WWW.LIT.I-DOCX.RU
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - различные публикации
 

«Щеголев Алексей Юрьевич Потенцирование NO-зависимой активации растворимой гуанилатциклазы ...»

На правах рукописи

Щеголев Алексей Юрьевич

Потенцирование NO-зависимой активации

растворимой гуанилатциклазы

03.01.04 – биохимия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Москва

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук

Научно-исследовательском институте биомедицинской химии имени

В.Н.Ореховича РАМН, Москва

Научный руководитель

доктор биологических наук И. С. Северина

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, заслуженный деятель наук РФ, профессор И.Я. Конь доктор медицинских наук, профессор В. Л. Козельцев .

Ведущее учреждение: Российский государственный медицинский университет .

Защита диссертации состоится «21» мая 2010 г. в 14.00 на заседании диссертационного совета Д 212.203.13 при ГОУ ВПО «Российский университет дружбы народов»

по адресу: 117198, Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 8 .

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Российского университета дружбы народов по адресу: 117198, Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 6 .

Автореферат разослан «____» _________ 2010 г .

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, профессор Е.В.Лукашева

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы Одним из значительных открытий последних лет, имеющих фундаментальное значение и позволивших по-новому подойти к пониманию молекулярных основ ряда физиологических процессов в клетке, является открытие оксида азота (NO) и установление его роли в регуляции различных физиологических и биохимических процессов (Нобелевская премия в области физиологии и медицины, 1998 г) .

Эндогенный оксид азота (NO) образуется из L-аргинина под действием L-аргинин-NO-синтазы. NO участвует в процессах нейротрансмиссии, является цитотоксическим агентом и мощным фактором гемостаза. Он ингибирует агрегацию тромбоцитов и рассматривается в настоящее время как эндогенный вазодилататор. Антиагрегантные свойства и сосудорасширяющее действие оксида азота связаны с активацией растворимой гуанилатциклазы и накоплением циклического 3,5-гуанозинмонофосфата (цГМФ). Таким образом, можно говорить о существовании внутриклеточной сигнальной системы: оксид азота – растворимая гуанилатциклаза – цГМФ. Важная роль повсеместно распространенной сигнальной системы: NO – растворимая гуанилатциклаза – цГМФ в функции клеток, нарушение активности этой системы при многих патологических состояниях (гипертония, астма, сепсис, септический шок, злокачественные новообразования) требуют создания препаратов, которые бы направленно регулировали активность этой системы и таким образом устраняли бы возникшие нарушения. Подобные модуляторы активности гуанилатциклазы не только способствовали бы выяснению физиологической значимости этого фермента, но и, что не менее существенно, могли бы использоваться в качестве терапевтических средств .

Наиболее известными лекарственными препаратами, которые долгие годы используются для лечения сердечно-сосудистых заболеваний: стенокардии, тяжелых форм гипертонии, комплексного лечения инфаркта миокарда и сердечной недостаточности и связанных с недостаточностью образования эндогенного оксида азота, являются органические нитраты (нитроглицерин, изосорбитдинитрат и др .





). Однако механизм действия этих соединений был установлен только в конце 70-х годов, когда было обнаружено, что в результате их метаболизма образуется оксид азота, активирующий растворимую гуанилатциклазу, что приводит к накоплению цГМФ. Последний активирует цГМФ-зависимые протеинкинзы, а также кальций зависимую АТФ-азу, участвующих в дефосфорилировании легких цепей миозина, что приводит к выходу ионов кальция из мышечных волокон и в конечном итоге к вазодилатации. Использование данных лекарственных средств ограничивается возникновением ряда побочных эффектов при их продолжительном применении, в том числе развитием толерантности. В связи с этим поиск соединений, способных активировать гуанилатциклазу по NO-независимому механизму, представлял бы значительный интерес и мог бы способствовать появлению новых эффективных лекарственных средств для лечения сердечно-сосудистых заболеваний .

Таким соединением оказался YC–1 (3-(5-оксиметил-2-фурил)-1-бензил индазол), который является не только NO-независимым активатором фермента, но и усиливает активацию фермента донорами оксида азота. В присутствии YC–1 и донора оксида азота наблюдается (в зависимости от концентрации соединений) аддитивное или синергичное усиление активации фермента. Этот эффект имеет большое фармакотерапевтическое и физиологическое значение. Использование соединений, аналогичных по своему действию YC–1, позволило бы значительно снижать дозы нитровазодилятаторов без снижения эффективности их лечебного действия. Это в свою очередь снизило бы возникновение нежелательных побочных эффектов, в том числе развитие толерантности при их длительном применении. В последнее время обращается особое внимание на возможность существования эндогенных соединений, аналогичных по своему действию YC–1 .

Известно, что YC-1 усиливает NO-зависимую активацию гуанилатциклазы и при физиологических концентрациях оксида азота и таким образом повышает эффективность эндогенного NO в проявлении своих физиологических эффектов .

В связи с этим выявление эндогенных соединений, аналогичных по своему действию YC-1, заслуживает особого внимания. Однако, данные о них пока отсутствуют .

Цель исследования – выявление, изучение и анализ соединений, способных усиливать активацию растворимой гуанилатциклазы донорами оксида азота .

Задачи исследования:

Были изучены следующие группы соединений:

1. Производные протопорфирина IX: (2,4-ди –(1-метоксиэтил)дейтеропорфирин IX) - димегин и гематопорфирин .

2. Полиамины (путресцин, спермидин, спермин)

3. Производные изатина (эндогенного индола): 5-нитроизатин и арбидол (противовирусный препарат)

4. Лекарственные средства: антибиотики – левомицетин и тетрациклин и противовирусный препарат – оксолин .

Научная новизна В представленной работе впервые были выявлены и исследованы соединения эндогенной природы, обладающие способностью YC-1, синергично усиливать NO-зависимую активацию гуанилатциклазы .

