно расширить область применения этого полимера, в частности в качестве селектора для разделения оптически активных соединений. К сожалению, основные способы получения (химический иэлектрохимический) полианилина обладают определенными недостатками, что вызывает необходимость в разработке альтернативных подходов .

В последние годы появляется все больше работ, посвященных ферментативной полимеризации, как альтернативному способу получения полимеров. Ранее была показана принципиальная возможность проведения ферментативной полимеризации анилина с образованием электропроводящих полиэлектролитных комплексов на основе полианилина при использовании пероксидазы хрена как биокатализатора. Однако, как оказалось, в условиях, необходимых для синтеза (кислая среда), этот ферментный препарат быстро теряет свою активность. Таким образом, становятся понятным актуальность диссертационной работы, посвященной ферментативному синтезу полианилина, катализируемого кислотостабильными оксидоредуктазами .





Цели и задачи исследования .

Целью настоящей работы явился поиск высокоактивных и кислотостабильных оксидоредуктаз, способных в экологически чистых условиях эффективного катализировать полимеризацию анилина с образованием электропроводящего и оптически активного полианилина .

Основными задачами

настоящей работы являлись:

Исследование возможности использования лакказы Coriolus hirsitus и пероксидазы из листьев Королевской пальмы в качестве биокатализаторов для проведения ферментативного синтеза полианилина Оптимизация методик ферментативного синтеза проводящих полиэлектролитных комплексов полианилина с сульфополистиролом и поли(2-акриламидо-2-метил-1-пропан)сульфокислота Изучение ферментативного синтеза хирального полианилина, катализируемого пероксидазой пальмы, на мицеллах додецилбензолсульфоновой кислоты Определение физико-химических свойств и структуры полианилина, полученного ферментативным путем .

Научная новизна работы и практическая значимость работы .

Впервые проведен ферментативный синтез полиэлектролитных комплексов на основе полианилина с использованием двух кислотостабильных оксидоредуктаз – лакказы Coriolus hirsitus и пероксидазы из листьев Королевской. Показано, что в процессе реакции образуется проводящий полианилин с улучшенными характеристиками в экологически чистых условиях. Впервые проведен ферментативный синтез хирального полианилина на мицеллах додецалбензолсульфоновой кислоты, катализируемый пероксидазой пальмы. Показано, что хиральный полианилин может образовываться в отсутствие хирального индуктора (энантиомера камфорсульфоновой кислоты) при ферментативной полимеризации анилина .

Изучена морфология ферментативно синтезированного хирального полианилина, представляющего из себя пористые рисоподобные частицы длиной порядка 180нм .

Апробация работы .

Основные результаты работы представлены на международных конференциях: “Биокатализ-2002” (Москва, Россия, 2002), Конференция молодых ученых, аспирантов и стипендиатов фонда им. И.В.

Березина “Инженерная энзимология” (Москва, Россия, 2002-2003), “Биотехнология:

состояние и перспективы развития”, (Москва, Россия, 2002, 2003 и 2007), “1 European Chemistry Congress, Polymer architecture – from structure to functional control” (Будапешт, Венгрия, 2006) и EUROBIC8 (Авейро, Португалия, 2006) .

Публикации .

По материалам диссертации опубликованы 4 статьи и 5 тезисов докладов на международных конференциях .

Структура и объем диссертации .

Диссертация состоит из введения, обзора литературы (3 главы), описания материалов и методов исследования, обсуждения результатов (3 главы), выводов и списка цитируемой литературы, включающего 95 ссылок. Работа изложена на страницах 105 и включает в себя 38 рисунков и 6 таблиц Сокращения, принятые в тексте .

ПАНИ – полианилин, ПП - пероксидаза из листьев Королевской пальмы, СПС – сульфополистирол, ПАМПС - поли(2-акриламидо-2-метил-1пропан)сульфокислота, ДБСК – додецилбензолсульфо-кислота, КСК – камфорсульфоновая кислота .

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ

I. Ферментативный метод синтеза полиэлектролитных комплексов электропроводящего полианилина, используя грибную лакказу и пероксидазу пальмы в качестве биокатализаторов .

