WWW.LIT.I-DOCX.RU
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - различные публикации
 

Pages:     | 1 ||

«Артюхов Александр Анатольевич Сшитые гидрогели поливинилового спирта и их биомедицинское применение ...»

-- [ Страница 2 ] --

Внутренние органы. Печень, почки и селезёнка не отличаются по гистологической структуре от контроля. Число купферовских клеток в печени увеличено в той же степени, как и в других группах этой серии .

Срок 3 месяца .

4 группа – макропористый полимерный гидрогель ПВС/ГЭК=90/10 А Б

–  –  –

У одного животного на месте губки видна соединительная ткань, многочисленные мелкие фрагменты оксифильной и субстанции и немногочисленные участки базофильной зернистой субстанции. Видны многочисленные гигантские клетки и макрофаги, резорбирующие имплантат (Рисунок 109А). В этой ткани остаются лишь небольшие участки ячеистой структуры. У двух других животных в области имплантации обнаружен только лимфоузел, а сам имплантат не обнаружен вследствие полной резорбции. В лимфоузле отмечается заметная гиперплазия лимфоидных фолликулов, выраженная плазматизация (увеличение числа плазматических клеток) и повышенное содержание макрофагов с зернистостью в цитоплазме, что свидетельствует о фагоцитозе имплантированного материала (Рисунок 109Б) .

Внутренние органы. Отсутствуют отличия от контроля в структуре и клеточном составе печени, почек и селезёнки кроме повышенного количества купферовских клеток в печени .

5 группа – макропористый полимерный гидрогель ПВС/ГЭК=25/75 Имплантат при макроскопическом изучении не обнаружен у всех трёх животных. У двух животных взята уплотнённая жировая ткань, в которой гистологически отмечается умеренной полнокровие сосудов и отдельные лимфо-макрофагальные инфильтраты. У третьего животного взят лимфоузел с гиперплазированными лимфоидными фолликулами, на периферии которых, отмечается увеличение числа плазматических клеток и макрофагов .

Внутренние органы не показывают каких-либо отличий от контроля .

6 группа –макропористый полимерный гидрогель ПВС/ГЭК=50/50 У всех трёх животных не обнаружен подкожный имплантат. В двух случаях взята жировая клетчатка с небольшими лимфо-макрофагальными инфильтратами. У третьего животного была взята мышечная ткань без какихлибо изменений .

Внутренние органы: отсутствуют какие-либо изменения по сравнению с другими животными этой серии .

Таким образом, можно констатировать, что реакция организма экспериментальных животных на введение образцов разработанных материалов заключалась на начальных стадиях в минимальной воспалительной тканевой реакции, при этом отсутствовала нейтрофильная инфильтрация и макрофагальная реакция в окружающей ткани, формировалась тонкая соединительно-тканная капсула, что свидетельствует о сравнительной биоинертности материалов .

На последующих стадиях имела место биодеградация имплантированных образцов материалов за счёт прорастания в них соединительной ткани и макрофагальной резорбции, а также вследствие бесклеточного лизиса непроращенной части имплантата .

Изучение внутренних органов после имплантации не обнаружило видимых отличий от контрольной группы за исключением незначительного увеличения числа купферовских клеток в печени. Купферовские клетки, как макрофаги, реагируют на мельчайшие частицы имплантированного материала, попадающие в печень. Всё это говорит об отсутствии заметной токсичности материалов .

Таким образом, результаты патоморфологических исследований подтверждают результаты физиологических, гематологических, биохимических, не выявивших отрицательного воздействия на организм подопытных животных .

Полученные данные свидетельствуют об отсутствии заметной токсичности исследуемых материалов и позволяют утверждать об их пригодности для использования в качестве основы для изделий медицинского назначения различных типов, в том числе контактирующих с кровью и внутренними средами организма .





3.3.3 Исследование токсичности гидрогелей на основе ПВС дополнительно содержащих заряженные группы 3.3.3.1 Исследование цитотоксичности гидрогелей на основе ПВС дополнительно содержащих заряженные группы Поскольку одной из основных рассматриваемых областей применения макропористых гидрогелей на основе поливинилового спирта, содержащего заряженные группы являлось использование их в качестве 3D-матриксов для выращивания клеток, для оценки их токсичности использовались стандартные методики экстракт- и контакт-тестов. Данные исследования проводились совместно с ИБХ РАН (лаборатория полимеров для биологии, руководитель проф. Е.А.Марквичева). В качестве клеточной модели была использована линия мышиных фибробластов (L929). Количество жизнеспособных клеток определяли при помощи метода МТТ, в основе которого лежит способность митохондриальных и цитоплазматических дегидрогеназ живых клеток восстанавливать краситель МТТ с образованием формазана, количество которого может быть легко определено с использованием методов спектрофотометрии .

Далее приведены результаты, полученные при проведении экстракттестов (Рисунок 110). Как можно видеть, все гидрогели, содержащие ионогенные звенья, проявляли значительную токсичность на ранних этапах культивирования. При этом, токсичность, которую демонстрировали гидрогели, содержащие звенья акриловой кислоты, была более заметной .

Рисунок 110 - Результаты экстракт-тестов для гидрогелей различного состава .

(Монослой клеток, культивированный в отсутствие вытяжек (контроль) принят за 100 %) При более длительных сроках культивирования обнаруживаемая образцами гидрогелей токсичность значительно снижалась. Как можно видеть ниже (Рисунок 110), на 8-й день инкубирования в культурах, к которым были добавлены вытяжки из образцов полимерных гидрогелей, процент выживших клеток был близок к контролю .

Полученные данные явно свидетельствовали о факте наличия в объеме изученных образцов токсикантов, которые вызывали массовую гибель клеток на начальных этапах культивирования. В силу того, что при получении образцов гидрогелей проводилась их тщательная отмывка, качество которой оценивалась посредством контроля оптической плотности промывных вод в интервале длин волн 190-240 нм, в котором расположены характерные полосы поглощения функциональных групп используемых мономеров, можно было предположить, что наиболее вероятной причиной появления токсичных соединений являлась термодеструкция образцов в процессе паровой стерилизации перед проведением тестов .

В рамках проверки данного предположения в нескольких циклах «стерилизация-отмывка» изучалась оптическая плотность и pH среды вытяжек из образцов гидрогелей, помимо этого проводился и контроль изменения массы образцов .

Было выявлено, что в вытяжки из образцов обоих типов после проведения стерилизации обнаруживали поглощение в УФ-области спектра, а величина их pH для образцов, содержащих кислотные группы, находилась в кислотной, а для образцов с аминогруппами, соответственно, щелочной области .

Причем, и поглощение и изменение pH вытяжки увеличивались с ростом содержания заряженных групп в составе образцов гидрогелей, но при этом для гидрогелей, содержащих звенья акриловой кислоты, данный эффект был выражен более ярко. Более явно выражена была и потеря массы образцами при стерилизации. Так, например, если для содержащих аминогруппы образцов, потеря массы составляла от 1 до 3 %, в зависимости от содержания звеньев низкомолекулярного сомономера, то гидрогелей, имеющие в своем составе звенья акриловой кислоты, теряли от 1 до 7,5 % веса .

Наличием продуктов термодеструкции, выделяющихся из объема образцов гидрогелей, объясняется значительная цитотоксичность, продемонстрированная образцами также и в проведенных контакт-тестах .

Как можно видеть на рисунке, приведенном ниже (Рисунок 111), образцы на протяжении достаточно длительного срока сохраняли значительную токсичность, что, по-видимому, объясняется как с существенно более высоким, по сравнению с экстракт-тестом, содержанием, поступающих в культуральную среду токсикантов - продуктов термодеструкции, так и возможным пролонгированием их выделения из объема гидрогеля. Как и следовало ожидать, токсичность образцов возрастала с ростом содержания в них звеньев низкомолекулярных сомономеров, что, очевидно, связано с ростом количества токсичных продуктов, образующихся при стерилизации .

Рисунок 111 - Результаты контакт-тестов для гидрогелей различного состава .

(Монослой клеток, культивированный в отсутствие гидрогелей (контроль) принят за 100 %) На основании полученных данных был сделан вывод о необходимости введения стадии дополнительной отмывки гидрогелей после термической стерилизации, либо использовании альтернативных более мягких методов стерилизации .

Как можно видеть из представленных ниже выборочных данных экстракт-тестов (Рисунок 112), проведенных для образцов, которые были отмыты после стерилизации, выживаемость клеток для всех образцов, вне зависимости от их состава, был близок к аналогичному показателю контроля .

Результаты, полученные при проведении контакт-тестов образцов гидрогелей, приведены в последующих главах настоящей работы .

Рисунок 112 - Результаты экстракт-тестов для гидрогелей различного состава после отмывки .

(Монослой клеток, культивированный в отсутствие вытяжек (контроль) принят за 100 %) Таким образом, можно утверждать, что разработанные полимерные гидрогели на основе поливинилового спирта в случае использования мягких условий стерилизации, либо дополнительной отмывки перед применением характеризуются сравнительно низкой цитотоксичностью и потенциально могут быть использованы в качестве основы матриксов для выращивания клеток и тканей .

3.3.3.2 Изучение хронической токсичности полимерных гидрогелей ПВС дополнительно содержащих заряженные группы С целью изучения хронической токсичности и реакции тканей на введение синтезированных макропористых гидрогелей различного состава были проведены эксперименты по имплантации образцов гидрогелей различного состава. В качестве экспериментальных животных выступали нелинейные белых половозрелые крысы. Образцы гидрогели имплантировались в мышечные ткани экспериментальных животных. Забор материала для изучения осуществлялся на 7, 21 сутки и спустя 2,3,4,6 месяцев, соответственно .

Материалом для гистологических и гистохимических исследований служили изъятые из места имплантации образцы мышечной ткани. Пример типичных микрофотографий гистологических препаратов приведен ниже (Рисунок 113) .

В результате изучения полученных биологических материалов было установлено, что при имплантации образцов для гидрогелей всех составов на ранних сроках (7 дней, 21 день) (Рисунок 113А) было характерно развитие воспалительная реакции грануляционного характера с образованием фиброзной капсулы без рубцевания .

На гистологических препаратах можно видеть поперечно-полосатую мышечную ткань с явлениями отека, очагами фиброзной ткани со структурами геля и очаговыми кровоизлияниями в этой зоне, а также большое количество новообразованных сосудов капиллярного типа, полнокровных сосудов, единичные гигантские многоядерные клетки инородных тел и выраженную диффузно-очаговую лимфоидную инфильтрацию, представленную зрелыми лимфоцитами в виде очаговых скоплений .

При фенотипировании клеточный состав стромальной инфильтрации представлен зрелыми Т- (60-70%) и В-лимфоцитами (30-40%). Реакция с антителами к CD45, CD 3, CD15, CD20 при иммуногистохимическом анализе для всех образцов положительна .

А Б В Г Д Е Рисунок 113 - Примеры микрофотографий гистологических препаратов (А – гидрогель, содержащий 5 % АК, 28 дней, окраска по Ван-Гизону, Б – гидрогель, содержащий 5 % АК, 2 месяца, окраска гематоксилинэозином, В- гидрогель, содержащий 5 % АК, 2 месяца, окраска по ВанГизону, Г- гидрогель, содержащий 2,5 % ДЭАЭМА, 3 месяца, окраска по Ван-Гизону, Д - гидрогель, содержащий 15 % ДЭАЭМА, 3 месяца, окраска по Ван-Гизону, Е - гидрогель, содержащий 5 % АК, 5 месяцев, окраска гематоксилин-эозином) При этом, как этого и следовало ожидать, степень развитости наблюдавшейся воспалительной реакции, о которой можно судить по величине отека, толщине и строению фиброзной капсулы и количеству лимфоцитов, для образцов различного строения была различна .

Интенсивность воспалительной реакции возрастала с ростом количества звеньев низкомолекулярного сомономера в составе гидрогеля. Причем, для гидрогелей содержащих звенья диэтиламиноэтилметакрилата эта зависимость была более выражена, нежели для гидрогелей со звеньями акриловой кислоты, что видно из приведенных зависимостей (Рисунок 114) .

Рисунок 114 - Зависимость степени выраженности воспалительной реакции на имплантаты различного состава

–  –  –

микроскопическом исследовании полученных на этих сроках имплантации гистологических препаратов можно было обнаружить фрагменты гидрогелевого материала, распределенных в объеме новообразовавшихся тканей (Рисунок 113) .

При этом, при имплантации гидрогелей, содержащих отрицательные заряженные группы, либо не вообще не содержащих ионогенных групп, на месте замещенного имплантата преимущественно, обнаруживалась, поперечно-полосатая скелетная мускулатура и рыхлая соединительная ткань .

В случае же имплантации гидрогелей, содержащих в своем составе более 5 % звеньев ДЭАЭМА, наблюдалось образование плотной соединительной ткани .

Данный факт может объясняться как повышенной, по сравнению с реакцией на остальные образцы, воспалительной реакцией, так и какими-либо специфическими аспектами взаимодействия тканей организма с вводимыми материалами, что требует более детального изучения .

При иммуногистохимическом анализе реакция с антителами к CD45, CD15, CD3, CD20 для всех образцов, кроме образцов, содержащих большое число звеньев ДЭАЭМА, не обнаруживалась .

Таким образом, на основании полученных данных можно утверждать, что разработанные полимерные гидрогели, содержащие ионогенные группы, в целом, характеризуются достаточной биосовместимостью и способностью к биодеградации с замещением собственными тканями организма. При этом скорость процесса биодеградации и тип и морфология тканей, образующихся в области имплантата, определяется химическим составом полимерных гидрогелей .

3.3.4 Оценка влияния состава и структуры полимерных гидрогелей на скорость их биодеградации .

При проведении экспериментов по имплантации образцов макропористых полимерных гидрогелей на основе поливинилового спирта экспериментальным животным, описанных нами ранее, было установлено, что биодеградация этого типа материалов происходит за счёт биодеградации под действием макрофагов после прорастания в них соединительной ткани .

Причем, динамика деградации изотропных гидрогелей заметно уступает динамике биодеградации макропористых образцов. Последний факт в сочетании с отсутствием заметного бесклеточного лизиса непророщенной части имплантата может свидетельствовать о значимом влиянии степени развитости пористой структуры гидрогеля, определяющей доступность его внутреннего объема для растущих тканей, на процесс его биодеградации .

С целью проверки данного предположения был проведен эксперимент по изучению динамики биодеградации образцов полимерных гидрогелей с различной пористостью .

Эксперимент проводили на беспородных крысах-самцах. Под общим наркозом скальпелем рассекалась предварительно обритая кожа на обеих задних лапах крысы с внутренней стороны. После рассечения фасций, производилась резекция мышечной ткани пинцетом и имплантация образца гидрогеля. Мышцы и кожа зашивалась Z-образно биодеградирующим шовным материалом «Викрил» (Vicryl 3.0). Размер имплантированных образцов (цилиндры диаметром 0,7 мм и длиной 1 см) значительно превосходил размер образцов, использованных при изучении хронической токсичности гидрогелевых материалов, что должно было обеспечить большую продолжительность процесса биодеградации имплантата .

Из эксперимента животные выводились спустя 1,2,3,4,6 месяцев путём передозировки хлороформом (по 5 особей из группы). Материалом для гистологических исследований служили образцы мышечной ткани, изъятые из места имплантации .

Посредством бинокуляра с малым увеличением (4,5) с помощью цифровой камеры получали фотоизображения полученных гистологических препаратов поперечных срезов, которые затем анализировали на компьютере с использованием планиметрической программы UTHSCSA Image Tool .

Определяли площадь имплантата и площадь замещенной части имплантата .

Данные по каждому имплантату усреднялись .

Как можно видеть из приведенной зависимости (Рисунок 115), степень развитости пористой структуры очевидным образом влияла на динамику биодеградации имплантированных образцов - с ростом общей пористости и среднего размера динамика изменения размера имплантированного образца снижалась .

Рисунок 115 – Динамика изменения размеров имплантированных образцов гидрогелей с различным размером пор Таким образом, изменяя пористую структуру полимерных гидрогелей, определяемую условиями проведения процесса гелеобразования, можно в определенной степени влиять на характер их поведения при контакте с внутренними средами организма. Однако стоит отметить, что, к сожалению, интервал, в котором может изменяться скорость биодеградации разработанных гидрогелей на основе поливинилового спирта, сравнительно узок, а сроки биодеградации достаточно велики для целого ряда практических задач .

В силу этого, как это упоминалось ранее, нами были разработаны полимерные гидрогели на основе поливинилового спирта и 2гидроксиэтилкрахмала. В этом случае наличие фазы гидроксиэтилкрахмала, характеризующегося способностью к бесклеточному лизису должно было увеличивать скорость биодеградации таких гидрогелей по сравнению с материалами на основе «чистого» поливинилового спирта .

Данное предположение было подтверждено в рамках при проведении имплантационных экспериментов в рамках изучения хронической токсичности подобных полимерных гидрогелей .

С целью более детального изучения данной зависимости был проведен эксперимент по изучению динамики биодеградации образцов полимерных гидрогелей различного состава было проведено исследование аналогичное описанному в данном разделе выше .

Эксперимент также проводили на беспородных крысах-самцах. Под общим наркозом скальпелем рассекалась предварительно обритая кожа на обеих задних лапах крысы с внутренней стороны. После рассечения фасций, производилась резекция мышечной ткани пинцетом и имплантация образца гидрогеля. Из эксперимента животные выводились спустя 1,2,3,4,6 месяцев .

–  –  –

Полученные экспериментальные данные приведены на диаграмме выше (Рисунок 116). Как можно видеть даже небольшое количество введенного в состав гидрогеля гидроксиэтилкрахмала приводит к заметному ускорению биодеградации введенного имплантата. Данный факт, очевидно, связан с ускорением фрагментирования образца вследствие ферментативного бесклеточного лизиса участков ГЭК, упрощающим биодеструкцию материала макрофагами и гигантскими клетками инородного тела .

0 2,5 % 5% 15 % мольн. АК Размер имплантата, %

–  –  –

Ускорение биодеградации полимерных гидрогелей, как это было показано в предыдущем разделе, наблюдалось и при введении в их состав звеньев акриловой кислоты (Рисунок 117) и диэтиламиноэтилметакрилата (Рисунок 118). Как можно видеть, и в данном случае даже при сравнительно небольшом изменении состава гидрогелей удавалось наблюдать заметное ускорение его биодеградации .