Такими соединениями оказались производные протопорфирина IX – гематопорфирин IX и полиамины (путресцин, спермидин, спермин). Полученные результаты впервые указывают на новый биохимический эффект этих соединений, который позволит более глубоко понять их специфические, биологические функции. Помимо использованных эндогенных соединений, способных аналогично YC-1 усиливать стимуляцию гуанилатциклазы NO-донорами, аналогичной способностью обладали и некоторые фармакологические средства: антивирусные препараты – арбидол и оксолин и антибиотики – левомицетин и тетрациклин. Факт проявления этими соединениями способности синергично усиливать NO-зависимую активацию гуанилатциклазы имеет большое фармакотерапевтическое значение. Все изученные лекарственные препараты широко используются в медицинской практике. Как правило, лечение ими достаточно продолжительно. Поэтому, вполне возможно возникновение дополнительных эффектов, связанных с резким усилением NO-зависимой активации растворимой гуанилатциклазы. Последнее обстоятельство следует принимать во внимание .

Научно-практическая значимость исследования Представленные в настоящей работе данные о способности соединений, как эндогенной природы, так и являющихся лекарственными препаратами, усиливать (аналогично YC-1) стимуляцию растворимой гуанилатциклазы NO-донорами, являются актуальными и представляют значительный интерес не только в плане широких энзимологических исследований, но и для решения задач практической медицины. Использование соединений, аналогичных по своему действию YC–1, позволит значительно снижать дозы нитровазодилятаторов без снижения эффективности их лечебного действия. Это, в свою очередь, снизит возможность возникновения нежелательных побочных эффектов, в том числе и развитие толерантности при их длительном применении. А также будет способствовать созданию новых, более эффективных лекарственных средств. В связи с этим, поиск, изучение и внедрение в медицинскую практику соединений, способных усиливать активацию гуанилатциклазы NO-донорами, представляет значительный интерес .

Апробация работы .

Диссертация обсуждена 15 марта 2010 г. на совместной конференции лабораторий: биохимии аминов и циклических нуклеотидов; биохимии и химической патологии белков; синтеза физиологически активных соединений;

нанобиоэлектрохимии Учреждения Российской академии медицинских наук Научно-исследовательского института биомедицинской химии имени В.Н.Ореховича РАМН .

Результаты работы неоднократно докладывались и обсуждались на ежегодных научных конференциях молодых ученых (2007, 2008, 2009), проводимых в Институте биомедицинской химии РАМН .

Публикации .

По материалам диссертации опубликовано 5 статей в научных журналах .

Структура и объем диссертации .

Диссертационная работа изложена на 101 странице, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов, их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, включающего 120 источников, из них 15 отечественных и 105 зарубежных. Диссертация содержит 23 рисунка и 4 таблицы .

Материалы и методы исследования Объект исследования .

В качестве источника растворимой гуанилатциклазы использовали тромбоциты человека. В этих клетках гуанилатциклаза представлена на 95 % растворимой формой и характеризуется высокой активностью .

Выделение тромбоцитов из крови человека .

Тромбоциты выделяли из венозной крови доноров при комнатной температуре; в качестве антикоагулянта использовали 3,8%-раствор цитрата натрия трехзамещенного в соотношении с кровью 1:10 по объему. Кровь центрифугировали 10 минут при 450 g, обогащенную тромбоцитами плазму наслаивали на равный объем Ficoll-Paque (“Pharmacia”, Швеция) и центрифугировали минут при Осадок тромбоцитов, 30 650 g .

сконцентрированный на границе раздела фаз, отбирали, ресуспендировали в равном объеме 50 мМ Трис-HCl-буфера (pH 7,6), содержащего 150 мМ NaCl и 5 мМ ЭДТА, и центрифугировали 15 минут при 1500 g. Осадок тромбоцитов ресуспендировали в 2 мл указанного буфера и центрифугировали 10 минут при 800 g; процедуру повторяли дважды. Окончательный осадок тромбоцитов ресуспендировали в 1,5 мл холодного (4°С) 50 мМ Трис-HCl-буфера (pH 7,6), содержащего ДТТ (0,2 мМ). Проводили микроскопический контроль чистоты выделяемых тромбоцитов; присутствия других форменных элементов крови не обнаружено .

Выделение растворимой гуанилатциклазы .

Суспензию отмытых тромбоцитов разрушали на ультразвуковом дезинтеграторе MSE 5 – 78 (Великобритания) в течение 20 секунд при амплитуде 16 мкм. Процедуру проводили на холоду, температура в озвучиваемой пробе не должна превышать 4 °С. В результате происходило разрушение мембран тромбоцитов и выход цитозольного содержимого тромбоцитов в раствор .

Разрушенные тромбоциты центрифугировали в течение 1 часа при 105 000 g (при 4°С) на ультрацентрифуге Beckman Optima LE 90-K. Супернатант отбирали и использовали в качестве ферментного препарата растворимой гуанилатциклазы .

Ферментный препарат использовали сразу после его получения. Белок определяли по методу Bradford .

Проведение ферментативной реакции .

Пробы (общий объем 150 мкл) содержали 50 мМ Tris-HCl буфер (pH 7,6), 1 мМ ГТФ, 4 мМ MgCl2, 4 мМ креатинфосфат, 20мкг креатинфосфокиназы, 10 мМ теофиллин (10 мМ концентрация теофиллина была достаточна для полного торможения активности фосфодиэстеразы тромбоцитов человека), 20 мкг супернатанта 105 000 g (по белку) и исследуемые соединения в требуемых концентрациях. Ферментативную реакцию проводили при 37°С в водяном термостате в течение 15 минут. Реакцию останавливали помещением проб в кипящую водяную баню, с последующим охлаждением во льду и удалением денатурированного белка центрифугированием (10 минут при 1500 g). В полученном супернатанте определяли активность гуанилатциклазы по количеству цГМФ, образовавшегося в ходе ферментативной реакции методом иммуноферментного анализа. Иммуноферментный анализ проводили с использованием набора реактивов для количественного определения цГМФ фирмы (ООО ”Медицина. Аналитика. Ветеринария”, Россия). Активность гуанилатциклазы выражали в пмоль ферментативно образовавшегося цГМФ за 1 минуту инкубации на 1 мг белка .