–  –  –

На рис. 6 (А) представлена кинетика реакции полимеризации анилина, катализируемой лакказой. Как видно, реакция продолжалась в течение 6 суток, и практически все это время фермент оставался в активном состоянии. Вместе с тем, несмотря на высокую концентрацию в системе фермента, скорость реакции оставалась невысокой, что связано с низкой концентрацией растворенного в реакционной среде молекулярного кислорода (0,2 мМ), А играющего роль окислителя при 50 полимеризации анилина. В то же время, при ферментативном синтезе 40

–  –  –

Схема 2: Кислотное допирование ПАНИ .

Спектральные свойства полиэлектролитных комплексов ПАНИ были изучены не только в виде дисперсионных растворов, но и в виде пленок .

Электронные спектры комплексов в растворах и в высушенном состоянии не имели принципиальных различий (рис. 7). Анализируя спектры пленок в ближней ИК-области (рис. 7 (Б)) важно отметить наличие, хотя и невысокого, поглощения при длинах волн, выше 1300 нм, что в литературе трактуется как наличие делокализованных неспаренных электронов, ответственных за проводимость .

Наличие неспаренных электронов в образцах синтезированных комплексов ПАНИ было подтверждено методом ЭПР. На рис. 9 представлен 10 G типичный спектр ЭПР растворов полиэлектролитных комплексов ПАНИ независимо от используемой полимерной матрицы и используемого фермента. Значение g-фактора для комплексов полианилина составило 2.002, которое характерно для Рис. 9: ЭПР-спектр полиэлектролитного свободных электронов .

комплекса ПАНИ / СПС, синтезированного с помощью ПП Электропроводимость комплексов полианилина различается в зависимости от способа их получения. Так для комплексов ПАНИ, синтезированных с помощью лакказы, проводимость составила 0,2 мС/см. Для образцов комплексов ПАНИ, синтезированных с помощью ПП, проводимость достигала 11,2 мС/см .

Совместно с д.х.н. И.Н. Курочкиным и его сотрудниками, была изучена морфология полиэлектролитных комплексов ПАНИ/ПАМПС с помощью атомной силовой микроскопии. Как показано на рис.10 (А), «чистый» ПАМПС (контроль) абсорбируется на графитовой подложке, образуя тонкую пленку .

Для полиэлектролитных комплексов ПАНИ/ПАМПС также наблюдалось образование тонких пленок ПАМПС с агрегированными молекулами полианилина (рис. 10 (Б)). Эти агрегаты полианилина локализованы на поверхности ПАМПС, не организуя при этом единую полианилиновую цепь, так как агрегаты наночастиц ПАНИ достаточно удалены друг от друга. Размер наночастиц ПАНИ зависит от исходной концентрации ПАМПС. При высоком содержании ПАМПС (при молярном соотношении ПАМПС к анилину – 1:1) размер частиц ПАНИ составил порядка 10-15 нм, а при низком содержании ПАМПС (1:10) – ~ 25 нм. Таким образом, повышение концентрации ПАМПС приводило к увеличению количества сайтов инициации образования полианилина, что приводило к образованию более мелких частиц ПАНИ, т.е изменяя концентрацию ПАМПС, можно варьировать размер образующихся частиц ПАНИ .

Наиболее яркие отличия между полиэлектролитными комплексами с различным содержанием ПАМПС 10 проводимость, мС/см были обнаружены при изучении 8 влияния полимерной матрицы на проводимость пленок полианилина. 6

–  –  –

ПАНИ Рис. 10: Морфология комплекса полианилин/ПАМПС, полученная с помощью атомносиловой микроскопии. (А) – ПАМПС (контороль); (Б) – комплекс полианилин/ПАМПС, полученный ферментативно с помощью ПП при молярном соотношении концентраций мономерного звена ПАМПС к анилину 1:5 .

Влияние концентрации ПАМПС в реакционной среде на проводимость синтезированных комплексов ПАНИ можно объяснить тем, что в ходе реакции, когда содержание полимерной матрицы велико, молекулы мономерного анилина равномерно распределяются на них и, тем самым, на одной молекуле ПАМПС количество сорбированных молекул анилина невысоко. Это должно приводит к тому, что при большом количестве центров инициации полимерных цепей должны формироваться короткие цепи полианилина. В случае же низкой концентрации ПАМПС в реакционной среде по тем же причинам должны формироваться более длинные цепи ПАНИ, и, следовательно, должна наблюдаться и более высокая проводимость .