Однако, в отличие от материалов, содержащих 2-гидроксиэтилкрахмал, «заряженные» гидрогели вызывали достаточно сильную воспалительную реакцию, возрастающую по мере роста содержаний звеньев акриловой кислоты и ДЭАЭМА (Рисунок 113). Данный факт, очевидно, в заметной степени снижает спектр возможных применений подобных материалов в изделиях, контактирующих с внутренними средами организма .

3.3.5 Изучение возможности применения полимерных гидрогелей в качестве основы для выращивания клеток и тканей .

Отсутствие заметной токсичности и способности к биодеградации, продемонстрированные образцами полученных полимерных гидрогелей делает их привлекательными с позиций использования в качестве основы для матриксов для выращивания клеток и тканей .

В силу этого нами было проведено исследование взаимодействия образцов разработанных макропористых гидрогелей с культурами клеток различных типов. На первом этапе проводилось изучение макропористых гидрогелей на основе «чистого» поливинилового спирта (работы проводились совместно с НИИ СП им. Н.В. Склифосовского под руководством профессора Голдина М.М.)

Для исследования использовали следующие типы клеток:

линия диплоидных клеток эмбриона человека (ЛДКЧ);

фибробласты кожи кадавера (ФКК);

перевиваемая линия клеток тимуса поросенка (ЛПК тимуса поросенка);

клетки эмбриональной печени человека (КЭПЧ) .

Во всех случаях при контакте с культурами клеток образцы исследуемых гидрогелевых материалов не проявляли признаков заметной токсичности: клетки сохраняли прозрачность, четкую очерченность, имели характерную для культур морфологию, не содержали включений .

Структурная целостность клеток тестируемых культур не претерпевала видимых изменений на протяжении всего срока культивирования (в качестве примера приведены фотографии культуры ЛДКЧ через 7 суток культивирования (Рисунок 119)) .

А Б

Рисунок 119 - Витальное окрашивание ЛДКЧ через 7 суток культивирования (1-й пассаж), (А) - культура клеток в отсутствие образцов (контроль), увеличение 400, (Б) - культура клеток в присутствии образцов, увеличение 400 .

Присутствие образцов гидрогелевого материала в культуре практически не влияло на пролиферативную активность клеток (Таблица 28) .

Процесс заселения макропористых гидрогелей клетками ЛДКЧ и ФКК был выражен весьма слабо, на материале изделий не наблюдалось оседания клеток из суспензии при посеве культуры ЛДКЧ и ФКК на планшеты. В результате, в течение 1-х и 2-х суток культивирования все образцы материала изделий не содержали клеток. Появление отдельных клеток на поверхности материала изделий отмечено лишь на 3-4-е сутки после посева (Рисунок 120А-В). Можно предположить, что это обусловлено миграцией

–  –  –

* ФКК - фибробласты кожи кадавера, ЛДКЧ - линия диплоидных клеток эмбриона человека, ЛПК - перевиваемая линия клеток, КЭПЧ - клетки эмбриональной печени человека .

При этом количество прикрепленных на поверхности образцов клеток составило к концу 4 суток 0,01-0,02 тыс./см2, к концу 5-х суток - 0,03-0,04 тыс./см2, к концу 7-х суток - 0,05-0,1 тыс./см2, что указывает на весьма низкую скорость заселения. При этом по истечении 7-х суток популяция фибробластов линии ЛДКЧ и ФКК на поверхности образцов была представлена в виде разрозненных, далеко расположенных друг от друга клеток, что указывает на отсутствие у них пролиферативной активности. На основании этого может быть сделан вывод о том, что в течение эксперимента заселение образцов гидрогелевого материала клеточными компонентами происходило исключительно за счет миграции отдельных клеток .

Б А

–  –  –

Выявленный факт низкой пролиферативной активности, очевидно, может быть обусловлен избыточной гидрофильностью поверхности поливинилового спирта, ведущей к низкой адгезии данных типов клеток на поверхности субстрата, поскольку все клетки на поверхности образцов имели округлую или овальную форму (Рисунок 120Г), не характерную для распластанных фибробластов линии ЛДКЧ и ФКК. Кроме того, отмечалось Г некоторое снижение целостность клеточных мембран (ЦКМ) прикрепленных клеток, которое, впрочем, не выходило за референтные границы нормы .

А Б Рисунок 121 - Выявление клеток тимуса поросенка в составе материала изделий на 5-е сутки культивирования, (А) – увеличение 100, (Б) – увеличение 200 Рисунок 122 - Выявление клеток тимуса поросенка в составе образцов гидрогелевого материала на 5-е сутки культивирования:

ЦКМ = 33,5 баллов (норма 28-42 балла). Увеличение 500 В культуре клеток тимуса поросенка заселение образцов отмечено по истечении суток. На поверхности гидрогелевого материала были выявлены одиночные клетки тимуса поросенка, а также небольших группы по 2-7 клеток (Рисунок 121), что указывает на наличие у них пролиферативной активности. Прикрепленные на материале изделий клетки тимуса поросенка имели характерную для них форму и нормальные значения ЦКМ (Рисунок 122). Вместе с тем, количество прикрепленных клеток в составе образцов не превышало 3 тыс./см2 по истечении 5-ти суток наблюдения и 7,5-8 тыс./см2 – 10 суток, то есть, заселенность образцов клетками всё же была достаточно низкой .

Б А Б А Рисунок 123 – Стволовые клетки печени человека спустя 24 часа на поверхности (А) и в объеме (Б) образца. Окраска гематоксилинэозином В отличие от вышеописанных культур клеток, в эксперименте со стволовыми клетками печени человека через 24 часа культивирования наблюдалось активное прикрепление и концентрирование клеток на поверхности гидрогелевого материала, что подтверждает отсутствие токсичности и указывает на его адгезивные свойства в отношении данного типа клеток. Исследование срезов показало, что по истечении суток культивирования основная масса клеток всё ещё сосредоточена в верхних слоях и на поверхности образцов гидрогелей, хотя отдельные клетки обнаруживаются уже и в объеме образца (Рисунок 123). Клетки на поверхности и в объеме гидрогелевого материала характеризуются фенотипом, свойственным недифференцированным клеткам: крупное ядро окружено узким ободком цитоплазмы .

Б А А Рисунок 124 – Стволовые клетки печени человека спустя 7 суток культивирования .

На протяжении последующей культивации клетки эмбриональной печени человека мигрируют вглубь матрикса (Рисунок 124А), при этом их количество в центральных участках значительно возрастает. Наблюдаемые на 7-е сутки клетки по-прежнему сохраняют фенотип недифференцированных клеток (Рисунок 124Б), а, следовательно, и способность к делению и дифференцированию. К 14-м суткам клетки в плоскости среза распределяются более равномерно .

Следовательно, для клеток эмбриональной печени человека разработанный гидрогелевый материал является адекватным субстратом для их адгезии и локомоции, обладая выраженными матриксными свойствами .

Немаловажным является то факт, что за всё время культивирования клеток не наблюдалось дифференцировки в клетках, заключённых в объеме образца, они сохраняли фенотип, свойственный стволовым клеткам, что свидетельствует о сохранении полипотентности клеточной популяции .

Таким образом, можно утверждать, что разработанные гидрогели поливинилового спирта являются нетоксичным для целого ряда клеточных культур, однако адгезия клеток на их поверхности, как правило, отсутствует, или является недостаточной. В тоже время, для некоторых типов клеток материал демонстрирует неплохие матриксные свойства .

Одним из путей улучшения адгезии и пролиферации клеток на поверхности биоинертных полимерных носителей является изменение их поверхностного заряда посредством введения в их состав заряженных групп, [2782 1]. Внедрение на поверхность носителя заряженных групп 79-28028 обеспечивает наличие необходимых активных участков, вследствие чего становится возможным адсорбция различных биомолекул, первую очередь белков. Существенно, что белки, имея на своей поверхности как положительно, так и отрицательно заряженные группы, могут сорбироваться на поверхности носителей, имеющих различный заряд. Именно через этот слой, адсорбированные клетки взаимодействуют с полимерными поверхностями .

При этом, если для случая модификации поверхности положительно заряженными функциональными группами литературные источники сообщают об однозначном улучшении адгезии и пролиферации клеток [280для случая введения карбоксильных групп на данный момент не существует единого мнения. Ряд исследователей сообщает, что введение карбоксильных групп акриловой кислоты оказывает негативное влияние на клеточную адгезию, пролиферацию и рост клеток [282 -2 284], другие же 83 указывают на то, что носители, содержащие карбоксильные группы демонстрировали улучшение адгезии и пролиферации клеток по сравнению с «исходными» носителями [285-286] .

В рамках настоящей работы изучались как «положительно», так и «отрицательно» заряженные носители, на основе макропористых гидрогелей ПВС дополнительно содержащих функциональные группы диэтиламиноэтилметакрилата и акриловой кислоты, соответственно .

Исследования проводились с использованием культур клеток мышиных фибробластов линии L929 и человеческих мезенхимальных стволовых клеток (МСК) (работы проводились совместно ИБХ РАН, лаборатория полимеров для биологии, руководитель проф. Е.А.Марквичева) .

Клетки высевали на поверхности гидрогелевых носителей и культивировали в течение 1 недели. Для изучения морфологии клеток и их распределения в объеме гидрогелей в процессе культивирования, использовали лазерную сканирующую конфокальную флуоресцентную микроскопию. Для визуализации жизнеспособных клеток образцы перед микроскопическим исследованием обрабатывали с нефлуоресцентным кальцеином AM, который в живых клетках после взаимодействия с внутриклеточными эстеразами превращается в зеленый флуоресцентный кальцеин [287] .

Как можно видеть на приведенных ниже фотографиях (Рисунок 125), по истечении 7 дней культивирования на поверхности всех образцов обнаруживались жизнеспособные клетки. Однако их количество и морфология в значительной степени зависели от состава гидрогелевого материала. В образцах, представляющих собой носители на основе «чистого»

поливинилового спирта, клетки находились преимущественно в составе крупных агрегатов, что еще раз подтверждает сделанный вывод о незначительной адгезии и пролиферации клеток на поверхности таких носителей. Введение же в состав материалов заряженных групп приводило к распластыванию клеток на поверхности носителя и более заметному заселению его клетками .

–  –  –

Рисунок 125 – Конфокальные микрофотографии мышиных фибробластов и мезенхимальных стволовых клеток на полимерных гидрогелях. Срок культивирования 7 дней .

Как можно видеть, введение в состав гидрогеля небольших количеств, заряженных сомономеров приводило к увеличению количества клеток веретенообразной формы, а при дальнейшем увеличении количества заряженных групп имело место их распластывание и закрепление на поверхности носителя. При этом введение звеньев ДЭАЭМАА приводило к более явному эффекту, нежели введение звеньев АК, что особенно заметно для культуры мезенхимальных стволовых клеток. Как можно видеть, распластывание клеток в этом случае наблюдалось лишь на поверхности образцов содержанием звеньев акриловой кислоты порядка 15 мольн. % .

–  –  –

Рисунок 126 – Зависимость роста клеток мышиных фибробластов линии L929 от состава гидрогелей. Время культивирования 7 дней. (За 100% принято количество клеток монослоя, растущих в стандартных условиях) Для количественной оценки роста клеток на разработанных полимерных гидрогелях использовали метод МТТ. Как можно видеть из приведенных зависимостей (Рисунок 126 и Рисунок 127), пролиферация клеток имела место во всех образцах, но ее скорость была различна для использованных в работе типов клеток. Как можно видеть, скорость роста числа клеток зависела от типа, заряженного сомономера и его количества в составе гидрогелевого материала .

Наиболее заметное ускорение роста числа жизнеспособных клеток имело место для гидрогелей, содержащих положительно заряженный ДЭАЭМА, и возрастало по мере роста доли низкомолекулярного сомономера в составе гидрогелей .

–  –  –

Рисунок 127 – Зависимость роста МСК от состава гидрогелей. Время культивирования 7 дней. (За 100% принято количество клеток монослоя, растущих в стандартных условиях) Данный факт, очевидно, связан с продемонстрированным выше улучшением адгезии и клеток на таких полимерных носителях. Для гидрогелей, содержащих звенья акриловой кислоты, улучшение роста клеток было не столь очевидным, что также хорошо соотносится с результатами микроскопических исследований. Тем не менее, и в этом случае имело место ускорение темпов роста клеток по сравнению с гелями на основе «чистого»

поливинилового спирта .

Таким образом, можно утверждать, что введение в состав полимерных гидрогелей поливинилового спирта заряженных групп положительно влияет на поведение клеток при их культивации на поверхности таких гидрогелей, улучшая, в частности их адгезию и распластывание, что является необходимым условием для нормального роста и пролиферации. Данный факт позволяет рассматривать такие полимерные системы как перспективные материалы для создания матриксов для клеточной и тканевой инженерии для определенных типов клеток .

3.3.6 Изучение возможности применения разработанных полимерных гидрогелей для лечения ран и ожогов .

Комплекс демонстрируемых разработанными макропористыми полимерными гидрогелями свойств – развитая пористость, способность к сорбции и удерживанию больших объемов жидкости, биосовместимость, низкая токсичность, пластичность, позволяла сделать предположение о принципиально возможности создания на их основе высокоэффективных раневых покрытий. С целью проверки данного предположения нами была проведена оценка полученных ранее результатов и проведен ряд дополнительных исследований, позволивших проверить данное предположение. (Работы проводились совместно РМАПО РАМН под руководством проф. С.М. Чудных) [288] .

Объектом исследования стали образцы гидрогелей на основе ПВС с оптимальными, на наш взгляд, с позиций рассматриваемой в данном разделе области применения (пористость, распределения пор по размерам, механические свойства и др.) характеристиками (Таблица 29) .

–  –  –

Как было показано ранее, образцы сшитых полимерных гидрогелей, полученные в результате реакций, проведенных в криоусловиях, содержат большое число связанных между собой пор занимающих основную часть объема образца. Объем же, собственно, полимерной гидрогелевой части в таких системах сравнительно мал. Открытая пористая структура таких макропористых гидрогелей делает возможным чрезвычайно быструю сорбцию жидкости в направлении центра высушенной матрицы за счет действия капиллярных сил, что и определяет их быстрое набухание вне зависимости от размера образца (Рисунок 66, страница 118) .

И поскольку разработанные в данной работе гидрогели представляют собой систему, состоящую из плотно сшитого полимерного гидрогелевого каркаса, степень набухания которого невелика и мало изменяется при изменении внешних условий, и системы сообщающихся макропор, в которых находится основная часть поглощаемой макропористым гидрогелем жидкости, они, в отличие от «обычных» непористых изотропных гелей, незначительно изменяют свое равновесное набухание при изменении внешних условий, таких как, например, ионной сила или величина pH раствора (Рисунок 72, страница 123) .

Таким образом, можно предполагать, что эти полимерные материалы должны эффективно сорбировать и удерживать раневой экссудат при их нахождении на ране .

Эффективное раневое покрытие должно обеспечивать оптимальное испарение воды с поверхности раны. Известно, что скорость испарения воды с поверхности неповрежденной кожи составляет порядка 204±12 г/м2/день, а для поврежденной может меняться от 279±19 г/м2/день для ожога первой степени, до 5150±140 г/м2/день для раны на стадии грануляции [289] .

Паропроницаемость раневого покрытия должно быть такова, чтобы препятствовать чрезмерному обезвоживанию раны, но при и этом не допускать накопления экссудата, в силу этого рекомендованным оптимальным значением величины паропроницаемости является значение 2000-2500 г/м2/день [289]. В то же время, стоит указать на тот факт, что наиболее распространенные на рынке перевязочные средства имеют значительно более высокий показатель паропроницаемости: Promogran (Jonson&Jonson, США) – 8357±325, Geliperms (Geistlich, Швейцария) 9009±319, Vigilons (Bard, Великобритания ) 9360±34 г/м2/день [290] .

Рисунок 128 - Потеря влаги образцами гидрогелей .

Для исследованного гидрогелевого материала паропроницаемость составила 2317±242 г/м2/день, таким образом, можно ожидать, что покрытие на его основе будет способно поддерживать требуемый водный баланс в области раны, способствуя необходимой клеточной миграции и ускорению реэпитализации .

Другим требованием, предъявляемым к современным раневым покрытием, является способность находиться на ране во влажном состоянии на протяжении продолжительного времени. В силу нами изучалась потеря гидрогелем воды во времени. Как можно видеть (Рисунок 128), потеря воды с наибольшей скоростью линейно возрастала со временем в первые 12 часов инкубирования, после чего значительно снижалась .

После первого дня инкубации потеря воды составила около 40%, второго- 50 %. Достигнув своего максимума ~70% на 5-6 день, в дальнейшем она почти не изменялась. Соответствующим образом изменялась и скорость испарения: спустя 12 часов потеря воды составляла порядка 17,6 г/м2/ч, спустя сутки 14 г/м2/ч, спустя 2 дня 10,5 г/м2/ч, после чего снизился до 7,6 г/м2/ч .

На основании полученных данных было сделано предположение, что при нахождении на сухой ране разрабатываемый материал будет терять влагу с достаточно большой скоростью, что, возможно может потребовать дополнительного увлажнения, то есть, рассматриваемый гидрогелевый материал будет более полезен для умерено экссудирующих ран .

Изучение закономерностей влияния полимерных гидрогелевых материалов на течение раневого процесса проводилось на примере ожоговой раны. В качестве экспериментальных животных выступали крысы. Животные были разделены на две группы - контрольную (КГ), и экспериментальную (ЭГ) - по 18 животных в каждой группе. В контрольной группе раны крыс покрывали коммерческим раневым покрытием на основе окисленной целлюлозы. Раны площадью 4 см2 наносились под эфирным наркозом в межлопаточной области .

Через 24 часа после нанесения ран у животных обеих групп наблюдалось нарушение целостности эпидермиса, кровоизлияния и отек, дерма была денатурирована и инфильтрирована вместе с поверхностной фасцией макрофагами, лимфоцитами и сегментоядерными лимфоцитами .