Результаты исследования Из литературных данных известно, что протопорфирин IX (ПП) – предшественник гема является активатором фермента. Мы исследовали некоторые производные протопорфирина IX - димегин и гематопорфирин (ГП) действие которых на систему оксид азота – растворимая гуанилатциклаза – цГМФ ранее не изучалось .

Химические структуры использованных производных ПП представлены ниже:

–  –  –

Примечание. Приведены средние значения из 4-5 независимых экспериментов. (+ средние стандартные отклонения). Во всех случаях ошибка средней 10%. Базальная активность гуанилатциклазы равна 76+ 6 пмоль цГМФ/мг белка/мин .

* - стимулированная нитропруссидом натрия активность рГЦ (пмоль цГМФ/мг белка/мин) ** - арифметическая сумма отдельных активностей рГЦ .

*** - влияние - отношение стимулированной активности к арифметической сумме .

Следует отметить, что в отличие от синергичного усиления нитропруссидной активации в присутствии димегина и ГП, стимулирующие эффекты нитропруссида натрия и ПП были аддитивны (табл.2). Аддитивность наблюдается также и при инкубации гуанилатциклазы с YC-1 и ПП. Полагают, что в основе механизма этого явления лежит стабилизация активной конформации белка. Таблица 2 показывает, что димегин и ГП тормозили (на 32 ± 2 и 30 ± 2 %, соответственно) активацию гуанилатциклазы ПП, что указывает на конкурентные отношения между этими соединениями и ПП и на возможность взаимодействия (хотя бы частичного) с теми же участками фермента, с которыми связывается и ПП .

Несмотря на то, что димегин и ГП вызывают синергичное усиление NOзависимой активации гуанилатциклазы, как и YC-1, а ПП такой способностью не обладает, объяснить этот факт особенностями химических структур этих соединений пока не представляется возможным. Тем не менее, впервые выявленная способность производных протопорфирина IX, обладающих эндогенной природой, синергично усиливать активацию гуанилатциклазы NOдонорами указывают на новый биохимический эффект этих соединений. Этот факт может иметь большое фармакотерапевтическое и физиологическое значение и его следует принимать во внимание .

Таблица 2. Влияние димегина (5мкМ), гематопорфирина IХ (5 мкМ), нитропруссида натрия (НН) (10 мкМ) и YC-1 (3 мкМ) на активацию растворимой гуанилатциклазы (рГЦ) протопорфирином IX (5 мкМ) .

–  –  –

Примечание. Приведены средние значения из четырех независимых экспериментов (+ средние стандартные отклонения). Во всех случаях ошибка средней 10%. Базальная активность гуанилатциклазы равна 70+ 5 пмоль цГМФ/мг белка/мин .

* - стимулированная нитропруссидом натрия активность рГЦ (пмоль цГМФ/мг белка/мин) ** - арифметическая сумма отдельных активностей рГЦ .

*** - влияние - отношение стимулированной активности к арифметической сумме .

Недавно выяснилось, что сигнальная система NO - растворимая гуанилатциклаза – цГМФ, участвует в регуляции пролиферативных процессов в клетке. Было показано, что аллостерический активатор растворимой гуанилатциклазы YC-1 и 8-бром-цГМФ (проникающий в клетки аналог цГМФ) защищают клетки от апоптических стимулов, а, следовательно, и их гибели. С другой стороны, ингибитор растворимой гуанилатциклазы ODQ (1-Н[1,2,4]оксадиазоло[4,3-]хиноксалин-1) вызывает значительное усиление каспазной активности и способствует гибели опухолевых клеток. Более того, было показано, что уровень цГМФ в плазме нелеченых больных раком значительно выше, чем у здоровых людей, и он нормализуется при ремиссии. Другими словами, увеличение уровня цГМФ может способствовать развитию пролиферативных процессов в клетке. Действительно, в литературе имеется достаточное количество литературных данных, указывающих на определенную роль цГМФ в пролиферативных процессах в клетке. Известно, что важную роль в процессах роста и деления клеток приписывают и полиаминам, которые, как ранее было показано, активировали растворимую гуанилатциклазу в культурах клеток сердца и повышали уровень цГМФ. Эти данные дают основание предположить участие сигнальной системы NO – растворимая гуанилатциклаза – цГМФ в пролиферативных процессах в клетке и вовлечение этой системы в реализацию эффектов полиаминов. Поэтому мы исследовали влияние полиаминов на функционирование системы NO - растворимая гуанилатциклаза – цГМФ .

Как видно из таблицы 3, все использованные полиамины оказались активаторами фермента, увеличивая базальную активность последнего примерно одинаково: в 1,2; 1,9; 1,6 раз в опытах с путресцином, спермидином и спермином, соответственно .

Таблица 3. Влияние путресцина (100 мкМ), спермидина (100 мкМ) и спермина(100 мкМ) на активацию растворимой гуанилатциклазы (рГЦ) тромбоцитов человека нитропруссидом натрия (НН, 10 мкМ), YC-1 (3 мкМ) и на синергизм активации фермента нитропруссидом натрия (10 мкМ) в присутствии YC-1 (3мкМ) .

Стимулированная Влияние*** Соединения и добавки активность * Сумма ** %

–  –  –

Примечание. Приведены средние значения из четырех независимых экспериментов (+ средние стандартные отклонения). Во всех случаях ошибка средней 10%. Базальная активность гуанилатциклазы равна 101+ 13 пмоль цГМФ/мг белка/мин .

* - стимулированная нитропруссидом натрия активность рГЦ (пмоль цГМФ/мг белка/мин) ** - арифметическая сумма отдельных активностей рГЦ .

*** - влияние - отношение стимулированной активности к арифметической сумме .

Использованные полиамины при инкубировании (по отдельности) с ферментом и нитропруссидом натрия потенцировали активацию гуанилатциклазы использованным NO-донором (нитропруссидом натрия) .

Путресцин и спермин вызывали аддитивный эффект. В опытах со спермидином наблюдалось даже синергичное усиление нитропруссидной активации до 136 % (таблица 3). Эти данные показывают, что полиамины (по отдельности) и нитропруссид натрия действуют независимо на два разных участка фермента .