III. Синтез хирального полианилина на мицеллах ДБСК, катализируемый ПП Для проведения ферментативного синтеза хирального полианилина в качестве матрицы были выбраны мицеллы ДБСК, способные не только ориентировать анилин с получением линейных молекул полианилина, но и допировать его. Следует отметить, что ДБСК, как и другие детергенты, может разрушать третичную нативную структуру фермента и приводить к его инактивации. Поэтому перед началом работы с ферментативным синтезом хирального полианилина было определено влияние ДБСК на активность пероксидаз. Для этого были определены константы скорости реакции второго порядка (k) для реакции окисления o-дианизидин пероксидом водорода, катализируемой пероксидазой хрена (ПХ) и ПП, в присутствии ДБСК (17мМ) (табл. 2) .

Табл. 2: Влияние ДБСК на каталитическую активность ПХ и ПП

–  –  –

хиральности, как описано для номер образца полианилина Рис. 14: Зависимость молярной эллиптичности (черхимического и электрохимического ные столбцы) и площади ЭПР-спектра (серые столбцы) от условий ферментативного синтеза ПАНИ синтезов оптически активного (согласно табл .

4) полианилина, а к ухудшению оптических характеристик образующегося ПАНИ. Возможно, в качестве индуктора хиральности образующегося полианилина выступали либо хиральные молекулы ПП, либо мицеллы ДБСК, структурируя на своей поверхности определенным образом полимерные цепи полианилина. Ранее образование хиральной третичной структуры на мицеллах ДБСК было описано и детально изучено на примере другого электропроводящего полимера (политиофена) .

Сравнение значений площади ЭПР-спектров и молярной эллиптичности полученных образцов полианилина (рис. 14) не позволило выявить никакого соответствия между этими параметрами. Отсюда следует, что оптимальные условия для синтеза электропроводящего полианилина и хирального полианилина различны, что необходимо учитывать при синтезе полианилинов с желаемыми свойствами .

На рис. 15 представлены два вида спектров в области УФ, видимого и ближнего ИК света, которые регистрировались для полианилина, ферментативно синтезированного при варьировании концентраций компонентов реакционной смеси. Как хорошо видно, эти спектры являются типичными для допированной 2,5 формы полианилина. Все спектры имеют пик поглощения в области 400-415 нм, свидетельствующий об 2,0 уровне допирования и образовании

–  –  –

различия в электронных спектрах наблюдались в длинноволновой 1,0 области. Так электронные спектры для всех образцов, 0,5 синтезированных при самой низкой 400 600 800 1000 1200 концентрации анилина (75 мМ),, нм имели пик поглощения в районе Рис. 15: Электронные спектры образцов ПАНИ, синтенм и небольшое поглощение в зированных на мицеллах ДБСК с помощью ПП области ближнего ИК света, что свидетельствует о формировании компактной конформации цепей ПАНИ. В противоположность этому, электронные спектры всех остальных образцов демонстрировали невысокое поглощение в районе 800 нм и значительным поглощение в области ближнего ИК. Этот факт свидетельствует о существенной делокализации электронов и формировании развернутой конформации полианилиновых цепей. Следует обратить внимание, что формирование развернутой конформации полианилина не наблюдалось при ферментативном синтезе полианилина на полимерных матрицах СПС и ПАМПС .

Морфология полученных образцов полианилина была изучена методами трансмиссионной электронной микроскопии (ТЭМ) совместно с проф. В.Ю .

Поляковым (ИФХБ им. Белозерского, МГУ им. Ломоносова) и сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) совместно с А.Н. Катасовой (Институт геохимии и аналитической химии им. Вернадского РАН) (рис. 16). Было установлено, что все полученные образцы имели одинаковую морфологию вне зависимости от условий синтеза. На рис. 16 (А) видно, что агрегаты полианилина представляют из себя отдельные ‘рисоподобные’ частицы, размеры которых были равны 140 – 180 нм в длину и 70-100 нм в ширину .

Подобные структуры уже были описаны ранее для полианилиновых агрегатов .