Кровеносные сосуды гемоциркуляторного русла (ГМЦР) были наполнены, в большинстве из них имел место стаз форменных элементов .

На третьи сутки в цитограммах животных, входивших в контрольную группу, можно было наблюдать значительное количество клеточного детрита и дегенеративно измененных клеток лейкоцитарного ряда, раны были заполнены гнойно-некротическими массами и омертвевшими тканями. По сравнению с животными контрольной группы, в ранах животных, входивших в экспериментальную группу, наблюдалось меньшее количество лейкоцитов, определялись макрофаги и лимфоциты. Раны этих животных очищались от омертвевших тканей и гнойно-некротических масс, в них начиналось формирование грануляционной ткани. Мазки-отпечатки были характерными для цитограмм регенеративного типа .

Через 7 дней (Рисунок 129) в тканевых структурах ран животных экспериментальной группы практически не наблюдалось отека, а сформировавшаяся грануляционная ткань имела свойственное ей строение и была покрыта эпителием. Площадь самой раны уменьшалась более чем в два раза .

У животных контрольной группы сохранялась отечность тканевых структур вокруг ран, сами раны содержали гнойно-некротические массы, грануляционная ткань лишь начинала формироваться .

А Б Рисунок 129 -Биопсия ожоговой раны с неповрежденным участком кожи, 7-е сутки, увеличение 20, окраска гематоксилин-эозином .

Через 14 суток у крыс ЭГ раны были полностью заполнены новообразованными кожными покровами. Гистологически в границах ран протекали пролиферативные процессы, связанные с формированием характерных для нормальной кожи гистоструктур .

У животных, входящих в КГ, наблюдалась реорганизация грануляционной ткани и эпителизация .

На 21 сутки (Рисунок 130) раны у исследуемых обеих групп животных зажили. Однако у животных ЭГ на местах бывших ран были расположены сформированные кожные покровы с меньшим количеством волос, не возвышавшиеся над окружающей кожей и имевшие идентичный с ней цвет. У животных же, входивших в контрольную группу, на месте ран наблюдалось формирование рубцов бледно-розового цвета, имевших гладкую поверхность, и также не возвышавшихся над уровнем окружающей кожи .

А Б

–  –  –

На основании приведенных выше данных можно утверждать, что у экспериментальных животных в первой (гнойно-некротической фазе) раневого процесса раны ожидаемо характеризовались высокой степенью гидратации как раневых, так и околораневых тканевых структур, сопровождавшейся нарушением локальной гемомикроциркуляции, приведшей к нарушению обменных процессов в области раны. При этом, однако, благодаря наличию у находившегося на поверхности раны макропористого гидрогелевого материала хороших сорбционных свойств, имела место хорошо выраженная дегидратация тканевых структур, сопровождавшаяся элиминацией из области раны токсинов и медиаторов воспалительного процесса .

Во второй фазе раневого процесса (фаза грануляции) раны экспериментальных животных характеризовались отсутствием перифокального отека и гиперимии. Основным заданием лечения в этот период раневого процесса является защита грануляционной ткани от механической травмы, высыхания, профилактика повторного инфицирования и стимуляция регенеративно-репаративных процессов. Использованный гидрогелевый материал полностью отвечал этим требованиям .

В третьей фазе раневого процесса (Рисунок 131) у экспериментальных животных используемый гидрогелевый материал обеспечил реорганизацию грануляционной ткани, направленную на формирование гистоструктур, характерных для нормальной кожи .

А Б Рисунок 131 - Биопсия на месте ожоговой раны, 3 месяца, увеличение 20, А - окраска гематоксилин-эозин, Б- окраска по Ван-Гизону По сравнению с контрольной группой у животных экспериментальной группы реорганизация грануляционной ткани в кожу происходило в 2-2,5 быстрей раза, что приводило к заметному сокращению сроков заживления с 19,27±1,4 у контрольной группы животных, до 9,1±1,1 суток у животных экспериментальной группы .

Все вышеизложенное дало возможность сделать вывод о высокой эффективности исследованного гидрогелевого материала при лечении ран. В силу этого данный материал стал основой для разработанного нами раневого покрытия «ММ-Гель», получившего сертификат соответствия и допущенного для применения на территории Российской Федерации .

В рамках апробации данного раневого покрытия проводилось сравнение его эффективности при лечении хронических ран с традиционными перевязочными средствами (работы проводились на базе ФФМ МГУ им.М.В .

Ломоносова Лесовым Д.Е.). Был проведен анализ результатов лечения 120 пациентов, страдающих хроническими ранами, различной этиологии .

Средний возраст пациентов составлял 50,2 года, при их лечении использовались как раневое покрытие на основе макропористых полимерных гидрогелей ПВС в виде пластин ( ММ-Гель), так и традиционные раневые покрытия, в том числе содержащие сульфадиазин серебра, надифлокацин, повидон иодин, мед. Пациенты с сопутствующими заболеваниями, способными оказывать значимое влияние на течение раневого процесса, такими как неконтролируемый сахарный диабет, хроническая печеночная и почечная недостаточность и прочее в выборку включены не были. Пациенты были разделены на две группы – «гидрогель»-группу и «традиционные»группу, по 60 человек в каждой. Проводился анализ состояния ран (размер, форма, глубина, состояние дна, наличие некротических масс, грануляционной ткани и пр.). С момента начала лечения для пациентов обоих групп проводилась оценка времени появления грануляционной ткани, полноты заживления, необходимости дополнительной пересадки кожи, удовлетворенность пациентов результатами лечения .

По истечении двух недель у 90 % (P=0.03) пациентов «гидрогель»группы раны оставались стерильными, среди пациентов «традиционные» группы это число составило лишь 42 % (P=0.03). У всех пациентов, для лечения которых использовалось гидрогелевое раневое покрытие, образование здоровой грануляционной ткани происходило раньше. По истечении 6 недель у 56 (93 %) пациентов «гидрогель»-группы и 28 (47 %) пациентов «традиционные»-группы (P=0,21) наблюдалось полное заживление ран. Двенадцати пациентов «традиционные»-группы потребовалась частичная сплит-пересадка кожи .

Проведенное исследование показало, что использование раневого покрытия ММ-Гель ведет к заметно лучшим, с позиций полноты заживления хронических ран, результатам по сравнению с традиционными раневыми покрытиями. На основании полученного опыта можно утверждать, что для всех пациентов использование данного раневого покрытия вело к полному восполнению дефектов тканей с образованием нормальных анатомических структур, сопровождающемуся заметным снижением болевых ощущений в области дефекта и приводящему к быстрой регенерации кожных покровов .

При этом внешний вид, упругость и эластичность образованной в процессе заживления дермы заметно отличаются от рубцовой ткани и близки к аналогичным характеристикам нормальной кожи .

3.3.7 Изучение возможности применения гидрогелевых материалов в офтальмологии .

Достаточно активно изучаемыми вопросами в лечении ряда заболеваний глаз являются методы точечной доставки и контролируемого выделения лекарственного препарата во внутренние оболочки глаза [291]. Основной сложностью практической реализации этого подхода является наличие различных офтальмологических барьеров и в быстрая элиминации препаратов из тканей глаза. На сегодняшний день наиболее эффективными методами являются субтеноновый и интравитреальный пути введения препаратов .

Однако основным препятствием для проникновения лекарственного препарата внутрь глаза при субтеноновом пути введения является склера [291,292]. В тоже время интравитреальное введение требует особых условий и сопряжено с риском серьезных осложнений. Гораздо менее изученным, однако потенциально более безопасными по сравнению с интравитреальными, остаются методы, основанные на введении лекарственных веществ в супрахороидальное пространство [293,294] .

В отличие от традиционных методов введения лекарственного препарата (субконъюнктивальный, парабульбарный) транссклеральные методики требуют использования различных пролонгирующих устройств [292]. Основным недостатком известных на данный момент имплантатовпролонгирующих устройств, вводимых в полость глаза, является лежащая в их основе матрица, которая не разрушается по мере выделения из нее лекарственного препарата [295]. Поэтому, в свете полученных нами данных о способности разрабатываемых полимерных гидрогелей к биодеградации, была изучена возможность использования их в качестве основы биодеградирующего носителя лекарственных веществ для супрахороидальной имплантации [296,297]. (Работы проводились совместно с НМХЦ им .

Н.И. Пирогова под руководством профессора Шишкина М.М.) Используемый в эксперименте макропористый полимерный гидрогелевый материал был изготовлен в виде пластин толщиной 1-2 мм .

Стерилизация осуществлялась при помощи автоклавирования .

В качестве экспериментальных животных выступали кролики породы «шиншилла» серой окраски, в возрасте 12-17 месяцев. Вес животных составлял 2,4-3,1 кг .

В экспериментальную группу (ЭГ) для изучения действия исследуемого гидрогелевого макропористого материала вошли 18 (36 глаз) животных .

Животным этой группы супрахороидально имплантировали исследуемый гидрогелевый материал Введение материала осуществляли в условиях общей анестезии .

Выполнялся разрез конъюнктивы и теноновой капсулы в области верхненаружного квадранта глазного яблока. В 6 мм от лимба производился разрез склеры длиной 5 мм параллельно лимбу. После этого с помощью шпателя был сформирован соответствующий размерам имплантата тоннель в супрахороидальном пространстве. С целью профилактики офтальмогипертензии производился парацентез передней камеры с постепенным дренированием влаги. Полимерную пластинку имплантата (5,03,0 мм 1,5мм) вводили в супрахороидальное ложе, после чего склеру и конъюнктиву герметизировали узловым швом. В конъюнктивальную полость закладывали тетрациклиновую мазь .

Животным контрольной группы- 3 кролика (6 глаз) - также под общим наркозом по вышеописанной методике вместо гидрогелевого материала вводили препарат «Остенил» 0,3 мл (1% гиалуронат натрия). Из литературных источников известно, что данный препарат применяют в хирургии отслоек сетчатки для введения в супрахороидальное пространство в качестве пломбировочного материала. Доказано, что при этом отсутствуют воспалительная и токсическая реакции [298,299] .

Для изучения состояния животных обеих групп были использованы следующие клинические методы исследования: тонометрия, биомикроскопия и офтальмоскопия с линзами (60D). Исследования выполняли на 1-е, 3-и, 10-е сутки и через 1,2 и 3 месяца от начала эксперимента. Электроретинограмму регистрировали до имплантации образцов гидрогелевого материала и на 1-е, 3-и, 10-е сутки и через 1 месяц от начала эксперимента. Статистическую обработку данных проводили средствами программы Analystsoft Biostat 2007 .

Из эксперимента животных выводили передозировкой препарата «Наркотан», по три кролика в сроки 1,3,10 день и 1,2 и 3 месяцы с выполнением энуклеации обоих глаз. В контрольной группе забор материала осуществляли в сроки 1, 3 день и через 1 месяц .

Состояние животных сразу после имплантации было удовлетворительным, глаз был спокоен, среды прозрачны. Сетчатка прилежала на всем протяжении, кровоизлияний не наблюдалось. В течение 3суток у животных обеих групп сохранялись гиперемия, отек конъюнктивы и беспокойство при пальпации через веко в области послеоперационной раны .

На 3-10 сутки имела место слабо выраженная перикорнеальная инъекция у 3 животных (6 глаз) экспериментальной группы. На 2-4 сутки отмечали незначительный отек радужки и сглаженность её рисунка в 23,3% наблюдений, которые самостоятельно купировались на 10 сутки. В стекловидном теле (СТ) в 10% наблюдений регистрировали слабую опалесценцию (1 степень [300] ). При офтальмоскопии в 40% наблюдений обнаруживался незначительный отек по ходу вен на стороне имплантации .

Через 1 месяц все изменения сетчатки полностью исчезали. Только у 1 экспериментального животного (2 глаза) помутнение в СТ несколько усилилось (2 степень [300]). На 3 месяц наблюдения у 2 животных (30%) в зоне имплантации при склеропрессии отмечали зону перераспределения пигмента. У животных контрольной группы в зоне имплантации через 3-10 дней после имплантации отмечали побледнение сетчатки, а спустя 1 месяц при склеропрессии выявляли локальную депигментацию над имплантированным материалом .

Контроль внутриглазного давления (ВГД) у животных экспериментальной группы выявил тенденцию к постепенному его повышению в течение первых 3 дней до 19,9±2,66 мм рт. cт. (р=0,05), с колебаниями 12-25 мм рт.ст. (при норме 12-20 мм рт.ст.), что, на наш взгляд, может быть объяснено, некоторым дополнительным набуханием гидрогеля, связанным с его частичной биодеструкцией. На 10 день ВГД нормализовалось (18,1±2,08 мм рт.ст) .

У животных контрольной группы также отмечалось повышение ВГД в 1-3 сутки после вмешательства, но к 10 суткам давление у всех животных нормализовалось (Рисунок 132) .

Рисунок 132 - Динамика показателей внутриглазного давления у животных после супрахороидальной имплантации гидрогелевого материала На ЭРГ у животных ЭГ выявили умеренное снижение амплитуды аволны (до 84-79% от исходных значений) и b-волны (до 75-84%) в 1 сутки после введения макропористого гидрогеля. На 3-10 сутки наблюдалась картина слабовыраженной гиперреакции (а-волна - 114-123% и b-волна до 110-116% от исходного уровня) (Рисунок 133, Рисунок 134). К концу 1 месяца исследования у животных экспериментальной группы отмечалась лишь незначительная депрессия a-волны ретинограммы (Рисунок 133) .

Рисунок 133 - Динамика a-волны ЭРГ после супрахороидальной имплантации гидрогелевого материала Рисунок 134 - Динамика b-волны ЭРГ после супрахороидальной имплантации гидрогелевого материала Стоит, впрочем, отметить, что изменения ЭРГ мало отличались друг от друга у животных обеих групп .

Депрессию a- и b-волн ЭРГ, зарегистрированную в 1-е сутки после имплантации, можно считать ответной реакцией на хирургическое вмешательство. Увеличение амплитуды а- и bволн на 3-10 сутки, связано, очевидно, с раздражающим воздействием нейромедиаторов в ответ на гибель клеточных структур в зоне имплантации, однако быстро наступающая стабилизация показателей свидетельствует об обратимости возникших повреждений ретины [301]. Показатели ЭРГ животных с супрахороидальной имплантацией исследуемого гидрогелевого материала спустя 1 месяц совпадают с показателями ЭРГ животных с введением гиалуроната натрия .

По данным световой микроскопии у животных экспериментальной группы изменения дренажной зоны отсутствовали (Рисунок 135А). На гистологических срезах препаратов радужки на 1-3 сутки отмечено незначительное сужение просвета капилляров (Рисунок 135Б) .

А Б Рисунок 135 - Гистологический срез тканей глаза животных с супрахороидальной имплантацией гидрогелевого материала: А область угла передней камеры (1) и цилиарного тела (2) увеличение 40; Б- ткань радужки, увеличение 100. Окраска - метиленовая синь и основной фуксин .

А Б Рисунок 136 - Гистологический срез тканей глаза. А- гидрогель в супрахороидальном пространстве (указан стрелкой) увеличение10 (10 сутки), Б - формирование сосуда вокруг полимера, увеличение 100 (10 сутки). Окраска: основной фуксин и метиленовая синь Сетчатка и хороидея в зоне имплантации слегка приподняты над гидрогелевым материалом, вследствие его набухания. Также наблюдается дезорганизация рецепторного и наружного ядерных слоев. Структура внутренних слоев на препаратах не изменена (Рисунок 136А). Гидрогелевый материал (1 сутки) на препаратах выглядел как плотно упакованные разноориентированные волокна (Рисунок 137А, Б), окрашенные в темносиний цвет. На препаратах хороидеи отмечается расширение просвета артериол. На гистологических срезах к 10 суткам в краевой зоне ткани окружающей гидрогелевый материал присутствует зона с единичными макрофагами и фибробластами, а также формирующиеся сосуды (Рисунок 136Б). Среди синих волокон гидрогелевого материала присутствуют участки, увеличенные в объеме и пропитанные плазмой (розоватого оттенка) (Рисунок 137А, Б, В). По краю резорбируемого материала обнаруживаются крупные клетки со светлым ядром. Признаков скопления субретинальной жидкости не отмечено .

Через 1 месяц на гистологических срезах по периферии полимера наблюдаются зоны частичного распада и замещения, хотя формирования соединительнотканной капсулы не отмечено. На отдельных участках, контактирующих с полимером, имеет место легкое уплотнение волокон склеры (Рисунок 137А). Спустя 2 месяца, на гистологических срезах 1/2 часть площади имплантированного гидрогеля находится в стадии плазматического пропитывания и эрозии (Рисунок 137Г). Вокруг него присутствует обильная сеть кровеносных сосудов с околососудистой клеточной инфильтрацией .

Спустя 3 месяца на препаратах отмечается почти полная деградация гидрогелевого материала и замещение его рыхлыми волокнами соединительной ткани, с единичными макрофагами и полиморфноядерными лейкоцитами. Можно наблюдать единичные островки эрозированного полимера и сосуды. В отдельных случаях в ретине выявляются участки разрушения пигментного эпителия. В интактной зоне сетчатка сохраняла свою клеточную структуру (Рисунок 137В). Признаков отслоения сетчатки и сосудистой оболочки не обнаружено ни в одном случае, равно как и повреждения зрительного нерва .

А Б В Г Рисунок 137- Гистологический срез тканей глаза животных I группы .

Эволюция полимера в супрахароидальном пространстве: 1 неизмененные волокна полимера, 2 - волокна полимера в стадии плазматического пропитывания, 3 - волокна полимера в стадии эрозирования. А - полимер через 10 дней после имплантации, Б полимер через 1 месяц после имплантации, В- полимер через 2 месяца после имплантации, Г - полимер через 3 месяца после имплантации .

Окраска метиленовая синь, основной фуксин. Увеличение 100 .

У животных контрольной группы в зоне введения гиалуроната натрия в супрахороидальное пространство обнаруживается атрофия пигментного эпителия сетчатки над зоной введения .

Результаты гистологического исследования дополняют приведенные ранее клинико-функциональные наблюдения и свидетельствуют о минимально допустимых патологических изменениях во внутренних структурах глаза экспериментальных животных при имплантации супрахороидально исследуемого гидрогелевого материала .