Следовательно, механизм активации гуанилатциклазы полиаминами является NO – независимым. Путресцин, спермидин и спермин примерно одинаково тормозили активацию растворимой гуанилатциклазы YC-1 (на 36, 54 и 47 % соответственно), а также снижали увеличенную активацию фермента нитропруссидом натрия в присутствии YC-1 (на 68, 71 и 65 % соответственно), что указывает на конкурентные отношения между YC-1 и полиаминами .

Механизм активации полиаминами активности гуанилатциклазы пока остается невыясненным, однако, было отмечено, что полиамины повышают сродство растворимой гуанилатциклазы к субстрату, так же как и Vmax. Кроме того, они, по-видимому, могут замещать катион металла, который является кофактором фермента. Таким образом, механизм активации фермента полиаминами может быть связан с их взаимодействием с катионным участком активного центра гуанилатциклазы. Следует отметить, что наибольшим сродством к катионному участку обладает спермидин. Каков механизм выявленного нами потенцирующего влияния полиаминов на NO-зависимую активацию растворимой гуанилатциклазы пока неизвестно. Однако, учитывая способность полиаминов тормозить активацию гуанилатциклазы YC-1 и снижать увеличенную в присутствии YC-1 стимуляцию фермента нитропруссидом натрия (что указывает на конкурентные отношения между полиаминами и YC-1), можно предположить, что полиамины взаимодействуют, хотя бы частично с теми же участками в аллостерическом центре гуанилатциклазы, с которыми взаимодействует и YC-1 .

Выявленная нами способность полиаминов (путресцина, спермидина, спермина) потенцировать и синергично усиливать (по аналогии с YC-1, хотя и менее эффективно) NO-зависимую активацию растворимой гуанилатциклазы указывает на новый биохимический эффект этих соединений, который необходимо принимать во внимание, особенно, учитывая эндогенную природу этих соединений .

Еще одним соединением эндогенной природы является изатин. Изатин эндогенный индол, обнаруженный у млекопитающих в мозге, различных органах и тканях и биологических жидкостях. Изатин и его метаболиты входят в состав различных природных веществ, являются компонентами многих синтетических соединений, обладающих широким спектром эффектов, включая антивирусные, противоопухолевые, антибактериальные. Некоторые производные изатина являются ингибиторами апоптоза, антиконвульсантами, проявляют антивирусную и антигрибковую активности. Поскольку молекула изатина входит в состав многих лекарственных препаратов, возможность конкуренции последних с эндогенным изатином может влиять на эффективность их лечебного действия .

Нами было исследовано влияние и арбидола 5-нитроизатина (противовирусного препарата) на активность растворимой гуанилатциклазы тромбоцитов человека. 5-нитроизатин является простейшим производным изатина. К этому же классу соединений следует отнести и арбидол, который содержит в своем составе индольное кольцо, составляющее основу молекулы изатина .

Химические структуры соединений приведены ниже:

–  –  –

Представленные в настоящей работе данные впервые демонстрируют, что 5нитроизатин и арбидол в диапазоне концентраций 0,1 – 10 мкМ не влияли на базальную активность растворимой гуанилатциклазы, но потенцировали активацию фермента нитропруссидом натрия. Рисунок 1 показывает, что оба использованных соединения потенцировали активацию фермента нитропруссидом натрия. Наибольшее усиление индуцированной нитропруссидом натрия стимуляции гуанилатциклазы достигалось в присутствии 10 мкМ концентраций 5-нитроизатина и арбидола. Поскольку нитропруссид натрия не является прямым донором NO, мы исследовали влияние использованных соединений в 10 мкМ концентрации на стимуляцию гуанилатциклазы прямым NO-донором – спермин NONO- в диапазоне концентраций последнего от 1 до 20 мкМ .

Рис. 1. Влияние увеличивающихся концентраций 5-нитроизатина и арбидола на активность растворимой гуанилатциклазы (рГЦ) тромбоцитов человека, стимулированную нитропруссидом натрия (НН) .

Примечание. Стимулированная НН (10 мкм) активность рГЦ в присутствии увеличивающихся концентраций 5-нитроизатина () и арбидола ().

Ордината:

стимулированная НН (10) мкМ активность рГЦ (пмоль цГМФ/мг/мин). Абсцисса:

концентрации соединений (5-нитроизатина и арбидола(мкМ)). Базальная активность равна 105 ± 5, стимулированная НН (10 мкМ) - 743 ± 52 пмоль цГМФ/мг/мин. Приведены средние значения из 3-х независимых экспериментов (± средние стандартные отклонения) .

5-нитроизатин и арбидол синергично усиливали индуцированную спермин NONO активацию гуанилатциклазы с интенсивностью того же порядка, что и в опытах с YC-1 (см. рис.2а). Известно, что основным действием YC-1 является повышение чувствительности фермента к NO, что приводит к сдвигу влево кривой зависимости активации гуанилатциклазы от концентрации NOдонора .

Также как и YC-1, 5-нитроизатин и арбидол вызывали сдвиг влево концентрационно зависимой кривой активации спермин NONO (уменьшение величины EC50 – концентрации, равной половине, вызывающей наибольшее стимулирование активности) (см. рис.2а). Величины EC50 в присутствии YC-1 снижались с 7,5 мкМ (без YC-1) до 3,0 мкМ, а в опытах с 5-нитроизатином и арбидолом – до 3,0 и 2,0 мкМ, соответственно (см. рис.2б) .

В то же время 5-нитроизатин и арбидол не влияли на интенсивность синергичного усиления индуцированной спермин NONO активации гуанилатциклазы в присутствии YC-1 (см. рис.3а). Величины EC50 для спермин NONO в присутствии YC-1 были равны 3,4 мкМ, а после добавления 5нитроизатина и арбидола - 3,6 и 3,4 мкМ, соответственно (см. рис.3б) .

Рис. 2 а и б. Влияние 5-нитроизатина и арбидола на стимуляцию растворимой гуанилатциклазы (рГЦ) тромбоцитов человека спермин NONO .