Более того, СЭМ позволила показать, что поверхность наночастиц полианилина пористая (рис. 16 (Б)) A Б

–  –  –

1. Разработан ферментативный экологически чистый метод полимеризации анилина в присутствии водорастворимого полимера (СПС и ПАМПС) для получения полиэлектролитных комплексов электропроводящего полианилина. В качестве биокатализаторов применены кислотостабильные препараты грибной лакказы (Coriolus hirsitus) и пероксидазы из листьев Королевской пальмы. Варьируя концентрации реагирующих веществ и кислотность реакционной среды, оптимизированы условия ферментативного синтеза комплексов полианилина. Исследована кинетика синтеза полианилина, катализируемого обоими ферментами .

2. Используя спектральные методы, охарактеризованы препараты ферментативно синтезированного полианилина. Показано, что электронные спектры в УФ-, видимой и ближнем ИК- областях и спектры ЭПР химически и ферментативного синтезированных комплексов полианилина практически идентичны. Найдено, что степень допированности зарегистрирована выше для препаратов полианилина, полученного при синтезе, катализируемом пероксидазой пальмы, чем при катализе лакказой .

3. Методом атомно-силовой микроскопии исследована морфология полиэлектролитных комплексов полианилина/ПАМПС. Размер наночастиц полианилина зависит от исходной концентрации полимерной матрицы: при высоком содержании ПАМПС (при молярном соотношении ПАМПС/анилин

– 1:1) размер частиц составляет порядка 10-15 нм, в то время как при низком содержании ПАМПС (1:10) размер наночастиц полианилина был несколько выше (~25 нм). Показано, что с увеличением содержания ПАМПС в комплексах полианилина происходит также снижение его электропроводимости. Сравнение значений электропроводимости полиэлектролитных комплексов полианилина, полученных различными методами, показало преимущество разработанного нами пероксидазного метода синтеза .

4. Разработан и оптимизирован оригинальный ферментативный метод получения оптически активного полианилина в мицеллах додецилбензолсульфокислоты, где как биокатализатор была использована пероксидаза пальмы. В качестве индуктора хиральности на стадии синтеза были применены энантиомеры камфорсульфоновой кислоты. С помощью метода кругового дихроизма продемонстрировано, что высокохиральный полианилин может быть получен как в присутствии, так и отсутствие камфорсульфоновой кислоты .

5. Методами трансмиссионной и электронной микроскопии определена морфология полианилина, синтезированного в мицеллах додецилбензолсульфокислоты. Найдено, что агрегаты полианилина представляют собой пористые рисоподобные наночастицы, длина и ширина которых равны 140 – 180 нм и 70-100 нм соответственно .

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. A.V. Karamyshev, S.V. Shleev, O.V. Koroleva, A.I. Yaropolov, I.Yu. Sakharov .

Laccase-catalyzed synthesis of conducting polyaniline. Enzyme Microb .

Technol., 2003, v. 33, N 5, 556-564 .

2. Ю. М. Мажуго, А. В. Карамышев, С. В. Шлеев, И. Ю. Сахаров,А. И .

Ярополов. Ферментативный синтез электропроводного комплекса полианилина и поли(2-акриламидо-2-метил-1-пропан)сульфокислоты с использованием пероксидазы пальмы и его свойства. Прикл. биохим .

микробиол., 2005, 41, 283-287 .

3. A.V. Caramyshev, E.G. Evtushenko, V.F. Ivanov, A. Ros Barcel, M.G. Roig, V.L. Shnyrov, R.B. van Huystee, I.N. Kurochkin, A.Kh. Vorobiev, I.Yu .

Sakharov. Synthesis of conducting polyelectrolyte complexes of polyaniline and poly(2-acrylamido-2-methyl-1-propane)sulfonic acid catalysed by pH-stable palm tree peroxidase. Biomacromolecules, 2005, 6, 1360-1366 .

4. A.V. Caramyshev, Y.N. Firsova, E.A. Slastya, A.A. Tagaev, N.V. Potapenko, E.S. Lobakova, O.Yu. Pletjushkina, I.Yu.. Sakharov. Purification and characterization of Windmill Palm Tree peroxidase. J.Agric.Food Chem., 2006, 54 (26), 9888-9894 .

5. A.V. Karamyshev, A.Ch. Vorobiev, J.J. Castillo Leon, I.Yu. Sakharov. Plant peroxidases as catalysts in synthesis of polyanilines. Proc. I Intern. Symр .