Нахождение полимерного материала в супрахороидальном пространстве хорошо переносится глазом животных и не сопровождается заметными клиническими осложнениями. Небольшая зона перераспределения пигмента над зоной имплантации не сопровождалась атрофией пигментного эпителия, как при введении натрия гиалуроната в супрахороидальное пространство .

Наличие макрофагов вокруг гидрогелевой пластинки свидетельствует в пользу его биологической деградации. Имплантация материала не вызывала скопления субретинальной жидкости и ни в одном случае не вызвала отслойки сосудистой оболочки. Это еще раз подтверждает безопасность данного метода имплантации носителя лекарственных препаратов. Тесный контакт полимера с хороидальной тканью не сопровождался формированием соединительнотканной капсулы, что необходимо для обеспечения быстрого проникновения фармпрепаратов в хороидальный кровоток. Постепенная биодеградация гидрогелевого материала в течение 2-3 месяцев дает потенциальную возможность не только максимально приблизить вводимый лекарственный препарат к внутренним оболочкам глаза, но и длительно поддерживать его терапевтическую концентрацию .

–  –  –

формирования непосредственно во внутренних средах и полостях организма .

Данный факт делает возможным разработку на их основе систем для малоинвазивной хирургии, которые могут быть использованы в целом ряде практических применения, в частности для мобилизации кровеносных сосудов, протоков (например, желчного), заполнения полостей и послеоперационных дефектов и т.д .

В силу этого нами была изучена возможность использования подобного использования разработанной отверждаемой системы. В качестве экспериментальной модели нами была выбрана облитерация желчного пузыря [302,303]. (Работы проводились совместно с Сидорук А.А. на базе МГМСУ им. А.Е.Евдокимова под руководством профессора, д.м.н. Чудных С.М.) На первом этапе проводился эксперимент на животных. В качестве экспериментальных животных выступали разнополые кролики серого цвета породы «советская шиншилла», массой 2200±100 г. Работу с животными проводили с соблюдением правил, предусмотренных Европейской комиссией по надзору за проведением лабораторных и других опытов с участием экспериментальных животных различных видов. Животные были разделены на четыре группы по 5 особей. Первая группа животных выводилась из эксперимента через 1 месяц, вторая - через 2 месяца, третья - через 3 месяца, соответственно. Четвертая группа была контрольной .

Введение и отверждение композиции, состоящей из очищенного раствора модифицированного поливинилового спирта и инициирующей системы перекись водорода - аскорбиновая кислота, животным осуществляли в условиях общей анестезии. Введение препарата производили следующим образом. Всем животным экспериментальных групп под визуальным контролем проводили с помощью танталовой клипсой клипирование пузырного протока или шейки желчного пузыря, после чего вводили отверждаемый раствор и герметизировали место введения шовным материалом Викрил. У животных контрольной группы выполнялось клипирование желчного протока без введения полимерной композиции .

Из эксперимента животных выводили передозировкой миорелаксанта, после чего удаляли желчный пузырь. Полученный материал фиксировали в 10% нейтральном формалине, с последующей проводкой в спиртах восходящей концентрации. Микросрезы исполняли на микротоме «Raiher», толщина среза 2 мкм, окраска гематоксилин-эозином по стандартной методике. Исследование гистологических препаратов проводилось с использованием светооптического микроскопа «Olimpus BX 51» с камерой «Color View» .

Оценку результатов экспериментального исследования осуществляли путем клинических наблюдений и анализа полученных гистологических препаратов .

В ходе экспериментального этапа исследования состояние кроликов после имплантации материала удовлетворительное. В течение всего периода у животных не было выявлено нарушений в питании и выделительной функции, цвет и густота мехового покрова также оставались без изменений, отмечался прирост массы тела животных к 3 месяцам до 3500±100 г .

Рисунок 138 - Склерозированный желчный пузырь через 3 месяца после имплантации После вывода из эксперимента осуществляли патологоанатомическое исследование с макроскопической оценкой внутренних органов животных .

Было установлено, что практически полная биодеградация вводимого материала и замещение его соединительной тканью наблюдалось к концу 3-го месяца эксперимента .

Рисунок 139 - Поперечный срез макропрепарата. Желчный пузырь частично облитерирован и замещен фиброзной тканью (указан стрелками). Окраска гематоксилин-эозином, увеличение 100 При патологоанатомическом исследовании наблюдалась следующая картина. При вскрытии в брюшной полости животного выпота нет, брюшина серо-розового цвета без геморрагий, печень нормального размера, без внешних изменений, желчный пузырь представляет собой рубцовый тяж диаметром порядка 5 мм и длиной 2см, представлен плотной соединительной тканью белесого цвета, плотный на ощупь, просвет на разрезе не определяется, (Рисунок 138), другие внутренние органы без видимых изменений .

При исследовании полученных гистологических препаратов, было обнаружено, что область желчного пузыря, на поперечном разрезе представляет собой полость с коллагенизированными фиброзными стенками и частично сохраненной эпителиальной выстилкой. В просвете полости обнаруживается слущенный некротизированный эпителий, детрит, бесструктурные массы, гидрогелевый материал не визуализируется (Рисунок 139). В стенке желчного пузыря отмечено частичное, а местами и полное замещение мышечной оболочки фиброзной тканью. В мышечной оболочке обнаружены исчезновение разделения на пучки из-за фиброзирования межмышечных пространств, потеря структурности мышечного слоя, ведущая к снижению васкуляризации вследствие облитерирования капилляров во всех слоях мышечной стенки. Сосуды в области ложа желчного пузыря были сохранены (Рисунок 140). Наблюдается выраженная атрофия слизистой оболочки. На сохранных участках слизистая оболочка представлена одним слоем кубического эпителия без подлежащей рыхлой соединительной ткани, эпителиальный слой лежит непосредственно на фиброзированной стенке .

Прилежащий слой печеночной ткани характеризуется гидропической дистрофией гепатоцитов (Рисунок 141) .

Рисунок 140 - Стенка пузыря представлена грубой фиброзной тканью с частично слушенным эпителиальным слоем. Мышечная оболочка не визуализируется. Окраска гематоксилин-эозином, увеличение 100 Рисунок 141 - Биодеградирующий материал в полости ЖП отсутствует, в просвете детрит. Слизистая оболочка в виде однослойной выстилки. Окраска гематоксилин-эозином, увеличение Тем не менее, большая часть печени имеет обычное строение, без наблюдаемой воспалительной инфильтрации портальных трактов и долек и полным сохранением архитектоники (Рисунок 142) .

Рисунок 142 - Паренхима печени с сохранением нормальной клеточной и тканевой архитектоники. Окраска гематоксилинэозином, увеличение 100 Полученных данные позволили сделать вывод о том, что при введении разработанной отверждаемой «in vivo» полимерной композиции в полость желчного пузыря происходит полная биодеградация образующегося в результате сшивки гидрогеля с замещением его разрастаниями плотной фибропластической ткани и облитерацией полости желчного пузыря .

Положительные результаты эксперимента на животных в сочетании с имеющимися положительными данными о токсикологических и санитарнохимических характеристиках разработанной отверждаемой композиции позволили перейти к клиническому этапу исследований (работы проводились под руководством д.м.н., профессора Чудных С.М.) .

В ходе клинического этапа исследования отверждаемая композиция была применена у 11 больных острым холециститом с целью облитерации желчного пузыря [304]. В данную группу входили пациенты пожилого и старческого возраста, находившиеся на лечении в ГКБ №68 г. Москвы с 2009 по 2011г. Все пациенты были госпитализированы более чем через 72 часа от

–  –  –

При оценке состояния пациента в послеоперационном периоде учитывали клиническую картину (болевой синдром, тошнота, рвота, температурная реакция), контроль лейкоцитарной формулы крови, биохимических показателей, эхографическую картину .

При анализе лабораторных данных у всех пациентов было отмечено снижение уровня лейкоцитов крови (p 0,05), снижения уровня гемоглобина и эритроцитов отмечено не было. В биохимическом анализе крови уровень креатинина, трансаминаз, глюкозы (p 0,05), был достоверно ниже .

В результате контрольных УЗИ, через 2 суток после имплантации, было установлено, что объем желчного пузыря соответствовал объему введенного в него материала, с неутолщенной однородной стенкой, без перифокального воспаления и увеличения печени .

В случае наличия положительной клинико-эхографической картины холецистостому с баллонным катетером удаляли, пациента выписывали из стационара .

Во время разработки методики имплантации композиции в полость желчного пузыря было отмечено два случая его обратной эвакуации по холецистостоме, что было связано с нарушением соблюдения необходимых пропорций компонентов смеси, а также времени экспозиции. В последующем, в ходе доработки методики, подобных явлений более не наблюдались .

Ни один из случаев применения в клинике исследуемого полимерного материала не явился причиной, приведшей к тяжелым осложнениям и летальности .

Рисунок 143 - Желчный пузырь через год после имплантации гидрогелевого материала Для изучения отдаленных результатов применения разработанного материала в постгоспитальном периоде удалось провести наблюдение за 6 больными через 1, 3, 6, 12 месяцев путем повторных вызовов в клинику, телефонного анкетирования, УЗИ в динамике. При повторном эхографическом исследовании после имплантации гидрогелевого материала у пациентов была отмечена тенденция к уменьшению размеров полости желчного пузыря (Рисунок 143), что свидетельствует об эффективности использования данного метода для облитерации полости желчного пузыря .

Рецидивы заболевания за рассматриваемый период отмечены не были .

4 Экспериментальная часть

4.1 Модификация исходных полимеров В трехгорлую стеклянную колбу, снабженную термометром, верхнеприводной мешалкой, обратным холодильником заливали диметилсульфоксид, добавляли навеску полимера и перемешивали при нагревании до полного растворения полимера. Затем раствор нагревали до температуры реакции, после чего добавляли глицидилметакрилат и катализатор (серная кислота, либо ТМЭД, соответственно) в диметилсульфоксиде и перемешивали в течении заданного времени, поддерживая требуемую температуру .

После завершения реакции реакционную систему охлаждали. Продукт высаждали в охлажденный ацетон. Выпавший полимер промывали в ацетоне в течение часа и отделяли центрифугированием (Sigma 16P, Германия) .

Полученный продукт растворяли в дистиллированной воде после чего упаривали на ротационном испарителе (Laborota 4010, Германия) .

Для определения степени замещения, полученный модифицированный полимер после осаждения растворяли в дистиллированной воде и очищали диализом против воды (диализные мешки Sigma 12 000), очищенный раствор сушили с использованием лиофильной сушки (Martin Christ Alpha 1-4 LD, Германия) .

Степень замещения определяли, анализируя соотношения интегральных интенсивностей сигналов на спектрах 1H-ЯМР полимера .

4.2 Синтез полимерных гидрогелей и изучение их свойств .

4.2.1 Радиационно-химический синтез полимерных гидрогелей .

Изучение радиационно-химического синтеза полимерных гидрогелей проводили под руководством проф., д.х.н. Дуфлота на базе Обнинского В.Р.ФГУП НИФХИ им. Л.Я. Карпова»

Радиационно-химический синтез полимерных гидрогелей проводили в стеклянных ампулах объемом 25 см3 под вакуумом. Объем реакционной смеси составлял, обыкновенно, около 10 см3 .

Раствор модифицированного полимера заливали в ампулу при комнатной температуре. Обезгаживание раствора осуществляли посредством вакуумирования при трехкратном замораживании в жидком азоте и с последующим оттаиванием при погружении в теплую воду. Затем ампулы при остаточном давлении 0,150,20Па запаивали в замороженном состоянии, после чего хранили в холодильнике .

Перед началом облучения в боксе -установки устанавливали термостатируемый стакан с водой, в который помещали ампулу с раствором .

Раствор нагревали до требуемой температуры. Инициирование полимеризации осуществляли -излучением 60Со с использованием установки К-200 .

Мощность дозы облучения при проведении процесса регулировали посредством изменения расстояния между облучаемым раствором источником излучения .

Определение количества образовавшейся гель-фракции проводили следующим образом. Поученные облучением образцы, взвешивали на аналитических весах и помещали в заранее взвешенный конверт из фильтровальной бумаги, который затем помещали в Сокслета и проводили экстракцию дистиллированной водой.

После завершения экстракции конверт с образцом гидрогеля сушили в вакууме до постоянной массы, после чего взвешивали и определяли количество образовавшейся гель-фракции (G, %) по формуле:

m G 100% m0, (4.1) где m – масса сшитого гидрогеля после экстракции, m0 – масса полимера в исходном образце .

4.2.2 Синтез полимерных гидрогелей в присутствии инициаторов радикальной полимеризации при положительных температурах .

Полимерные гидрогели получали в тонкостенных стеклянных пробирках диаметром 15 мм. Для этого раствор модифицированного полимера заливали в пробирки, добавляли инициирующую систему или водный раствор инициатора и выдерживали при заданной температуре в течении заданного времени. По завершении процесса сшивки образовавшийся гидрогель извлекали, измельчали и тщательно промывали большим избытком воды, после чего фильтровали и определяли выход гель-фракции аналогично тому, как это указано в п.4.2.1 .

4.2.3 Синтез полимерных гидрогелей в воднозамороженных системах Синтез гидрогелей осуществляли тонких стеклянных пробирках объемом 15 мл. Навески сомономеров растворяли в дистиллированной воде, полученный раствор охлаждали до температуры 05 °С, добавляли инициатор и в течение одной минуты помещали в криотермостат (Julabo F-32, США), где поддерживали заданную температуру с точностью ± 0,2 °С в течение требуемого времени .

По завершении процесса реакционную систему быстро размораживали, образовавшиеся гидрогели извлекали и промывали в горячей воде до полного исчезновения в промывных водах непрореагировавших компонентов .

Критерием качества отмывки служила величина оптической плотности промывных вод в интервале длин волн 200-400 нм (оптическую плотность определяли с использованием Unico 2804, Япония). После отмывки гидрогели замораживали и сушили с использованием лиофильной сушки (Martin Christ Alpha 1-4 LD, Германия) до постоянной массы .

Выход гель-фракции определи аналогично тому, как это указано в п.4.2.1 .

4.2.4 Измерение модуля сдвига образцов гидрогелей Для определения модуля сдвига гидрогелей применяли метод пенетрации сферического индентора [305, 306]. Образцами гидрогелей готовили в виде дисков толщиной от 1 до 3 см и диаметром ~2 и ~6 см .

Измерение проводили следующим образом. Шарик из нержавеющей стали радиусом R = 1,9 или 3,4 мм, вдавливался в плоское верхнее основание образца и после релаксации, занимавшей, обыкновенно, 10–15 секунд измерялась глубина вдавливания h (Рисунок 144). Как правило глубина вдавливания возрастала на протяжении нескольких первых секунд наблюдения, после чего становилась постоянной. Данный факт свидетельствует о достижении равновесного значения деформации, и измерении именно равновесного модуля упругости. При ступенчатом увеличении силы воздействия шарика на гель f, диапазон которой находился в интервале от 0,0001–до 0,01 Н, определяли зависимость h(f) (10–15 точек) .

Область деформаций h, в которой проводили измерения не превышала 0,2R .

Рисунок 144 – Принципиальная схема прибора для измерения модуля упругости геля методом пенетрации: 1 - предметный столик, 2 образец гидрогеля, 3 - массивный цилиндр с шариком, 4 противовесы, 5 - оптическая шкала .

Обработку полученных экспериментальных данных проводили с использованием решения контактной задачи теории упругости [307], согласно которому, в рассматриваемом случае (гель значительно мягче, чем стальной шарик) соотношение между глубиной вдавливания шарика h и силой f должно иметь вид:

h = h0 + bf2/3 (4.2) где коэффициент b зависит от модуля сдвига G и радиуса шарика R как b = [3/(16GR1/2)]2/3. В соответствии с уравнением (4.2), экспериментальная зависимость h от f2/3 хорошо описывалась, за исключением первых нескольких точек при силе f, близкой к нулю, прямыми линиями. Пример такого описания показан ниже (Рисунок 145) .

Наклон прямой b определяли, исключая из рассмотрения начальные точки. Из значения наклона по формуле G = 3/(16b3/2R1/2) рассчитывали модуль сдвига. Как правило, разброс в значениях модуля, определенных для нескольких образцов одного и того же образца геля, составлял в среднем 6% .

Рисунок 145- Пример деформационной зависимости для расчета модуля упругости гелей .

4.2.5 Исследование морфологии поверхности полимерных гидрогелей .

Образцы для исследования получали в разъемных стеклянных формах размером 100503 мм, сообразно методикам, приведенным в п. 4.2.3. но после промывки полученные для фиксации пористой структуры гидрогели замораживали в жидком азоте, поскольку при быстром охлаждении снижается вероятность образования в структуре гидрогелей артефактов, и сушили с использованием лиофильной сушки (Martin Christ Alpha 1-4 LD, Германия) .

Для получения микрофотографий использовали сканирующий растровый электронный микроскоп JSM U3 (Япония) (ускоряющее напряжение 15 кВ; ток электронного пучка – 110-10 Ампер), снабженный системой WinEDS. Микрофотографии получали при четырех увеличениях 3000, 1000, 300, 100, 40 раз, соответственно .

Обработка микрофотографий образцов гидрогелей, проводилась путем выбора эквивалентного диаметра поры с площадью которой равной площади неопределенной фигуры поры. Причем поиск этого оптимума проводили визуально с использованием специальных шаблонов .

Диаметр эквивалентной сферы определяли согласно выражению:

dэ 4 a b, (4.3) где a, b- радиусы эллипса с площадью равной площади поры Проводилась обработка не менее трех микрофотографии для каждого образца (как правило при увеличении 300 раз). Количество обработанных пор на каждой микрофотографии было не менее 500. По результатам, в соответствии с принятой методикой, строили гистограммы распределения пор по размерам .

Средний диаметр пор определяли по формуле:

N

–  –  –

4.2.6 Изучение динамики выделения включённых биологически активных веществ из объема полимерных гидрогелей Включение модельного препарата проводили на стадии синтеза полимерного гидрогеля .