–  –  –

Примечание. Рис.2а: Увеличивающиеся концентрации NO-донора, спермин NONO, в отсутствии (•) и в присутствии YC-1 () (3мкМ), 5-нитроизатина () и арбидола () (по 10 мкМ). Ордината: стимулированная спермин NONO активность рГЦ (пмоль цГМФ/мг/мин) .

Абсцисса: концентрации спермин NONO (мкМ). Базальная активность равна 120 ± 10 (пмоль цГМФ/мг/мин). Приведены средние значения из 3-х независимых экспериментов (± средние стандартные отклонения). Рис.2б: Изменение величин EC50 кривых зависимости активации гуанилатциклазы от концентрации спермин NONO в отсутствии (•) и после добавления (по отдельности) YC-1 () (3мкм), 5-нитроизатина () и арбидола () (по 10 мкМ). Ордината % максимальной активности. Абсцисса: концентрации спермин NONO (мкМ). Приведены средние значения из 3-х независимых экспериментов (± средние стандартные отклонения) .

Следовательно, 5-нитроизатин и арбидол не конкурировали с YC-1 за связывание, хотя бы частичное, с тем же аллостерическим центром гуанилатциклазы, с которым взаимодействует YC-1 .

–  –  –

Примечание. Рис.3а: Увеличивающиеся концентрации NO-донора, спермин NONO в отсутствии (•) и в присутствии 3мкМ YC-1 () или 3 мкМ YC-1 после добавления 5нитроизатина () или арбидола () (по 10 мкм). Ордината: стимулированная спермин NONO активность рГЦ (пмоль цГМФ/мг/мин). Абсцисса: концентрации спермин NONO (мкМ) .

Базальная активность равна 120 ± 10 (пмоль цГМФ/мг/мин). Приведены средние значения из 3-х независимых экспериментов (± средние стандартные отклонения). Рис. 3б: Изменение величин EC50 кривых зависимости активации гуанилатциклазы от концентрации спермин NONO в отсутствии (•) и в присутствии 3 мкМ YC-1 (), или 3 мкМ YC-1 после добавления 5нитроизатина () и арбидола () (по 10 мкМ). Ордината: % максимальной активности .

Абсцисса: концентрации спермин NONO (мкМ). Приведены средние значения из 3-х независимых экспериментов (± средние стандартные отклонения) .

Выше было отмечено, что изатин является составной частью различных природных соединений, обладающих широким спектром эффектов, а также входит в состав многих лекарственных препаратов. Вполне возможна конкуренция последних с эндогенным изатином, которая может влиять на эффективность их лечебного действия. Однако, в наших опытах добавленный изатин практически не изменял ни интенсивности синергичного усиления индуцированной спермин NONO активации гуанилатциклазы в присутствии 5нитроизатина и арбидола (рис.4а) и не влиял на сдвиг влево соответствующих концентрационно зависимых кривых (рис.4б) .

Рис. 4 а и б. Влияние изатина на потенцирование индуцированной спермин NONO активации растворимой гуанилатциклазы (рГЦ) тромбоцитов человека в присутствии 5-нитроизатина и арбидола .

а б Примечание. Рис.4а: Увеличивающиеся концентрации NO-донора, спермин NONO, в отсутствии (•) и в присутствии 5-нитроизатина () или 5-нитроизатина после добавления изатина () и арбидола () или арбидола после добавления изатина () (по 10 мкМ) .

Ордината: стимулированная спермин NONO активность рГЦ (пмоль цГМФ/мг/мин) .

Базальная активность равна 57 ± 4 (пмоль цГМФ/мг/мин). Приведены средние значения из 3-х независимых экспериментов (± средние стандартные отклонения). Рис.4б: Сравнение величин EC50 кривых зависимости активации гуанилатциклазы от концентрации спермин NONO в отсутствии (•) и в присутствии 5-нитроизатина () или 5-нитроизатина после добавления изатина (); арбидола () или арбидола после добавления изатина () (по 10 мкМ). Ордината: % максимальной активности. Абсцисса: концентрация спермин NONO (мкМ). Приведены средние значения из 3-х независимых экспериментов (± средние стандартные отклонения) .

Величины EC50 для спермин NONO без и в присутствии (по отдельности) 5нитроизатина и арбидола (по 10 мкМ) равны 7,35; 3,8; 4,2 мкМ, а после добавления изатина (10 мкМ) - 4,2 и 5,0 мкМ, соответственно (см. рис.4б). Эти данные указывают на отсутствие конкуренции между изатином и 5нитроизатином и арбидолом .

Выявленное нами отсутствие конкуренции между арбидолом и изатином позволяет предположить, что эндогенный изатин не будет влиять на регуляцию NO-стимулированной гуанилатциклазы фармакологическими препаратами, содержащими модифицированное изатиновое кольцо. Роль арбидола в функционировании сигнальной системы NO – растворимая гуанилатциклаза – цГМФ неизвестна. Несмотря на то, что арбидол действует на уровне клеточных мембран и препятствует проникновению вирусов в клетку, он тем не менее достаточно быстро адсорбируется, распределяется по органам и тканям и обнаруживается в плазме крови. Следовательно, он может взаимодействовать с растворимой гуанилатциклазой. Длительное лечение арбидолом может привести к возникновению дополнительных эффектов, связанных с усилением NOзависимой активации гуанилатциклазы, на которое следует обращать внимание .

В последнее время в литературе появляется все больше сообщений о вовлечении системы оксид азота – растворимая гуанилатциклаза – цГМФ (прямо или косвенно) в терапевтическое действие некоторых известных лекарств .

Астма и другие воспалительные процессы в дыхательных путях характеризуются избыточным образованием оксида азота. Это обусловлено повышением экспрессии индуцибельной NO-синтазы, резким увеличением активности растворимой гуанилатциклазы и накоплением цГМФ. В качестве лечебного средства при таких заболеваниях наиболее широко и успешно используется муколитический препарат амброксол (лазолван). Ранее было показано, что амброксол является ингибитором растворимой NO-зависимым гуанилатциклазы. Подобные сведения имеют важное значение для создания новых эффективных лекарственных препаратов, а также для уточнения (а возможно, и пересмотра) существующих представлений о механизме терапевтического действия ряда известных лекарств .