Biotechnology – state of the art and prospects of development, Moscow, Russia, October 14 -18, 2002, С.6.21 .

6. I.Yu. Sakharov, A.V. Karamyshev, I.V. Ouporov, A.Kh. Vorobiev, A.I .

Yaropolov, M.G. Roig, J.J. Castillo Leon. Enzymatic synthesis of polyelectrolyte complexes of conducing polyaniline. Proc. II Intern. Symр. Biotechnology – state of the art and prospects of development, Moscow, Russia, November 10 v.2, p.190-191

7. A.V. Caramyshev, I.Yu. Sakharov. Palm tree peroxidase-catalyzed synthesis of chiral and conducting polyaniline. Proc. 1 European Chemistry Congress, Polymer architecture – from structure to functional control, Budapest, Hungary, 27-31 August 2006, M-OC-85, p. 288

8. A.V. Caramyshev, V.M. Lobachev, I.Yu. Sakharov. Peroxidase-catalyzed synthesis of chiral polyaniline in presence of achiral surfactant. Proc. Conference EUROBIC8, Aveiro, Portugal, 1-6 July 2006, PS7.15

9. I.Yu. Sakharov, V.M. Lobachov, V.M. Makarov, A.V. Caramyshev. Enzymatic synthesis of chiral polyaniline. Proc. IV Intern. Symр. Biotechnology – state of the art and prospects of development, Moscow, Russia, March 12 -16, 2007, v.2, p.246




Похожие работы:

«Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Московский государственный юридический университет имени О.Е. Кутафина (МГЮА)" ПРОГРАММА кандидатского экзамена по специальности 12.00.06 – "Земельное право; природоресурсное право; экологическое право; аграрное право" Настоящая програм...»

«Всесибирская олимпиада по БИОЛОГИИ 2014-15. Третий (заключительный) этап. 10-11 кл. Стр.1 из 8 Всесибирская олимпиада по биологии 2014-15. Третий этап 9 марта 2015 10-11 класс Время выполнения задания – 4 часа Часть 1. Задания на сопоставление и по рисункам.1. Ткани растений. (7 баллов)....»

«1 Муниципальное общеобразовательное учреждение "Октябрьская средняя общеобразовательная школа" Муниципального района "Ферзиковский район" Калужской области "Утверждаю" Директор МОУ "Октябрьская СОШ" Вор...»

«Микроэлементы в медицине 15(4): 822 ПРОБЛЕМНАЯ СТАТЬЯ СПЕКТРОМЕТРИЯ ПЛАЗМЫ С ЛАЗЕРНОЙ АБЛЯЦИЕЙ И ВОЗБУЖДЕНИЕМ ЭМИССИОННЫХ СПЕКТРОВ (СПЛАВ, LIPS, LIBS) В ЭКОЛОГИИ, БИОЛОГИИ И МЕДИЦИНЕ (ОБЗОР) А.В. Аграфенин 1*, П.В. Безрукова 2 Научно-исследовательский и учебно-методи...»

«СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ БИОЛОГИЯ, 2017, том 52, 2, с. 274-281 УДК 636.1:591.463.1:57.086.8 doi: 10.15389/agrobiology.2017.2.274rus СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ УЛЬТРАСТРУКТУРЫ СПЕРМАТОЗОИДОВ В ЭПИДИДИМАЛЬНОЙ, ЭЯКУЛИРОВАННОЙ И КРИОКОНСЕРВИРОВАННОЙ СПЕРМЕ ЖЕРЕБЦОВ М.М. АТРОЩЕНКО1, В.В. КАЛАШНИКОВ1...»

«Содержание 1 Перечень компетенций с указанием этапов их формирования в процессе освоения ОПОП..3 2 Описание показателей и критериев оценивания компетенций на различных этапах их формирования, описание шкал оценивания.5 3 Типовые контрольные задания и...»

«013385 Область техники Настоящее изобретение относится к устройствам и способам для удаления целевых агентов из образца. В частности, настоящее изобретение относится к удалению патогенов из биологическ...»

«Министерство сельского хозяйства РФ Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Мичуринский государственный аграрный университет" Кафедра биологии растений и селекции...»






 
2018 www.lit.i-docx.ru - «Бесплатная электронная библиотека - различные публикации»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.