Для получения пористых гидрогелей с включенным препаратом к раствору макромера добавляли инициирующую систему и вводимый препарат, заливали в разъемные формы и помещали в криотермостат. По окончании процесса гелеобразования формы размораживали, извлекали образовавшийся гидрогель. Полученные образцы сушили лиофильно без предварительной отмывки .

Для получения изотропных гидрогелей с включенным препаратом к раствору макромера добавляли инициирующую систему и вводимый препарат, заливали в разъемные формы и выдерживали при комнатной температуре в течение 5-6 часов. По окончании процесса гелеобразования формы размыкали, извлекали образовавшийся гидрогель. Гидрогели хранили во влажном состоянии .

При получении «гибридного» гидрогеля, предварительно полученный образец лиофильно высушенного макропористого гидрогеля помещали в раствор макромера, содержащий лекарственный препарат и инициирующую систему (для всех образцов в качестве каркаса использовался макропористый гидрогель, полученный при следующих условиях: концентрация макромера 4 г/100 мл, температура минус 15 °С). По истечении 5-6 часов образец извлекали и далее процесс проводили также как это описано выше Наноагрегаты на основе амфифильных производных поли-Nвинилпирролидона были синтезированы Кусковым А.Н. с сотр. по известным методикам .

Для включения рифампицина применяли диализный метод, а для метилурацила – эмульсионный метод, в обоих случаях соотношение полимер:

лекарственное вещество составляло 1:1 .

Для получения гидрогелей, содержащих наноагрегаты с включенным препаратом, к раствору макромера добавляли инициирующую систему и наноагрегаты с включенным лекарственным препаратом, заливали в разъемные формы и помещали в криотермостат. По окончании процесса гелеобразования формы размораживали, извлекали образовавшийся гидрогель. Полученные образцы сушили лиофильно без предварительной отмывки .

Для определения скорости выделения включенного лекарственного препарата приготовленные образцы гидрогелей помещали в физиологический раствор (модуль ванны 100) и инкубировали при температуре 37 °С, определяя через заданные промежутки времени концентрации препарата в растворе. Концентрацию определяли спектрофотометрически измеряя интенсивность поглощения при длине волне характерной для используемого лекарственного вещества .

4.3 Изучение биосовместимости полимерных гидрогелей 4.3.1 Определение содержания потенциально токсичных веществ в образцах гидрогелевого материала Готовые к испытаниям образцы полимерных гидрогелей помещали в стеклянные плоскодонные конические колбы с плотно притертыми пробками, заливали дистиллированной водой и термостатировали при температуре (371)С в «динамическом» режиме на протяжении 14 суток .

Соотношение между массой образца (М) и объемом добавляемой дистиллированной воды (V), играющей роль модельной среды рассчитывали из уравнения:

Mm k,, (4.6) VV где m – максимальная масса образца при его практическом применении, г;

k - коэффициент аггравации, равный 10 .

В качестве контрольного раствора использовали дистиллированную воду, на которой готовились вытяжки, которую термостатировали в тех же условиях .

Измерение значений рН вытяжек проводили с использованием рН-метра Н1 9321 («HANNA», Германия). УФ-спектры регистрировали на спектрофотометре модели UV-mini 1240 («Shimadzu», Япония) .

Количественное определение концентраций ацетальдегида, формальдегида, глицидилметакрилат проводили с использованием метода обращеннофазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии на колонке с неподвижной фазой «Нуклеосил С18» (5 мкм) длиной 150 мм и внутренним диаметром 4,6 мм. Детектирование сигнала проводилось при 360 нм (производные формальдегида и ацетальдегида), и 200 нм (определение ГМА), что соответствовало специфическим максимумам на ультрафиолетовых спектрах указанных соединений. Скорость подвижной фазы составляла 1 мл/мин .

Для обеспечения необходимых селективности и чувствительности определения альдегидов последние переводили в 2,4-динитрофенилгидразоны путем обработки анализируемых водных вытяжек 2,4динитрофенилгидразином в условиях кислотного катализа .

При определении концентраций альдегидов в качестве подвижной фазы выступал 57,5%-ный водный ацетонитрил; для определения концентрации ГМА- 20%-ный водный ацетонитрил. Времена удерживания составляли: 3,98 мин и 4,96 мин для производных формальдегида и ацетальдегида, соответственно; 9,66 мин для ГМА .

Концентрации растворенных форм металлов (кадмия, свинца, бария, железа, хрома, алюминия, меди, олова, мышьяка) в вытяжках определяли при помощи атомно-абсорбционной спектрометрии с использованием модульного спектрального аналитического комплекса «КВАНТ-Z.ЭТА» .

4.3.2 Изучение цитотоксичности экспериментальных образцов гидрогелевых материалов Для оценки цитотоксического и цитостатического действия водных вытяжек из образцов использовали суспензионную кратковременную культуру подвижных половых клеток, приготовленную из замороженной спермы крупного рогатого скота, с последующим определением индекса токсичности .

В качестве контрольного раствора использовалась глюкозо-цитратная среда следующего состава: глюкоза – 4 г, цитрат натрия – 1 г, дистиллированная вода - 100 мл. Одновременно раствор служил и разбавителем для оттаивания замороженной спермы. Опытный раствор (вытяжки из образцов) доводили до изотонии глюкозой и цитратом .

Стеклянные пробирки с плотно притертыми пробками с контрольным и опытными растворами (по 0,4 мл) помещали в водяную баню при температуре 40±1,5°С. Для приготовления маточного раствора спермы в пробирку вносили 0,4 мл разбавителя и ставят в водяную баню при температуре 40 ± 1,5°С, в нагретый раствор опускали извлеченную из сосуда Дьюара гранулу замороженной спермы .

Для приготовления рабочих образцов в пробирки с контрольным и опытным растворами помещали по 0,1 мл маточного раствора спермы .

Рабочие образцы переносили в капилляры. Капилляры помещали в анализатор (стенд для определения подвижности суспензионной культуры подвижных клеток типа АТ-04). Производили обработку экспериментальных данных .

Индекс токсичности определяли по формуле:

t0 cp It 100% k t cp, (4.7) где tср и tkср- средние арифметические значения времени подвижности соответственно для опытной и контрольной выборок образцов .

Исследуемые вытяжки из экспериментальных образцов можно считать нетоксичными, если индекс токсичности находится в интервале от 70 до 120 % .

4.3.3 Определение гемотоксического действия экспериментальных образцов гидрогелевых материалов Пробоподготовку проводили аналогично п. 4.3.2. Оценку гемолитического действия водных вытяжек проводили в опытах «in vitro» с изолированными эритроцитами кроликов. Для приготовления взвеси эритроцитов использовали цитратную кровь кролика, приготовленную на 3,8% растворе цитрата натрия в соотношении 1:9 .

Для обеспечения статистической достоверности отбирали 3 образца крови. Цитратную кровь в количестве 5 мл центрифугировали в течение 10 минут при 900 об/мин, отделяя надосадочную жидкость. К осадку добавляли 8 мл физиологического раствора. Содержимое перемешивали и центрифугировали еще 10 минут, надосадочную жидкость отделяли .

Надосадочная жидкость должна быть прозрачной, бесцветной, не иметь следов гемолиза. При несоответствии надосадочной жидкости указанным требованиям, операцию по отмыванию осадка эритроцитов физиологическим раствором повторяли .

Для получения 10% взвеси эритроцитов 1 мл осадка клеток смешивали с 9 мл физиологического раствора .

Опытную пробу готовили, используя 10% взвесь эритроцитов крови кролика и вытяжку из образцов (5 мл), контрольную пробу - 10% взвесь эритроцитов и изотонический раствор хлорида натрия. Пробы помещали в термостат на 1 час при температуре 37±3 С, после чего центрифугировали и определяли оптическую плотность на фотометре в кювете с толщиной слоя 1 см при длине волны 540 нм против дистиллированной воды .

Расчет процента гемолиза производят по формуле:

Е опт Е к % гемолиза 100 Е100, (4.8) где Еоп - оптическая плотность опытной пробы;

Ек - оптическая плотность контрольной пробы;

Е100 - оптическая плотность пробы со 100%-ным гемолизом .

Исследуемые вытяжки из образцов имплантатов можно считать свободными от гемолитически действующих веществ, если процент гемолиза во всех трех образцах крови менее двух .

4.3.4 Определение раздражающего действия образцов гидрогелевых материалов Пробоподготовку проводили аналогично п. 4.3.2 .

Раздражающее действие вытяжек из образцов изучали при воздействии на слизистую оболочку глаз кроликов В эксперимент отбирали не менее трех животных на каждый из образцов, с этой целью за сутки до начала исследования визуально оценивали состояние глаз каждого кролика для выявления выраженных повреждений .

В случае обнаружения патологических изменений хотя бы в одном глазу животное заменяли. С целью более четкого выявления изменений роговицы использовали 2% раствор флуоресцеина натрия, офтальмоскоп, ручную щелевую лампу и другие устройства .

–  –  –

Испытуемую вытяжку из образцов инстиллировали в один глаз кролика в количестве 1-2 капель, другой глаз оставляли для контроля (в него вносили дистиллированную воду). Оба глаза животных, которым инстиллировали вытяжку из образцов, осматривали через 1, 24, 48, 72 часа после воздействия .

Наблюдаемую реакцию оценивали и регистрировали в соответствии с системой классификации повреждений ( Таблица 31) .

Если при воздействии на слизистую оболочку глаза более чем у одного животного на любой стадии исследования возникали патологические изменения, отмеченные в таблице знаком «*», считали, что вытяжка обладает раздражающим действием. В том случае, если патологические изменения выявлялись в подопытном глазу только у одного из трех кроликов, и сомнительных результатах исследования повторяли на большем количестве животных. Если патологические изменения при повторных исследованиях обнаруживались более чем у половины кроликов, считали, что вытяжка обладает раздражающим действием .

4.3.5 Исследование сенсибилизирующего действия Пробоподготовку проводили аналогично п. 4.3.2 .

Для исследования сенсибилизирующего действия образцов белым крысам в наружную поверхность уха внутрикожно вводили по 0,02 мл вытяжек. Контрольным животным вводили по 0,02 мл модельной среды (дистиллированная вода). Наблюдение за состоянием кожи проводили через 15 мин, 1, 24, 48 и 72 часа после введения .

Через 10 суток проводили по 5 накожных аппликаций - наносили по 0,5 мл вытяжки на выстриженные заранее участки кожи животных размером 1x1 см. Контрольным животным проводили аппликации модельной среды в том же режиме. Ежедневно наблюдали и оценивали реакцию раздражения .

Через сутки после последней аппликации проводили провокационную пробу путем внутрикожного введения 0,02 мл вытяжки в противоположный проведенным аппликациям бок каждого животного. Реакцию на провокационную пробу отмечали через 24, 48 и 72 часа .

–  –  –

В соответствии с классификацией (Таблица 32) оценивали степень кожной реакции, включая эритему и отек для каждого животного и каждого интервала времени (24, 48 и 72 часа) после воздействия. Для каждого животного складывали баллы кожной реакции, вызванной исследуемым материалом (включая отек и эритему) в каждый интервал времени наблюдения и делили на общее число наблюдений, получали балл первичного раздражения, который вычисляли и для контроля. Из балла первичного раздражения подопытных животных вычитали показатель контроля. Затем складывали полученные баллы кожной реакции всех подопытных животных и делят на количество особей. Полученный индекс суммарного раздражения сравнивали с показателями, представленными в таблице, отмечая слабую, среднюю или сильную реакцию на воздействие изучаемого материала .

Оценку возможного сенсибилизирующего действия проводили с использованием диагностического метода специфического лизиса лейкоцитов (РСЛЛ). Через 24 часа после проведения внутрикожной пробы животных забивали декапитацией, брали кровь для проведения РСЛЛ .

–  –  –

4.3.6 Исследование острого общетоксического действия Пробоподготовку проводили аналогично п. 4.3.2 .

Действие вытяжек образцов изучали на белых беспородных мышах массой 20-22 г. Животных разделяли на подопытные и контрольную группы не менее чем по 10 голов в каждой. Содержание животных полностью соответствовало санитарным нормам. Подопытным животным однократно внутрибрюшинно вводили по 1 мл вытяжек (из расчета 50 мл/1кг массы тела) .

Контрольные животные в том же режиме получали дистиллированную воду .

Температура вводимых растворов - 37±1,5°С .

В течение эксперимента оценивали общее состояние животных, изменение внешнего вида, поведения, двигательной активности, контролировали прирост массы тела. По окончании эксперимента животных забивали методом декапитации, макроскопически оценивали состояние брюшины и внутренних органов, определяли органо-соматические показатели (ОСП), рассчитываемые как соотношение массы органа в миллиграммах к массе тела в граммах .

Полученные данные подвергали статистической обработке с использованием критерия Стьюдента «t» и проверяли наличие, статистически достоверных изменений массы тела и ОСП (органо-соматических показателей) у подопытных животных по сравнению с контрольной группой .

4.3.7 Исследование подострого и хронического общетоксического действия Изучение подострой и хронической токсичности образцов гидрогелей проводили на беспородных белых крысах-самцах, являющихся наиболее подходящим видом животных для проведения токсикологических исследований. Стерильные растворы для отверждения «in vivo», после добавления к содержимому ампулы (1 мл) 30 мкл 2%-ного раствора персульфата аммония в качестве отвердителя вводили с помощью шприца подкожно в область спины подопытным животным. Пористые и изотропные гидрогели в виде специально изготовленных образцов, под медикаментозным наркозом (препарат зоолетил в дозе 15 мг/кг) имплантировали подопытным животным подкожно в область спины. Контрольным животным в тех же условиях вживляли образцы медицинского стекла марки ВС-3 ГОСТ 19808 .

Расчет массы имплантата проводили по формуле:

–  –  –

Часть подопытных и контрольных животных (по 5 особей из группы) выводили из эксперимента методом декапитации через месяц, два месяца, три месяца после введения образцов и отбирали материал для проведения патоморфологических исследований .

В конце эксперимента (через 4 месяца после имплантации) оставшихся животных обследовали с использованием физиологических, гематологических, биохимических методов .

В течение всего эксперимента проводили наблюдения за внешним видом поведением, двигательной активностью подопытных и контрольных животных. Определяли прирост массы тела. Состояние центральной нервной системы оценивали по способности к суммации подпороговых импульсов, то есть, определению суммационно-порогового показателя (СПП). Для проведения эксперимента использовали установку, состоящая из аппарата, дающего электроимпульсный ток, и, присоединенных к его выходным клеммам (аноду и катоду), металлических пластин-электродов Задние лапки животного помещали на электроды при нулевом напряжении, включали подачу импульсного тока, одновременно увеличивая подаваемое напряжение .

При возникновении рефлекторного ответа (животное поднимает лапку) переводили ток на «постоянный» и фиксировали результат в mA .

Кроме того, в качестве интегрального показателя состояния организма животных использовали показатель двигательной работоспособности, который определяли по времени движения на роторной установке (Ugo Basile, Италия) .

Биохимические исследования сыворотки крови подопытных животных заключались в определении активности аланиновой и аспарагиновой аминотрансфераз, содержания мочевины. Биохимические показатели сыворотки крови определяли на биохимическом анализаторе «Stat Fax 1904 Plus» в комплексе с проточной кюветой «Mosguito 2400» (Awarenes Technology inc., США) .

Количество лейкоцитов и эритроцитов в крови определяли на приборе «Picoscell» PS-4M и ветеринарном автоматическом 17-канальном гематологическом анализаторе Exigo; содержание гемоглобина – на биохимическом анализаторе «Stat Fax 1904 Plus» .

По окончании исследований животных выводили из эксперимента методом декапитации, определяли органо-соматические показатели, отбирали материал для патоморфологических исследований .

Полученные результаты экспериментальных исследований подвергали статистической обработке методом вариационной статистики с использованием критерия «t» Стьюдента .

Внутренние органы подопытных и контрольных животных (печень, почки, селезенка), а также соединительнотканная капсула, окружающая образцы, взятые у подопытных и контрольных животных через 1,2, 3 и 4 месяца после имплантации подвергали патоморфологическим исследованиям .

4.3.8 Оценка биосовместимости образцов по отношению к эритроцитарной массе и лейко-тромбоцитарному слою Подготовка образцов. Перед проведением эксперимента образцы, измельчали. В случае изучения свойств пористых материалов их перед измельчением помещали в физиологически раствор для набухания, образцы, представляющие собой раствор для отверждения, перед измельчением сшивали Подготовка эритроцитарной массы. Перед проведением испытаний донорская эритроцитарная масса с хранением не более 5 дней многократно промывалась физиологическим раствором с помощью центрифугирования на центрифуге при 1500g в течение 15 мин с последующим удалением надосадочной жидкости и заменой ее новым физиологическим раствором .

После тщательной отмывки ЭР-массы ее разбавляли в два раза физиологическим раствором и перемешивают качающими движениями .

Взаимодействие образцов биодеградируемых полимеров с эритроцитарной массой. К измельченным образцам добавляли разбавленную в два раза физиологическим раствором отмытую ЭР-массу. После перемешивания качающими движениями смесь выдерживали при комнатной температуре в течение 2 часов. После двухчасовой выдержки образцы ЭР массы отделяли от исследуемых образцов и направляли на гемоанализ .

Контролем в анализе служила исходная эритроцитарная масса, не вступавшая в контакт ни с одним образцом. Гемоанализ образцов эритроцитарной массы проводили с помощью гемоанализатора .

Взаимодействие образцов биодеградируемых полимеров с лейкотромбоцитарным слоем. К измельченным образцам добавляли разбавленный в десять раз лейко-тромбоцитарный слой. После перемешивания качающими движениями смесь выдерживали при комнатной температуре в течение 1 часа .

После часовой выдержки образцы ЛТС отделяли от исследуемых образцов и отправляли на гемоанализ. Контролем в анализе служил исходный ЛТС, не вступавший в контакт ни с одним образцом .

Гемоанализ образцов лейко-тромбоцитарного слоя проводили с помощью гемоанализатора Beckman Coulter AcTdiff (США) .

4.3.9 Оценка биосовместимости по содержанию свободного гемоглобина в надосадочной жидкости после контакта образцов с эритроцитарной массой Подготовка образцов аналогична подготовке, описанной в п 4.3.8 Взаимодействие с эритроцитарной массой. К образцам добавляли разбавленную в два раза физиологическим раствором отмытую ЭР-массу .