Так, впервые было показано, что сигнальная система NO-растворимая гуанилатциклаза-цГМФ может быть вовлечена в механизм действия таких широко используемых препаратов, как химиотерапевтические средства: метронидазол (1-(2-оксиэтил)метил-имидазол) и антипротозойный препарат – нитазол (5-ацетиламино-5нитротиазол). Эти соединения генерируют оксид азота, активируют растворимую гуанилатциклазу и вызывают накопление цГМФ. Одновременно, было установлено, что соединения понижают артериальное давление у гипертензивных крыс с выраженным гипотензивным эффектом, характерным для нитросорбитмононитрата. Полученные результаты пока не позволяют пересмотреть принятые в настоящее время механизмы терапевтического действия этих лекарственных средств. Однако, несомненно, что эти данные необходимо принимать во внимание при оценке эффективности противомикробного действия этих лекарственных средств, возможном возникновении побочных эффектов, а также при направленном создании подобных лекарств нового поколения .

В настоящей работе мы исследовали влияние антибиотиков левомицетина и тетрациклина и противовирусного препарата оксолина на сигнальную систему оксид азота – растворимая гуанилатциклаза – цГМФ. Перечисленные препараты широко используются в медицинской практике, однако, возможность их действия на сигнальную систему оксид азота – растворимая гуанилатциклаза – цГМФ не была изучена до настоящего времени. Левомицетин – синтетический антибиотик широкого спектра действия, он хорошо проникает в органы и жидкости организма, где и может взаимодействовать с гуанилатциклазой .

Тетрациклин также является антибиотиком широкого спектра действия и быстро проникает во многие органы и ткани организма. Оксолин обладает противовирусной активностью .

Левомицетин, тетрациклин и оксолин в диапазоне концентраций 0,1 – 10 мкМ не влияли на базальную активность растворимой гуанилатциклазы тромбоцитов человека. Рисунок 5 показывает, что все исследованные соединения потенцировали активацию фермента нитропруссидом натрия (10 мкМ) .

Наибольшее усиление индуцированной нитропруссидом натрия активации гуанилатциклазы достигалось в присутствии 10 мкМ концентраций левомицетина, тетрациклина и оксолина. Поскольку нитропруссид натрия не является прямым донором NO, мы исследовали влияние использованных соединений в 10 мкМ концентрации на стимуляцию гуанилатциклазы спермин NONO в диапазоне концентраций последнего от 1 до 20 мкМ. Рисунок 6а показывает, что все исследованные соединения синергично усиливали (аналогично YC-1) индуцированную спермин NONO активацию растворимой гуанилатциклазы. При этом наиболее сильным активатором фермента оказался оксолин .

Рис.5. Влияние увеличивающихся концентраций левомецитина, тетрациклина и оксолина на активность растворимой гуанилатциклазы (рГц) тромбоцитов человека стимулированную нитропруссидом натрия (НН) .

Примечание. Стимулированная НН (10 мкМ) активность рГЦ в присутствии увеличивающихся концентраций левомецитина (), тетрациклина () и оксолина () (по 10 мкМ). Ордината: стимулированная НН (10 мкМ) активность рГЦ (пмоль цГМФ/мг/мин) .

Абсцисса: концентрация препаратов (левомецитина, тетрациклина, оксолина). Базальная активность равна 107 ± 5, стимулированная НН (10 мкМ) – 1887 ± 132 (пмоль цГМФ/мг/мин) .

Приведены средние значения из 3-х независимых экспериментов (± средние стандартные отклонения) .

Как видно из рис. 6 б в случае левомицетина, тетрациклина и оксолина сдвига влево концентрационно зависимой кривой не наблюдалось. Величины EC50 для спермин NONO без и в присутствии (по отдельности) левомицетина, тетрациклина и оксолина (по 10 мкМ) равны 6,0; 6,0; 5,5 и 5,0 мкМ, соответственно. То есть соединения эффективно стимулировали NO-зависимую активацию фермента, синергично усиливая вызванную спермин NONO активацию гуанилатциклазы. Рисунок 7а показывает, что интенсивность синергичного усиления индуцированной спермин NONO активации гуанилатциклазы в присутствии YC-1 (3мкМ) или YC-1 (3мкМ) после добавления (по отдельности) левомицетина, тетрациклина и оксолина практически одна и та же; т.е. добавление этих соединений не изменяет величины потенцирующего влияния YC-1 на активацию фермента NO-донором .

Эти соединения не влияли и на сдвиг влево кривой зависимости активации гуанилатциклазы от концентрации спермин NONO в присутствии YC-1 (3мкМ) (см. рис.7б). Величины EC50 для спермин NONO без и в присутствии YC-1 (3мкМ) равнялись 7,5 и 2,5 мкМ, а при добавлении (по отдельности) левомицетина, тетрациклина и оксолина (по 10 мкМ) эти величины составляли 2,1; 2,2 и 1,6 мкМ, соответственно (рис.7б). То есть все использованные препараты не конкурировали с YC-1 при взаимодействии с ферментом .

Рис. 6 а и б. Влияние левомицетина, тетрациклина и оксолина на стимуляцию растворимой гуанилатциклазы (рГЦ) тромбоцитов человека спермин NONO .

Примечание. Рис.6а: Увеличивающиеся концентрации NO-донора спермин NONO в отсутствии (•) и в присутствии левомицетина (),тетрациклина () и оксолина () (по 10 мкМ). Ордината: стимулированная спермин NONO активность рГЦ (пмоль цГМФ/мг/мин) .

Абсцисса: концентрация спермин NONO в пробе (мкМ). Базальная активность гуанилатциклазы равна 123 ± 10 (пмоль цГМФ/мг/мин). Приведены средние значения из 3-х независимых экспериментов (± средние стандартные отклонения). Рис. 6б: Сравнение величин EC50 кривых зависимости активации гуанилатциклазы от концентрации спермин NONO в отсутствии (•) и после добавления левомицетина (), тетрациклина () и оксолина () (по 10 мкМ). Ордината: % максимальной активности. Абсцисса: концентрация спермин NONO в пробе (мкМ). Приведены средние значения из 3-х независимых экспериментов (± средние стандартные отклонения) .

Отсутствие конкурентных отношений между YC-1 и использованными препаратами исключает возможность взаимодействия левомецитина, тетрациклина и оксолина (хотя бы частично) с тем же аллостерическим центром фермента, с которым связывается YC-1. Химические структуры препаратов различаются между собой и отличаются от структуры YC-1 .

Рис. 7 а и б. Влияние левомицетина, тетрациклина и оксолина на потенцирование индуцированной спермин NONO стимуляции растворимой гуанилатциклазы (рГЦ) тромбоцитов человека в присутствии YC-1 .

Примечание. Рис.7а: Увеличивающиеся концентрации NO-донора спермин NONO в отсутствии (•) и в присутствии 3 мкМ YC-1 () или 3 мкМ YC-1 после добавления левомицетина (),тетрациклина () или оксолина () (по 10 мкМ).

Ордината:

стимулированная спермин NONO активность рГЦ (пмоль цГМФ/мг/мин). Базальная активность гуанилатциклазы равна 94 ± 8 (пмоль цГМФ/мг/мин). Приведены средние значения из 3-х независимых экспериментов (± средние стандартные отклонения). Рис.7б:

Изменение величин EC50 концентрационно зависимых кривых индуцированной спермин NONO стимуляции рГЦ в отсутствии (•) и в присутствии 3 мкМ YC-1 () или 3 мкМ YC-1 после добавления левомицетина (),тетрациклина () и оксолина () (по 10 мкМ).

Ордината:

% стимулированной активности. Абсцисса: концентрация спермин NONO в пробе (мкМ) .

Приведены средние значения из 3-х независимых экспериментов (± средние стандартные отклонения) .

Считается общепринятым, что в основе механизма антибактериального действия левомицетина и тетрациклина лежит подавление ими биосинтеза белка микробной клетки. Обнаруженная в настоящей работе способность этих препаратов синергично усиливать (аналогично YC-1) NO-зависимую активацию растворимой гуанилатциклазы указывает на новый биохимический эффект этих соединений. Поскольку лечение этими лекарственными средствами, как правило, достаточно продолжительно, можно предположить возможность возникновения дополнительных эффектов, связанных с резким усилением NOзависимой активации гуанилатциклазы. Последнее необходимо принимать во внимание .

Выводы

1) Димегин и гематопорфирин активировали фермент. Соединения не конкурировали с YC-1, но вызывали синергичное усиление активации фермента донором NO, что впервые указывало на их новый биохимический эффект .

2) Полиамины увеличивали активность фермента. Соединения потенцировали NO-зависимую активацию фермента: путресцин и спермин вызывали аддитивный эффект, а спермидин синергично усиливал стимуляцию гуанилатциклазы нитропруссидом натрия. Выявленные конкурентные отношения между полиаминами и YC-1 указывали на то, что механизм потенцирующего влияния полиаминов может быть связан с возможностью их взаимодействия с теми же участками фермента, с которыми взаимодействует YC-1 .

3) Производные изатина: 5-нитроизатин и арбидол не влияли на базальную активность гуанилатциклазы, но синергично усиливали индуцированную NOдонорами активацию фермента. 5-нитроизатин и арбидол не конкурировали с YC-1, что исключает возможность их взаимодействия с теми же участками, с которыми взаимодействует YC-1. В наших опытах изатин не конкурировал с 5нитроизатином и арбидолом .

4) Лекарственные средства: левомецитин, тетрациклин и оксолин не влияли на базальную активность гуанилатциклазы, синергично усиливали индуцированную активацию фермента. Использованные препараты не NO-донором конкурировали с YC-1, что исключало возможность их взаимодействия с теми же участками фермента, с которыми взаимодействует YC-1 .

Исследования проведены при финансовой поддержке РФФИ (грант 05-04-48577)

–  –  –

1a. I.S. Severina, N.V. Pyatakova, A.Yu. Shchegolev, G.V. Ponomarev. YC-1 – like potentiation of NO-dependent activation of soluble guanylate cyclase by derivates of protoporphyrin IX // Biochemistry (Moscow).-2006.-71, (3), 340-344 .

2. И.С. Северина, Н.В. Пятакова, А.Ю. Щеголев. Потенцирование NO-зависимой активации растворимой гуанилатциклазы полиаминами // Биомедицинская химия.-2007.-53, (1), 44-49 .

2а. I.S. Severina, N.V. Pyatakova, A.Yu. Shchegolev. Potentiation of NO-dependent activation of soluble guanylate cyclase by polyamines // Biochemistry (Moscow) Supplement Series B Biomedical Chemistry.-2007.-1,(3), 254-257 .

3. И.С. Северина, Н.В. Пятакова, А.Ю. Щеголев, Т.А. Сидорова. YC-1 – аналогичное потенцирование активации растворимой NO-зависимой гуанилатциклазы адренохромом. Биомедицинская химия.- 2008.- 54, (6), 679а. I.S. Severina, N.V. Pyatakova, A.Yu. Shchegolev, T.A. Sidorova. YC-1 – like potentiation of NO-dependent activation of soluble guanylate cyclase by adrenochrome // Biochemistry (Moscow) Supplement Series B Biomedical Chemistry.-2009.-3, (1), 44-47 .

4. А.Ю. Щеголев, Т.А. Сидорова, И.С. Северина. Потенцирование NO-зависимой активации растворимой гуанилатциклазы левомицетином, тетрациклином и оксолином // Биомедицинская химия.-2009.-55, (3), 331-337 .

5. В.В.Бахаров, А.А. Гидаспов, Е.В. Переседова, В.Г. Граник, Н.Б. Григорьев, И.С. Северина, А.Ю. Щеголев, А.Б. Шереметьев. 1,3,5-триазиннитроловые кислоты. Синтез и NO-генерирующая способность. Известия Академии наук, серия химическая, 2009, (9), 1900 -1910 .