После перемешивания качающими движениями смесь выдерживали при комнатной температуре в течение 2 часов .

После контакта образцы ЭР - массы отделяли от исследуемых образцов материала, помещали в чистые, сухие пробирки и центрифугировали при 1500g в течение 15 мин. После центрифугирования надосадочная жидкость отделялась от осевших эритроцитов и подвергалась анализу на содержание свободного гемоглобина. Контролем в анализе служила надосадочная жидкость, отделенная от осевших эритроцитов, не вступавших в контакт ни с одним образцом .

Определение концентрации свободного гемоглобина в надосадочной жидкости. Определение концентрации свободного гемоглобина проводили спектрофотометрическим методом согласно методу Harboe. Метод позволяет определять концентрацию свободного гемоглобина в диапазоне от 0,08 до 2,00 г/л. Первоначально готовили стоковый раствор карбоната натрия (Na2CO3) с концентрацией 10 г/л – 1 г. Na2CO3 растворяли в 100 мл дистиллированной воды. В день проведения исследований по определению концентрации свободного гемоглобина готовили рабочий раствор Na2CO3 путем растворения 1 мл стокового раствора Na2CO3 в 100 мл дистиллированной воды. Концентрация Na2CO3 в рабочем растворе должна составлять 0,1 г/л. Спектрофотометрическое определение относительной оптической плотности исследуемых растворов относительно рабочего раствора Na2CO3 проводили в кварцевых кюветах с толщиной слоя жидкости 1 см при трех фиксированных длинах волн: 380, 415 и 450 нм. Исследуемые растворы готовили следующим образом: 0,3 мл анализируемого раствора надосадочной жидкости добавляли к 3 мл рабочего раствора Na2CO3 с концентрацией 0,1 г/л.

Концентрацию свободного гемоглобина в г/л рассчитывали по формуле:

CHb = 0,836(2A415 – A380 – A450) (4.11) где A415, A380, A450 – относительная плотность анализируемых растворов при 415, 380 и 450 нм соответственно .

4.3.10 Оценка биосовместимости на основании микроскопических исследований эритроцитарной массы и лейко-тромбоцитарного слоя после контакта с образцами Подготовка образцов аналогична подготовке, описанной в п 4.3.8 Подготовка эритроцитарной массы аналогична подготовке, описанной в п.4.3.9 Подготовка тромбоцитов. Забор крови для исследования тромбоцитов чаще всего проводили из локтевой вены, с предварительным накладыванием сдавливающей манжетки. Кровь собирали в пластиковые пробирки (или другие контейнеры) с антикоагулянтом. Сразу после взятия крови пробирку закрывали и несколько раз переворачивали для лучшего распределения антикоагулянта .

Для получения обогащенной (или богатой) тромбоцитами плазмы (ОТП) кровь центрифугировали в бакет-роторах при 120 – 200 g при комнатной температуре в течение 10 – 20 минут .

Взаимодействие образцов с эритроцитарной массой и тромбоцитами. К каждому из образцов добавляли разбавленную в два раза физиологическим раствором отмытую ЭР-массу. После перемешивания качающими движениями смесь выдерживали при комнатной температуре в течение 2 часов. После двухчасовой выдержки образцы ЭР - массы отделяли от исследуемых образцов и отправляли на микроскопические исследования .

Контролем в анализе служила исходная эритроцитарная масса, не вступавшая в контакт ни с одним образцом .

Микроскопические исследования образцов эритроцитарной массы и обогащенной тромбоцитами плазмы проводили с помощью микроскопа Nicon Eclipse 80i (Япония). Для обнаружения «теней» эритроцитов использовали витальный краситель, поскольку без подкрашивания «тени» эритроцитов не видны. Для морфофункционального исследования тромбоцитов использовали метод, основанный на окрашивании клеток витальными (прижизненными) флуорохромными красителями с последующим анализом во флуоресцентном микроскопе. Для оценки биологической полноценности тромбоцитов использовали количество функционально пригодных тромбоцитов, то есть тромбоцитов, содержащих гранулы .

5 Выводы .

1. Путем радикального сшивания водорастворимого модифицированного глицидилметакрилатом поливинилового спирта, а также смесей модифицированного поливинилового спирта с модифицированным гидроксиэтилкрахмалом, либо заряженными низкомолекулярными мономерами получены низкотоксичные изотропные и пористые гидрогели пригодные для медико-биологического использования .

2. Исследованием процесса модификации поливинилового спирта и гидроксиэтилкрахмала глицидилметакрилатом, выявлены условия, позволяющие синтезировать полимеры с заданной степенью замещения, в том числе, растворимые в воде .

3. Установлен характер влияния на протекание процесса сшивания концентрационного, температурного, временного и иных факторов .

4. Исследованием модуля упругости и равновесного набухания гелей определены степени их сшивания. Исследована характеристика термодинамического состояния системы гель – вода. Необычное поведение гелей, полученных в присутствии персульфатов, в воде и их чувствительность к добавкам низкомолекулярных электролитов объяснены наличием в полимерной сетке геля заряженных (ионизованных) звеньев. Проведена оценка степени ионизации сетки, предложен возможный механизм возникновения ионогенных групп .

5. Электронно-микроскопическими исследованиями показано, что полученные гидрогели, образующиеся в воднозамороженных системах, представляют собой материалы с развитой пористой структурой и размером открытых пор от единиц до сотен микрометров, причем общая пористость и средний размер пор снижаются по мере роста концентрации полимера и снижения температуры процесса, но практически не зависят от концентрации инициатора в реакционной смеси. Путем анализа кривых «напряжение-деформация»

продемонстрировано, что на частоту сшивки полимерной матрицы гидрогелей в наибольшей степени оказывает влияние количество введенного инициатора и в меньшей степени – концентрация полимера и температура образования гидрогеля .

6. Продемонстрирована возможность использования синтезированных гидрогелей в качестве основы для матриксов для культивирования различных типов клеток. Показано, что посредством регулирования состава полимерных гидрогелей возможно создание матрикса, с преимущественным ростом определенного типа клеток .

7. Установлена высокая степень биосовместимости полученных полимерных систем. Показана их способность к биодеградации с замещением собственными тканями организма. Продемонстрирована возможность регулирования скорости биодеградации посредством варьирования состава полимерного гидрогелевого материала

8. Продемонстрирована возможность использования разработанных гидрогелевых материалов для создания ряда изделий медикобиологического назначения: высокоэффективных раневых покрытий, материалов для заполнения дефектов мягких тканей, систем доставки лекарственных препаратов и ряда других 6 Список литературы Hydrogels in Medicine and Pharmacy / N.A. Peppas. — Florida: CRC Press, Boca Raton, 1986. — Vols. 1-3. Rosiak J.M., Yoshii F. Hydrogels and their medical applications // Nucl .

Instrum Methods Phys. Res. Sec. B. — 1999. — Vol. 151. — 56-64 p .

Galaev I.Y., Mattiasson B. Smart polymers and what they could do in biotechnology and medicine // Trends Biotechnol. — 1999. — Vol.17. — 335-340 p .

4 Baldwin S.P., Saltzman W.M. Materials for protein delivery in tissue engineering // Adv. Drug Deliv. Rev. — 1998. — Vol. 33. — 71-86 p .

5 Gombotz W.R., Pettit D.K. Biodegradable polymers for protein and peptide drug delivery // Bioconjug. Chem. — 1995. — Vol. 6. — 332-351 p .

6 Hoffman A.S. Hydrogels for biomedical applications // Advanced Drug Delivery reviews. — 2002. — Vol.43. — 3-12 p .

7 Peppas N.A., Bures P., Leobandung W., Ichikawa H. Hydrogels in pharmaceutical formulations // Eur. J. Pharm. Biopharm. — 2000. — Vol. 50 .

— 27-46 p .

8 Peppas N.A., Huang Y., Torres-Lugo M., Ward J.H., Zhang J .

Physicochemical foundations and structural design of hydrogels in medicine and biology // Annu. Rev. Biomed. Eng. — 2000. — Vol. 2. — 9-29 p .

9 Drury J. L., Mooney D. J. Hydrogels for tissue engineering: scaffold design variables and applications // Biomaterials. — 2003. — Vol. 24. — 4337– 4351 p .

10 Gehrke S.H. Synthesis and properties of hydrogels used for drug delivery // Drugs Pharm. Sci. — 2000. — Vol. 102 — 473-546 p .

11 Park K., Shalaby W.S.W. Biodegradable hydrogels for drug delivery / Park H. — Basle: Technomic Publishing Co., 1993. — 252 p .

12. Папков С.П. Студнеобразное состояние полимеров. — М.: Химия, 1974 .

— 256 с .

13 Wichterle O., Lim D. Hydrophilic gels for biological use // Nature. — 1960 .

Vol. 185. — 117-118 p .

14 Park H., Park K. Biocompatibility issues of implantable drug delivery systems // Pharm. Res. —1996. — Vol. 13. — 1770-1776 p .

15 Smetana K. Cell biology of hydrogels // Biomaterials. — 1993. — Vol. 14 .

— 1046-1050 p .

16 Anderson J.M., Langone J.J. Issues and perspectives on the biocompatibility and immunotoxicity evaluation of implanted controlled release systems // J .

Controlled Release. — 1999. — Vol. 32. — 107-113 p .

17 Anderson J.M. In vivo biocompatibility of implantable delivery systems and biomaterials // Eur. J. Pharm. Biopharm. — 1994. — Vol 40. — 1-8 p .

18 Langer R.S., Peppas N.A. Present and future applications of biomaterials in controlled drug delivery systems // Biomaterials. — 1981. — Vol 2. — 201p .

19 Bettini R., Colombo P., Peppas N.A. Solubility effects on drug transport through pH-sensitive, swelling-controlled release systems: Transport of theophylline and metoclopramide monohydrochloride // J. Controlled Release. — 1995. — Vol. 37. — 105-111 p .

20 Cicek H., Tuncel A. Immobilization of -chymotrypsin in thermally reversible isopropylacrylamide-hydroxyethylmethacrylate copolymer gel // J .

Polym. Sci., Part A Polym. Chem. — 1998. — Vol. 36. — 543-552 p .

21 Штильман М.И., Остаева Г.Ю., Артюхов А.А., Тсатсакис А.А., Козлов

В.С. Эпоксидсодержащие пористые гидрогели акриламида:

исследование влияния условий синтеза // Пластмассы. — 2002. — №.3 .

— 25-28 с .

22 Штильман М.И., Артюхов А.А., Козлов В.С., Тсатсакис А.М .

Эпоксидсодержащие пористые гидрогели поли(2гидроксиэтил)метакрилата: исследование влияния условий синтеза // Пластмассы. — 2002. — №.7. — 24-28 с .

23 Артюхов А.А., Штильман М.И., Тсатсакис А.М., Козлов В.С., Остаева

Г.Ю. Эпоксидсодержащие пористые гидрогели полиакриламида:

исследование физико-химических характеристик // Пластмассы. — 2002. — №.9. — 32-37 с .

24 Chen J., Park P., Park K. Synthesis of superporous hydrogel: Hydrogels with fast swelling and superabsorbent properties // Biomed. Mater. Res. — 1999 .

— Vol. 44 — 53-62 p .

25 Padn M., Lesn P., Fiala J., Vack J., lof M., Michlek J., Sukova E .

Macroporous hydrogel based on 2-hydroxyethylmethacrilate. Part 1 .

Copolymers of 2-hydroxyethylmethacrilate with methacrilic acid // Collect .

Czech.Commun. — 2003. — Vol 68. — 812-822 p .

26 Horak D., Lednicky F., Bleha M. Effect of inert components on the porous structure of 2-hydroxyethyl methacrylate–ethylene dimethacrylate copolymers // Polymer. — 1996. — Vol. 37. — 4243–4249 p .

27 Michlek J., Padn M., Artyukhov A., louf M., Smetana K. Macroporous hydrogels based on 2-hydroxyethyl methacrylate. Part 3. Hydrogels as

carriers for immobilization of proteins // Journal of Materials Science:

Material in Medicine. — 2005 — Vol. 16, № 8 —783-786 p .

28 Edman P., Ekman B., Sjoholm I. Immobilization of proteins in microspheres of polyacryldextran // J. Pharm. Sci. — 1980. — Vol. 69. — 838-842 p .

29 Sjoholm I.P., Edman P. The use of biocompatible microparticles as carriers of enzymes and drugs in vivo. In: Microspheres and Drug Therapy .

Pharmaceutical, Immunological and Medical Aspects / S.S. Davies, L. Illum, J.G. Vie, E. Tomlinson. — Amsterdam: Elsevier, 1984. — 245-262 p .

30 Mehvar R. Dextran for the targeted and sustained delivery of therapeutic and imaging agents // J. Controlled Release. — 2000. — Vol. 69. — 1-25 p .

31 Brondsted H., Anderson C., Hovgaard L. Crosslinked dextran, a new capsule material for colon targeting of drugs // J. Controlled Release. — 1998. — Vol. 53 — 7-13 p .

32 Park K. Enzyme-digestible swelling hydrogels as platforms for long-term oral drug delivery: synthesis and characterization // Biomaterials. — 1988. — Vol. 9 — 435-441 p .

33 Artursson P., Edman P., Laakso T., Sjoholm I. Characterization of polyacryl starch microparticles as carrier for proteins and drugs // J. Pharm. Sci. — 1984. — Vol. 73, № 11. — 1507-1513 p .

34 Heller J., Pangburn S.H., Roskos K.V. Development of enzymatically

degradable protective coatings for use in triggered drug delivery systems:

derivatized starch hydrogels // Biomaterials. — 1990. — Vol. 11. — 345-350 p .

35 Sturesson C., Wikingsson L.D. Comparison of poly(acryl starch) and poly(lactide-co-glycolide) microspheres as drug delivery system for a rotavirus vaccine // J. Controlled Release. — 2000. — Vol. 68. — 441-550 p .

36 Giammona V., Tomarchio V., Pitarresi G., Cavallaro G. Glycidyl methacrylate derivatization of,-poly(N-hydroxyethyl)-D,L-aspartamide and,-polyasparthydrazide // Polymer. — 1997. — Vol. 38. — 3315-3323 p .

37 Giammona G., Pitarresi G., Cavallaro G., Buscemi S., Saiano F. New biodegradable hydrogels based on photocrosslinkable modified polyaspartamide: synthesis and characterization // Biochim. Biophys. Acta .

— 1999. —Vol. 1428. — 29-38 p .

38 Giammona G., Pitarresi G., Cavallaro G., Spadaro G. New biodegradable hydrogels based on an acryloylated polyaspartamide crosslinked by gamma irradiation // J. Biomed. Sci. Polym. Ed. — 1999. — Vol. 10. — 969-987 p .

39 Martens P., Anseth K.S. Characterization of hydrogels from acrylate modified poly(vinyl alcohol) macromers // Polymer. — 2000. — Vol. 41. — 7715-7722 p .

40 Jin Y., Yamanaka J., Sato S., Miyata I., Yomota C., Yonese M. Recyclable characteristics of hyaluronate-polyhydroxyethyl acrylate blend hydrogel for controlled releases // J. Controlled Release. — 2001. — Vol. 73. — 173-181 p .

41 Van Dijk-Wolthuis W.N.E., Franssen O., Talsma H., Van Steenbergen M.J., Kettenes-Van den Bosch J.J., Hennink W.E. Synthesis, characterization and polymerization of glycidyl methacrylate derivatized dextran // Macromolecules. — 1995. — Vol. 28. — 6317-6322 p .

42 Van Dijk-Wolthuis W.N.E., Kettenes-Van den Bosch J.J., Van der Kerk-VanHoof A., Hennink W.E. Reaction of dextran with glycidyl methacrylate: an unexpected transesterification // Macromolecules. — 1997. — Vol. 30. — 3411-3413 p .

43 Franssen O., Van Ooijen R.D., de Boer D., Maes R.A.A., Herron J.N., Hennink W.E. Enzymatic degradation of methacrylates dextrans // Macromolecules. — 1997. — Vol. 30. — 7408-7413 p .

44 Stubbe B., Maris B., Van den Mooter G., de Smedt S.C, Demeester J. The in vitro evaluation of azo-containing polysaccharide gels for colon delivery // J .

Controlled Release. — 2001. — Vol. 75. — 103-114 p .

45 Ferreira L., Vidal M.M., Geraldes C.F.G.C., Gil M.H. Preparation and characterization of gels based on sucrose modified with glycidyl methacrylate // Carbohydr. Polym. — 2000. — Vol. 41. — 15-24 p .

46 Marsano E., Bianchi E., Gagliardi S., Ghioni F. Hydroxypropyl-cellulose derivatives: phase behaviour of hydroxypropylcellulose methacrylate // Polymer. — 2000. — Vol. 41. — 533-538 p .

47 Huang L.K., Metha R.C., de Lucca P.P. Evaluation of a statistical model for the formation of poly(acryloyl hydroxyethyl starch) microspheres // Pharm .

Res. — 1997. — Vol. 14. — 475-482 .

48 Kim S.J., Park S.J., Kim S.I. Swelling behavior of interpenetrating polymer network hydrogels composed of poly (vinyl alcohol) and chitosan // Reactive and Functional Polymers. — 2003. — Vol. 55. — 53-59 p .

49. Yih-Wen Gung, Shyh Ming Kuo, Yng-Jiin Wang. Effect of PVA-AA on dentine bonding of HEMA // Biomaterials. — 1997. — Vol. 18. — 367-371 p .

50 Kim S.H., Chu C.C. Synthesis and characterization of dextran-methacrylate hydrogels and structural study by SEM // J. Biomed. Mater. Res. — 2000. — Vol. 49. — 517-527 p .

51. Gunanan C.M., Storie B., Smith P., Knight P.M // Polym.Mater.Sci.Eng. — 1993. — Vol. 69. — 506-507 p .

52. Schmedlen R.H., Masters K.S., West J.L. Photocrosslinkable polyvinyl alcohol hydrogels that can be modified with cell adhesion peptides for use in tissue engineering // Biomaterials. — 2002. — Vol. 23. —4325–4332 p .