А.Ю. Щеголев Данные, представленные в настоящей работе, впервые показывают, что производные ПП (димегин и гематопорфирин) синергично усиливают активацию растворимой гуанилатциклазы (рГЦ) NO-донором. Этот факт указывает на новый биохимический эффект этих соединений, который может иметь важное значение. Было изучено влияние полиаминов (путресцина, спермидина, спермина) на систему NO- рГЦ-цГМФ. Все полиамины потенцировали активацию NO-донором. Этот факт указывает на новый биохимический эффект этих соединений, который необходимо принимать во внимание, особенно учитывая эндогенную природу полиаминов. Было изучено влияние производных изатина (5-нитроизатина и арбидола) на активацию рГЦ NO-донорами. Эти соединения синергично усиливали (аналогично YC–1) активацию фермента NOдонорами. Этот факт указывает на новый биохимический эффект этих соединений, который может иметь важное значение. Было изучено влияние антибиотиков левомицетина и тетрациклина и противовирусного препарата оксолина на систему NO-рГЦ-цГМФ. Все препараты синергично усиливали (аналогично YC–1) активацию фермента NO-донорами. Выявленные регуляторные свойства левомицетина, тетрациклина и оксолина синергично увеличивать NO-зависимую активацию рГЦ могут указывать на дополнительные фармакологические эффекты, которые могут возникать при продолжительном лечении данными лекарственными средствами .

A.Yu. Schegolev The data presented here demonstrate for the first time that the derivates of PTP (dimegin and haematophorphyryn) produce a synergistic effect on the activation of soluble guanylate cyclase (sGC) by NO-donor. This fact represent a new biochemical effect of these compounds that may have important significance. The influence of polyamines (putrescine, spermidine, spermine) on the NO-sGC-cGMP system was investigated. All polyamines used potentiated the sGC activation by NOdonor. This fact represent a new biochemical effect of these compounds, which should be taken into consideration, especially due to the endogenous nature of polyamines .

The influence of derivates of isatin (5-nitroisatin and arbidol) on activation of sGC by NO-donors was investigated. These compounds synergistically increased (similar to YC–1) activation of the enzyme by NO-donors. This fact represent a new biochemical effect of these compounds that may have important significance. The influence of antibiotics laevomycetin and tetracycline and the antivirus agent oxolin on the NOsGC-cGMP system was investigated. All preparations used synergistically increased (similar to YC–1) activation of the enzyme by NO-donors. The revealed regulatory properties of laevomycetin, tetracycline and oxolin to increase synergistically NOdependent activation of sGC may cause additional pharmacological effects during prolong treatment by these drugs .




Похожие работы:

«БИОЛОГИЯ УДК 631 ВЛИЯНИЕ ЗАГРЯЗНЕНИЯ КАДМИЕМ НА ФЕРМЕНТАТИВНУЮ АКТИВНОСТЬ ЧЕРНОЗЕМА ОБЫКНОВЕННОГО © Е. И. Новоселова*, С. А. Башкатов Башкирский государственный университет Россия, Республика Башкортостан, 450076 г. Уфа, ул. Заки Валиди, 32. *Email: novoselova58@mail.ru В работе приведены эксперименталь...»

«ЧЕРЕПАНОВ Геннадий  Олегович ПАНЦИРЬ ЧЕРЕПАХ: ПРОИСХОЖДЕНИЕ  И  РАЗВИТИЕ  В  ОНТОИ  ФИЛОГЕНЕЗЕ 03.00.08-зоология Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических  наук Санкт-Петербург Работа выполнена на кафедре зоологии...»

«ГРУНТОВЕДЕНИЕ БИОТЕХНОЛОГИИ В ИНЖЕНЕРНОЙ ГЕОЛОГИИ BIOTECHNOLOGIES IN ENGINEERING GEOLOGY MAKSIMOVICH N.G. МАКСИМОВИЧ Н.Г. Head of the Laboratory of Technogenic Processes Geology and deputy Заведующий лабораторией...»

«ISSN 0207-4591 TARTU RIIKLIKU LIKOOLI OIMETISED УЧЕНЫЕ ЗАПИСКИ ТАРТУСКОГО ГОСУДАРСТВЕННОГО УНИВЕРСИТЕТА ACTA ET COMMENTATIONES UNI VERSITATIS TARTUENSIS СОЗРЕВАНИЕ ООЦИТОВ, ОПЛОДОТВОРЕНИЕ И ЭМБРИОНАЛЬНОЕ РАЗВИТИЕ КОСТИСТЫХ РЫБ Труды по зоологии TARTU Illil 198 5 RIIKLIKU LIKOOLI TOIMETISED TARTU УЧЕНЫЕ ЗАПИСКИ ТАРТУСКО...»

«Содержание 1 Перечень компетенций с указанием этапов их формирования в процессе освоения ОПОП..3 2 Описание показателей и критериев оценивания компетенций на различных этапах их формирования, описание шкал оценивания.5 3 Типовые контрольные задания или иные материалы...»

«Академия наук СССР Дальневосточное отделение Биолого-почвенный институт АМУРО-УССУРИЙСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ ВСЕСОЮЗНОГО ОРНИТОЛОГИЧЕСКОГО ОБЩЕСТВА ЖУРАВЛИ ПАЛЕАРКТИКИ (Биология, морфология, распространение) СБОРНИК НАУЧНЫХ ТРУДОВ Отв. редакторы Н. М. Литви...»

«Том 9, №2 (март апрель 2017) Интернет-журнал "НАУКОВЕДЕНИЕ" publishing@naukovedenie.ru http://naukovedenie.ru Интернет-журнал "Науковедение" ISSN 2223-5167 http://naukovedenie.ru/ Том 9, №2 (2017) http://naukovedenie.ru/vol9-...»

«Анкета Поручителя/Поручителя-супруга/Поручителя-участника/ Залогодателя по ипотечному кредиту1 (принимается Банком только с одновременным оформлением приложений к Анкете) Приложение к Приказу от 03.09.2010 №847 Ф.И.О. полностью: Пол: м...»






 
2018 www.lit.i-docx.ru - «Бесплатная электронная библиотека - различные публикации»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.