53 Patil N.S., Dordick J.S., Rethwisch D.G. Macroporous poly(sucrose acrylate) hydrogels for controlled release of macromolecules // Biomaterials. — 1996 .

— Vol. 17. — 2343-2350 p .

54 Martin B.D., Linhardt R.J., Dordick J.S. Highly swelling hydrogels from orderegalactose-based polyacrylates // Biomaterials. — 1998. — Vol. 19. — 69-76 p .

55 Patil N.S., Li Y., Rethwisch D.G., Dordick J.S. Sucrose diacrylate: A unique chemically and biologically degradable crosslinker for polymeric hydrogels // J. Polym. Sci. Part A Polym. Chem. — 1997. — Vol. 35. — 2221-2229 p .

56 Van Dijk-Wolthuis W.N.E., Van Steenbergen M.J., Underberg W.J.M., Hennink W.E. Degradation kinetics of methacrylated dextrans in aqueous solution // J. Pharm. Sci. — 1997. — Vol. 86. — 413-417 p .

57 Hennink W.E., Talsma H., Borchert J.C.H., de Smedt S.C., Demeester J .

Controlled release of proteins from dextran hydrogels // J. Controlled Release. — 1996. — Vol. 39. — 47-55 p .

58 Van Dijk-Wolthuis W.N.E., Hoogeboom J.A.M., Van Steenbergen M.J., Tsang S.K.Y., Hennink W.E. Degradation and release behaviour of dextran based hydrogels // Macromolecules. — 1997. — Vol. 30. — 4639-4645 p .

59 Franssen O., Vos O.P., Hennink W.E. Delayed release of a model protein from enzymatically degrading dextran hydrogels // J. Controlled Release. — 1997. — Vol. 44. — 237-245 p .

60 Franssen O., Van Rooijen R.D., de Boer D., Maes R.A.A., Hennink W.E .

Enzymatic degradation of crosslinked dextrans // Macromolecules. — 1999 .

— Vol. 32. — 2896-2902 p .

61 Meyvis T.K.L., de Smedt S.C, Demeester J., Hennink W.E. Rheological monitoring of long-term degrading polymer hydrogels // J. Rheol. — 1999 .

— Vol. 43. — 933-950 p .

62 Sawhney A.S., Pathak C.P., Hubbell J.A. Bioerodible hydrogels based on photopolymerized poly(ethylene glycol)-co-poly(-hydroxy acid) diacrylate macromers // Macromolecules. — 1993. — Vol. 26. — 581-587 p .

63 Metters A.T., Anseth K.S., Bowman C.N. Fundamental studies of a novel, biodegradable PEG-b-PLA hydrogel // Polymer. — 2000. — Vol. 41. — 3993-4004 p .

64 West J.L., Hubbell J.A. Photopolymerized hydrogel materials for drug delivery applications // React. Polym. — 1995. — Vol. 25. — 139-147 p .

65 Hubbell J.A. Hydrogel systems for barriers and local drug delivery in the control of wound healing // J. Controlled Release. — 1996. — Vol. 39. — 305-313 p .

66 Lu S., Anseth K.S. Release behaviour of high molecular weight solutes from poly(ethylene glycol)-based degradable networks // Macromolecules. — 2000. — Vol. 33. — 2509-2515 p .

67 Van Dijk-Wolthuis W.N.E., Tsang S.K.Y., Kettenes-van den Bosch J.J., Hennink W.E. A new class of polymerizable dextrans with hydrolyzable groups: hydroxyethyl methacrylated dextran with and without oligolactate spacer // Polymer. — 1997. — Vol. 38. — 6235-6242 p .

68 Cade J.A., de Kerf M., de Groot C.J., den Otter W., Hennink W.E. Synthesis and characterization of 2-(methacryloyloxy)ethyl-(di)-L-lactate and their application in dextran-based hydrogels // Polymer. — 1999. — Vol. 40. — 6877-6881 p .

69 Cade J.A., Van Luyn M.J.A., Brouwer L.A., Plantinga J.A., Van Wachem P.B., de Groot C.J., Otter W., Hennink W.E. In vivo biocompatibility of dextran-based hydrogels // J. Biomed. Mater. Res. — 2000 — Vol. 50 — 397-404 p .

70 Groot C.J., Van Luyn M.J.A., Van Dijk-Wolthuis W.N.E., Cade J.A., Plantinga J.A., Otter W., Hennink W.E. In vitro biocompatibility of biodegradable dextran-based hydrogels tested with human fibroblasts // Biomaterials. — 2001. — Vol. 22. — 1197-1203 p .

71 Cade J.A., Brouwer L.A., Otter W., Hennink W.E., Van Luyn M.J.A. A comparative biocompatibility study of microspheres based on dextran or poly (lactic-co-glycolic acid) after subcutaneous injection in rats // J. Biomed .

Mater. Res. — 2001. — Vol 56. — 600-609 p .

72 Cade J.A., de Groot C.J., Jiskoot W., Otter W., Hennink W. Release of recom-binant human interleukin-2 from dextran-based hydrogels // J .

Controlled Release. — 2001. — Vol. 18. — 1461-1467 p .

73 Stenekes R.J.H., Franssen O., Van Bommel E.M.G., Crommelin D.J.A., Hennink W.E. The preparation of dextran microspheres in an all-aqueous system: effect of the formulation parameters on particle characteristics // Pharm. Res. — 1998. — Vol. 15. — 557-561 p .

74 Franssen O., Van der Vennet L., Roders P., Hennink W.E. Degradable dextran hydrogels: controlled release of a model protein from cylinders and microspheres // J. Controlled Release. — 1999. — Vol. 60. — 211-221 p .

75 Stenekes R.J.H., Loebis A.E., Fernandes C.M., Crommelin D.J.A., Hennink W.E. Controlled release of liposomes from biodegradable dextran microspheres: A novel delivery concept // Pharm. Res. — 2000 — Vol. 17 .

— 690-695 p .

76 Nuttelman C.R., Henry S.M., Anseth K.S. Synthesis and characterization of photocrosslinkable, degradable poly(vinyl alcohol)-based tissue engineering scaffolds. // Biomaterials. — 2002. — Vol. 23. —3617-3626 p .

77 Martens P.J., Bowman C.N., Anseth K.S. Degradable networks formed from multi-functional poly(vinyl alcohol) macromers: comparison of results from a generalized bulk-degradation model for polymer networks and experimental data // Polymer. — 2004. — Vol. 45. — 3377-3387 p .

78 Zhang Y., Won C.Y., Chu C.C. Synthesis and characterization of biodegradable network hydrogels having both hydrophobic and hydrophilic components with controlled swelling behavior // J. Polym. Sci., Part A Polym. Chem. — 1999. — Vol. 37. — 4554-4569 p .

79 Zhang Y., Won C.Y., Chu C.C. Synthesis and characterization of biodegradable hydrophobic-hydrophylic hydrogel networks with a controlled swelling property // J. Polym. Sci., Part A Polym. Chem. — 2000. — Vol. 38 .

— 2392-2404 p .

80 Zhang Y., Chu C.C. Biodegradable dextran-polylactide hydrogel network and its controlled release of albumin // J. Biomed. Mater. Res. — 2000. — Vol .

54 — 1-11 p .

81 Peppas N.A., Benner R.E. Proposed method of intracordal injection and gelation of poly(vinyl alcohol) solution in vocal cords: polymer considerations // Biomaterials. — 1980. — Vol. 1. — 158-162 p .

82 Dai W.S., Barbari T.A. Hydrogel membranes with mesh size asymmetry based on the gradient crosslinking of poly(vinyl alcohol) // J. Membr. Sci. — 1999. — Vol. 156. — 67-79 p .

83 Willmott N., Kamel H.M.H., Cummings J., Stuart J.F.B., Florence A.T .

Adriamycin-loaded albumin microspheres: lung entrapment and fate in the rat. In: Microspheres and Drug Therapy. Pharmaceutical, Immunological and Medical Aspects / Davies S.S., Illum L., Vie J.G., Tomlinson E. — Amsterdam: Elsevier, 1984. —189-205 p .

84 Tabata Y., Ikada Y. Synthesis of gelatin microspheres containing interferon // Pharm. Res. — 1989. — Vol. 6. — 422-427 p .

85 Yamamoto M., Tabata Y., Hong L., Miyamoto S., Hashimoto N., Ikada Y .

Bone regeneration by transforming growth factor 1 released from a biodegradable hydrogel // J. Controlled Release. — 2000. — Vol. 64. — 133p .

86 Jameela S.R., Jayakrishnan A. Glutaraldehyde crosslinked chitosan as a long acting biodegradable drug delivery vehicle: studies on the in vitro release of mitoxantrone and in vivo degradation of microspheres in rat muscle // Biomaterials. — 1995. — Vol. 16. — 769-775 p .

87 Draye J.P., Delaey B., Van der Voorde A., Van den Bulcke A., Bogdanov B., Schacht E. In vitro release characteristics of bioactive molecules from dextran dialdehyde cross-linked gelatin hydrogel films // Biomaterials. — 1998. — Vol. 19. — 99-107 p .

88 Draye J.P., Delaey B., Van de Voorde A., Van den Bulcke A., de Reu B., Schacht E. In vitro and in vivo biocompatibility of dextran dialdehyde crosslinked gelatin hydrogel films // Biomaterials. — 1998. — Vol. 19. — 1677-1687 p .

89. Shafee E. El., Nag H.F. Water sorption in cross-linked poly(vinyl alcohol) networks // Polymer. — 2003. — Vol. 44. — 1647–1653 p .

90. Darwis D., Stasica P., Razzak M.T., Rosiak J. M. Characterization of poly(vinyl alcohol) hydrogel for prosthetic intervertebral disc nucleus // Radiation Physics and Chemistry. — 2002. — Vol. 63. — 539–542 p .

91. Ruiz J., Mantecon A., Cadiz V. Synthesis and properties of hydrogels from poly (vinyl alcohol) and ethylendiaminetetraacetic dianhydride // Polymer. — 2001. — Vol. 43. — 6347-6354 p .

92 Brondsted H., Hovgaard L., Simonsen L. Dextran hydrogels for colonspecific drug delivery. Comparative release study of hydrocortisone and prednisolone sodium phosphate // Stp Pharma Sci. — 1995. — Vol. 5. — 65p .

93 Gehrke H., Uhden L.H., Mc Bride J.F. Enhanced loading and activity retention of bioactive proteins in hydrogel delivery systems // J. Controlled Release. — 1998. — Vol. 55 — 21-33 p .

94 Coviello T., Grassi M., Rambone G., Santucci E., Carafa M., Murtas E.,

Riccieri F.M., Alhaique F. Novel hydrogel system from sceroglycan:

synthesis and characterization // J. Controlled Release. — 1999. — Vol. 60 .

— 367-378 p .

95 Elbert D.L., Luthof M.P., Pratt A.B., Halstenberg S., Hubbell J.A. Protein release from PEG hydrogels that are similar to ideal Flory-Rehner Networks // Proc. Int. Symp. Controlled Release Bioact. Mater. — 2001. — Vol. 28. — 987-988 p .

96 De Nooy A.E.J., Masci G., Crescenzi V. Versatile synthesis of polysaccharide hydrogels using the Passerini and Ugi multicomponent condensations // Macromolecules. — 1999. — Vol. 32. — 1318–1320 p .

97 De Nooy A.E.J., Capitani D., Masci G., Crescenzi V. Ionic polysaccharide

hydrogels via the Passerini and Ugi multicomponent condensations:

synthesis, behavior and solid-state NMR characterization // Biomacromolecules. — 2000. — Vol. 1. — 259–267 p .

98 Ichi T., Watanabe J., Ooya T., Yui N. Controllable erosion time and prole in poly(ethylene glycol) hydrogels by supramolecular structure of hydrolysable polyrotaxane // Biomacromolecules. — 2001. — Vol. 2. — 204–210 p .

99 Caliceti P., Salmaso S., Lante A., Yoshida M., Katakai R., Martellini F., Mei L.H.I., Carenza M. Controlled release of biomolecules from temperaturesensitive hydrogels prepared by radiation polymerization // J. Controlled Release. — 2001. — Vol. 75. — 173–181 p .

100 Peppas N.A., Mikos A.G. Preparation methods and structure of hydrogels. In:

Hydrogels in Medicine and Pharmacy / N.A. Peppas — Florida: CRC Press, Boca Raton, 1986. — Vol. 1. — Chapter 1 101 Peppas N.A., Merrill E.W. Hydrogels as swollen elastic networks // J. Appl .

Polym.Sci. — 1977. — Vol. 21. — 1763–1770 p .

102 Konas P., Athanasssiou V., Merrill E.W. Hydrogels prepared by electron irradiation of poly(ethylene oxide) in water solution: unexpected dependence of crosslink density and protein diffusion coefcients on initial PEO molecular weight // Biomaterials. — 1996. — Vol. 17. — 1547–1550 p .

103 Merrill E.W., Dennison K.A., Sung C. Partitioning and diffusion of solutes in hydrogels of poly(ethylene oxide) // Biomaterials. — 1993. — Vol. 14. — 1117–1126 p .

104 Stringer J.L., Peppas N.A. Diffusion of small molecular weight drugs in radiation-crosslinked poly(ethylene oxide) hydrogels // J. Controlled Release .

— 1996. — Vol. 42. — 195–202 p .

105 Jabbari E., Nozari S. Swelling behavior of acrylic acid hydrogels prepared by

-radiation crosslinking of polyacrylic acid in aqueous solution // Eur. Polym .

J. — 2000. — Vol. 36. — 2685–2692 p .

106 Lee J., Macosko C.W., Urry D.W. Swelling behavior of -irradiation crosslinked elastomeric polypentapeptide-based hydrogels // Macromolecules. — 2001. — Vol. 34. — 4114–4123 p .

107 Lee J., Macosko C.W., Urry D.W. Elastomeric polypentapeptides crosslinked into matrices and bers // Biomacromolecules. — 2001. — Vol. 2. — 170– 179 p .

108. Zhai M., Yoshii F., Kume T., Hashim K. Syntheses of PVA/starch grafted hydrogels by irradiation // Carbohydrate Polymers. — 2002. — Vol. 50. — 295-303 p .

109. Yamamoto Y., Tagawa S. Radiolytically prepared poly(vinyl alcohol) hydrogel containing -cyclodextrin // Radiation Physics and Chemistry. — 2004. — Vol. 69. — 347-349 p .

110 Sperinde J.J., Griffith L.G. Synthesis and characterization of enzymaticallycrosslinked-poly(ethylene glycol) hydrogels // Macromolecules. — 1997. — Vol. 30. — 5255-5264 p .

111 Sperinde J.J., Griffith L.G. Control and predication of gelation kinetics in enzymatically cross-linked poly(ethylene glycol) hydrogels // Macromolecules. — 2000. — Vol. 33. — 5467-5480 p .

112 Westhaus E., Messersmith P.B. Triggered release of calcium from lipid vesicles: a bioinspired strategy for rapid gelation of polysaccharide and protein hydrogels // Biomaterials. — 2001. — Vol. 22. — 453-462 p .

113 Gacesa P. Alginates // Carbohydr. Polym. — 1998. — Vol. 8 — 161-182 p .

114 Goosen M.F.A., O'Shea G.M., Gharapetian H.M., Chou S., Sun A.M .

Optimization of microencapsulation parameters: semipermeable microcapsules as a bioartificial pancreas // Biotechnol. Bioeng. — 1985. — Vol. 27. — 146-150 p .

115 Gombotz W.R., Wee S.F. Protein release from alginate matrices // Adv. Drug Deliv. Rev. — 1998. — Vol. 31. — 267-285 p .

116 Polk A., Amsden B., de Yao K., Peng T., Goosen M.F.A. Controlled release of albumin from chitosan-alginate microcapsules // J. Pharm. Sci. — 1994. — Vol. 83. — 178-185 p .

117 Liu L.S., Liu S.Q., Ng S.Y., Froix M., Ohno T., Heller J. Controlled release of inter-leukin-2 for tumour immunotherapy using alginate/chitosan porous micro-spheres // J. Controlled Release. — 1997. — Vol. 43. — 65-74 p .

118 Andrianov A.K., Payne L.G., Visscher K.B., Allcock H.R., Langer R .

Hydrolytic degradation of ionically crosslinked polyphosphazene microspheres // J. Appl. Polym. Sci. — 1994. — Vol. 53. — 1573-1578 p .

119 Chenite A., Chaput C., Wang D., Combes C., Buschmann M.D., Hoemann C.D., Leroux J.C., Atkinson B.L., Binette F., Selmani A. Novel injectable neutral solutions of chitosan form biodegradable gels in situ // Biomaterials .

— 2000. — Vol. 21. — 2155-2161 p .

120 Hossain K.S., Miyanaga K., Maeda H., Nemoto N. Sol-gel transition behavior of pure -carrageenan in both salt-free and added salt states // Biomacromolecules. — 2001. — Vol. 2. — 442-449 p .

121 Janes K.A., Fresneau M.P., Marazuela A., Fabra A., Alonso M.J. Chitosan nanoparticles as delivery systems for doxorubicin // J. Controlled Release. — 2001. — Vol. 73. — 255-267 p .

122 Yokoyama F., Masada I., Shimamura K., Ikawa T., Monobe K. Morphology and structure of highly elastic poly-(vinyl alcohol) hydrogel prepared by repeated freezing-and-melting // Colloid Polym. Sci. — 1996. — Vol. 264 .

— 595-601 p .

123 Hassan C.M., Peppas N.A. Structure and morphology of freeze/thawed PVA hydrogels // Macromolecules. — 2000. — Vol. 33. — 2472-2479 p .

124 Peppas N.A., Scott J.E. Controlled release from poly(vinyl alcohol) gels prepared by freeze-thawing processes // J. Controlled Release. — 1992. — Vol. 18. — 95-100 p .

125 Takamura A., Ishii F., Hidaka H. Drug release from poly(vinyl alcohol) gel prepared by freeze-thaw procedure // J. Controlled Release. — 1992. — Vol .

20. —21-27 p .

126 Lim D.W., Choi S.H., Park T.G. A new class of biodegradable hydrogels stereocomplexed by enantiomeric oligo(lactide) side chains of poly(HEMAg-OLA)s // Macromol. Rapid Commun. — 2000. — Vol. 21. — 464-471 p .

127 Ikada Y., Jamshidi K., Tsuji H., Hyon S.-H. Stereocomplex formation between en-antiomeric poly(lactides) // Macromolecules. — 1987. — Vol .

20. — 904-906 p .

128 Lim D.W., Park T.G. Stereocomplex formation between enantiomeric PLAPEG-PLA triblock copolymers: characterization and use as protein delivery microparticulate carriers // J. Appl. Polym. Sci. — 2000. — Vol. 75. — 1615p .

129 De Jong S.J., Van Dijk-Wolthuis W.N.E., Kettenes-Van den Bosch J.J., Schuyl P.J.W., Hennink W.E. Monodisperse enantiomeric lactic acid oligomers: preparation, characterization and stereocomplex formation // Macromolecules. — 1998. — Vol. 31. — 6397-6402 p .

130 De Jong S.J., De Smedt S.C., Wahls M.W.C, Demeester J., Kettenes-van den Bosch J.J., Hennink W.E. Novel self-assembled hydrogels by stereocomplex formation in aqueous solution of enantiomeric lactic acid oligomers grafted to dextran // Macromolecules. — 2000. — Vol. 33. — 3680-3686 p .

131 De Jong S.J., De Smedt S.C., Demeester J., Van Nostrum C.F., Kettenes-Van den Bosch J.J., Hennink W.E. Biodegradable hydrogels based on stereocomplex formation between lactic acid oligomers grafted to dextran // J .

Controlled Release. — 2001. — Vol. 72. — 47-56 p .

132 De Jong S.J., Van Eerdenbrugh B., Van Nostrum C.F., Kettenes-Van den Bosch J.J., Hennink W.E. Physically crosslinked dextran hydrogels by stereocomplex formation of lactic acid oligomers: degradation and protein release behavior // J. Controlled Release. — 2001. — Vol. 71. — 261-275 p .

133 Forster S., Antonietti M. Amphiphilic block copolymers in structurecontrolled nanomaterial hybrids // Adv. Mater. — 1998. — Vol. 10. — 195p .

134 Lee D.S., Jeong B., Bae Y.H., Kim S.W. New thermoreversible and biodegradable block copolymer hydrogels // Proc. Int. Symp. Controlled Release Bioact. Mater. — 1996 — Vol. 23. — 228-229 p .

135 Jeong B., Bae Y.H., Kim S.W. Thermoreversible gelation of PEG-PLGAPEG triblock copolymer aqueous solutions // Macromolecules. — 1999. — Vol. 32. — 7064-7069 p .

136 Jeong B., Lee D.S., Shon J.-I., Bae Y.H., Kim S.W. Thermoreversible gelation of poly(ethylene oxide) biodegradable polyester block copolymers // J. Polym. Sci., Part A Polym. Chem. — 1999. — Vol. 37. — 751-760 p .

137 Rashkov I., Manolova N., Li S., Espartero J., Vert M. Synthesis, characterization and hydrolytic degradation of PLA/PEO/PLA triblock copolymers with short poly(L-lactic acid) chains // Macromolecules. — 1996 .

— Vol. 29. — 50-56 p .

138 Li S., Rashkov I., Espartero J., Manolova N., Vert M. Synthesis, characterization and hydrolytic degradation of PLA/PEO/PLA triblock copolymers with long poly(L-lactic acid) blocks // Macromolecules. — 1996 .

— Vol. 29. — 57-62 p .

139 Hu D.S.G., Liu H.J. Structural analysis and degradation behavior in polyethylene glycol/poly(L-lactide) copolymers // J. Appl. Polym. Sci. — 1994. — Vol. 51. — 473-482 p .

140 Kricheldorf H., Meier-Haack J. Polylactones 22. ABA triblock copolymers of L-lactide and poly(ethylene glycol) // Makromol. Chem. — 1993. — Vol .

194. — 715-725 p .

141 Li Y., Kissel T. Synthesis and properties of biodegradable ABA triblock copolymers consisting of poly(L-lactic acid) or poly(L-lactic-co-glycolic acid) A-blocks attached to central poly(oxyethylene) B-blocks // J. Controlled Release. — 1993. — Vol. 23. — 247-257 p .

142 Molina I., Li S., Martinez M.B., Vert M. Protein release from physically crosslinked hydrogels of the PLA/PEO/PLA triblock copolymer-type // Biomaterials. — 2001. — Vol. 22. — 363-369 p .

143 Witt C., Mder K., Kissel T. The degradation, swelling and erosion properties of biodegradable implants prepared by extrusion or compression moulding of poly(lactide-co-glycolide) and ABA triblock copolymers // Biomaterials. — 2000. — Vol. 21. — 931-938 p .

144 Witt C., Kissel T. Morphological characterization of microspheres, films and implants prepared from poly(lactide-co-glycolide) and ABA triblock copolymers: is the erosion controlled by degradation, swelling or diffusion // Eur. J. Pharm. Biopharm. — 2001. — Vol. 51. — 171-181 p .

145 Pistel K., Bittner B., Koll H., Winter G., Kissel T. Biodegradable recombinant human erythropoietin loaded microspheres prepared from linear and star-branched block copolymers: influence of encapsulation technique and polymer composition on particle characteristics // J. Controlled Release .

— 1999. — Vol. 59. — 309-325 p .

146 Bittner B., Witt C., Mader K., Kissel T. Degradation and protein release properties of microspheres prepared by biodegradable poly(lactide-coglycolide) and ABA triblock copolymers: influence of buffer media on polymer erosion and bovine serum albumin release // J. Controlled Release .

— 1999. — Vol. 60. — 297-309 p .

147 Li Y., Volland C., Kissel T. In vitro degradation and bovine serum albumin release of the ABA triblock copolymers consisting of poly(L(+) lactic acid or poly(L(+) lactic acid-co-glycolic acid) A-blocks attached to central polyoxyethylene B-blocks // J. Controlled Release. — 1994. — Vol. 32. — 121-128 p .

148 Huh K.M., Bae Y.H. Synthesis and characterization of poly(ethylene glycol)/ poly(L-lactic acid) alternating multiblock copolymers // Polymer. — 1999. — Vol 40. — 6147-6155 p .

149 Bae Y.H., Huh K.M., Kim Y., Park K.H. Biodegradable amphiphilic multiblock copolymers and their implications for biomedical applications // J .

Controlled Release. — 2000. — Vol. 64. — 3-13 p .

150 Jeong B., Kibbey M.R., Birnbaum J.C., Won Y.Y., Gutowska A .

Thermogelling biodegradable polymers with hydrophilic backbones: PEG-gPLGA // Macromolecules. — 2000. — Vol. 33. — 8317-8322 p .

151 Bezemer J.M., Grijpma D.W., Dijkstra P.J., Van Blitterswijk C.A., Feijen J .

A controlled release system for proteins based on poly(ether ester) blockcopolymers: polymer network characterization // J. Controlled Release. — 1999. — Vol. 62. — 393–405 p .

152 Bezemer J.M., Radersma R., Grijpma D.W., Dijkstra P.J., Feijen J., Van Blitterswijk C.A. Zero-order release of lysozyme from poly(ethylene glycol)/poly(butylene tere-phthalate) matrices // J. Controlled Release. — 2000. — Vol. 64. — 179-192 p .

153 Bezemer J.M., Grijpma D.W., Dijkstra P.J., Blitterswijk C.A., Feijen J .

Control of protein delivery from amphiphilic poly(ether ester) multiblock copolymers by varying their water content using emulsification techniques // J. Controlled Release. — 2000. — Vol. 66. — 307-320 p .

154 Bezemer J.M., Radersma R., Grijpma D.W., Van Blitterswijk C.A., Feijen J .

Micro-spheres for protein delivery prepared from amphiphilic multiblock copolymers. Influence of preparation techniques on particle characteristics and protein delivery // J. Controlled Release. — 2000. — Vol.67. — 233-248 p .

155 Bezemer J.M., Radersma R., Grijpma D.W., Van Blitterswijk C.A., Feijen J .

Micro-spheres for protein delivery prepared from amphiphilic multiblock copolymers. Modulation of release rate // J. Controlled Release. — 2000. — Vol.67. — 249-260 .

156 Akiyoshi K., Deguchi S., Moriguchi N., Yamaguchi S., Sunamoto J. Selfaggregates of hydrophobized polysaccharides in water — formation and characteristics of nanoparticles // Macromolecules. — 1993. — Vol. 26. — 3062-3068 p .

157 Akiyoshi K., Deguchi S., Tajima H., Nishikawa T., Sunamoto J. Microscopic structure and thermoresponsiveness of a hydrogel nanoparticle by selfassembly of a hydrophobized polysaccharide // Macromolecules. — 1997. — Vol. 30. —857-861 p .

158 Akiyoshi K., Taniguchi I., Fukui H., Sunamoto J. Hydrogel nanoparticle formed by self-assembly of hydrophobized polysaccharide. Stabilization of adriamycin by complexation // Eur. J. Pharm. Biopharm. — 1996. — Vol. 42 .

— 286-290 p .

159 Akiyoshi K., Kobayashi S., Shichibe S., Mix D., Baudys M., Kim S.W., Sunamoto J. Self-assembled hydrogel nanoparticle of cholesterol-bearing pullulan as a carrier of protein drugs: Complexation and stabilization of insulin // J. Controlled Release. — 1998. — Vol. 54 (1998) 313-320 .

160 Akiyoshi K., Deguchi S., Tajima H., Nishikawa T., Sunamoto J. Microscopic structure and thermoresponsiveness of a hydrogel nanoparticle by selfassembly of a hydrophobized polysaccharide // Macromolecules. — 1997. — Vol. 30. — 857-861 p .

161 Taniguchi I., Akiyoshi K., Sunamoto J. Self-aggregate nanoparticles of cholesteryl and galactoside groups-substituted pullulan and their specific binding to galac-tose specific lectin, RCA120 // Macromol. Chem. Phys. — 1999. —Vol. 200. — 1555-1560 p .

162 Akiyoshi K., Kang E.-C., Kurumada S., Sunamoto J. Controlled association of amphiphilic polymers in water: thermosensitive nanoparticles formed by self-assembly of hydrophobically modified pullulans and poly(Nisopropylacrylamides) // Macromolecules. — 2000. — Vol. 33. — 3244-3249 p .

163 Na K., Park K.H., Kim S.W., Bae Y.H. Self-assembled hydrogel nanoparticles from curdlan derivatives: characterization, anti-cancer drug release and interaction with a hepatoma cell line (HepG2) // J. Controlled Release. — 2000. — Vol. 69. — 225-236 p .

164 Uchegbu I.F., Schatzlein A.G., Tetley L., Gray A.I., Sludden J., Siddique S., Mosha E., Polymeric chitosan-based vesicles for drug delivery // J. Pharm .

Pharmacol. — 1998. — Vol. 50. — 453-458 p .

165 Sludden J., Uchegbu I.F., Schatzlein A.G. The encapsulation of bleomycin within chitosan based polymeric vesicles does not alter its biodistribution // J .

Pharm. Pharmacol. — 2000. — Vol. 52. — 377-382 p .

166 Noble L., Gray A.I., Sadiq L., Uchegbu I.F. A non-covalently cross-linked chitosan based hydrogel // Int. J. Pharm. — 1999. — Vol. 192. — 173-182 p .

167 Qu X., Wirsen A., Albertsson A.C. Structural change and swelling mechanism of pH-sensitive hydrogels based on chitosan and D,L-lactic acid // J. Appl. Polym. Sci. — 1999. — Vol. 74. — 3186-3192 p .

168 Qu X., Wirsn A., Albertsson A.C. Novel pH-sensitive chitosan hydrogels:

swelling behavior and states of water // Polymer. — 2000. — Vol. 41. — 4589-4598 p .

169 Yazdani-Pedram M., Retuert J., Quijada R. Hydrogels based on modified chitosan, 1 — Synthesis and swelling behavior of poly(acrylic acid) grafted chitosan, Macromol. Chem. Phys. — 2000. — Vol. 201. — 923-930 p .

170 Kim S.Y., Cho S.M., Lee Y.M., Kim S.J. Thermo- and pH-responsive behaviors of graft copolymer and blend based on chitosan and Nisopropylacrylamide // J. Appl. Polym. Sci. — 2000. — Vol. 78. — 1381p .

171 Huh K.M., Hashi J., Ooya T., Yui N. Synthesis and characterization of dextran grafted with poly(N-isopropylacrylamide-co-N,Ndimethylacrylamide // Macromol. Chem. Phys. — 2000. — Vol. 201 — 613p .

172 Kurian P., Zschoche S., Kennedy J.P. Synthesis and characterization of novel amphiphilic block copolymers di-, tri-, multi-, and star blocks of PEG and PIB // J. Polym. Sci., Part A Polym. Chem. — 2000. — Vol. 38. — 3200p .

173 Cho C.-S., Jeong Y.-I., Kim S.-H., Nah J.-W., Kubota M., Komoto T .

Thermoplastic hydrogel based on hexablock copolymer composed of poly(benzyl-L-glutamate) and poly(ethylene oxide) // Polymer. — 2000. — Vol. 41. — 5185-5193 p .

174 S.C. Lee, C Kim, I.C Kwon, Y.H. Kim, Thermosensitive hydrogels based on poly(2-ethyl-2-oxazoline)/poly(-caprolactone) multiblock copolymers, Proc .

Int. Symp. Controlled Release Bioact. Mater. — 1998. — Vol. 25. — 717p .

175 Lin H.H., Cheng Y.L. In-situ thermoreversible gelation of block and star copolymers of poly(ethylene glycol) and poly(N-isopropylacrylamide) of varying architectures // Macromolecules. — 2001. — Vol. 34. — 3710-3715 p .

176 Matyjaszewski K., Beers K.L.,. Kern A, Gaynor S.G. Hydrogels by atom transfer radical polymerization. I. Poly (N-vinylpyrrolidinone-g-styrene) via the macromonomer method // J. Polym. Sci., Part A Polym. Chem. — 1998 .

— Vol. 36. — 823-830 p .

177 Ming W., Zhao Y., Cui J., Fu S., Jones F.N. Formation of irreversible nearly transparent physical polymeric hydrogels during a modified microemulsion polymerization, Macromolecules. — 1999. — Vol. 32. — 528-530 p .

178 Eagland D., Crowther N.J., Butler C.J. Complexation between polyoxyethylene and polymethacrylic acid — The importance of the molar mass of polyethylene, Eur. Polym. J. — 1994. — Vol. 30. — 767-773 p .

179 Bell C.L., Peppas N.A. Modulation of drug permeation through interpolymer complexed hydrogels for drug delivery applications // J. Controlled Release .

— 1996. — Vol. 39. — 201-207 p .

180 Mathur A.M., Hammonds K.F., Klier J., Scanton A.B. Equilibrium swelling of poly(methacrylic acid-g-ethylene glycol) hydrogels // J. Controlled Release. — 1998. — Vol. 54. — 177-184 p .

181 Haglund B.O., Joshi R., Himmelstein K.J. An in situ gelling system for parenteral delivery // J. Controlled Release. — 1996. — Vol. 41. — 229-235 p .

182 Nagahara S., Matsuda T. Hydrogel formation via hybridization of oligonucleo-tides derivatized in water-soluble vinyl polymers // Polym. Gels Networks. — 1996. — Vol. 4. — 111-127 .

183 K.P. McGrath, M.J. Fournier, T.L Mason, D.A. Tirrell, Genetically directed syntheses of new polymeric materials — expression of artificial genes encoding proteins with repeating (AlaGly)3ProGluGly elements // J. Am Chem. Soc. — 1992. — Vol. 114. — 727-733 p .

184 Cappello J., Crissman J., Dorman M., Mikolajczak M., Textor G., Marquet M., Ferrari F. Genetic-engineering of structural protein polymers // Biotechnol. Prog. — 1990. — Vol. 6. — 198-202 p .

185 Yoshikawa E., Fournier M.J., Mason T., Tirrell D.A. Genetically engineered fluoropolymers. Synthesis of repetitive polypeptides containing pfluorophenylalanine residues // Macromolecules. — 1994. — Vol. 27. — 5471-5475 p .

186 Cappello J., Crissman J.W., Crissman M., Ferrari F.A., Textor G., Wallis O., Whitledge J.R., Zhou X., Burman D., Aukerman L., Stedronsky E.R. In-situ self-assembling protein polymer gel systems for administration, delivery, and release of drugs // J. Controlled Release. — 1998. — Vol. 53. — 105-117 p .

187 Petka W., Harden J., McGrath K., Wirtz D., Tirrell D.A. Reversible hydrogels from self-assembling artificial proteins // Science. — 1998. — Vol .

281. — 389-392 p .

188 Wang C., Stewart R.J., Kopecek J. Hybrid hydrogels assembled from synthetic polymers and coiled-coil protein domains // Nature. — 1999. — Vol. 397. — 417-420 p .

189 Tang A., Wang C., Stewart R.J., Kopecek J. The coiled coils in the design of protein-based constructs: hybrid hydrogels and epitope displays // J .

Controlled Release. — 2001. — Vol. 72. — 57-70 p .

190 Chen L., Kopecek J., Stewart R.J. Responsive hybrid hydrogels with volume transitions modulated by a titin immunoglobulin module // Bioconjug. Chem .

— Vol. 11. — 734-740 p .

191 Miyata T., Asami N., Uragami T. Preparation of an antigen-sensitive hydrogel using antigen-antibody bindings // Macromolecules. — 1999. — Vol. 32. —2082-2084 p .

192 Miyata T., Asami N., Uragami T. A reversibly antigen-responsive hydrogel // Nature. — 1999. — Vol. 399. — 766-769 p .

193. Лозинский В.И. Криогели на основе природных и синтетических полимеров: получение, свойства и области применения // Успехи химии .

— 2002. — Т. 71, № 6. — 559-585 c .

194. Рихтер M., Аугустат 3., Ширбаум Ф. Избранные методы исследования крахмала: перевод с немецкого (под ред. Н. П. Козьмпной и В. С .

Грюнера). — M.: Пищевая промышленность, 1975. — 183 с .

195. Lozinsky V. I., Vainerman E. S., Rogozhin S. V. Study of cryostructurization of polymer systems. II. The influence of freezing of a reacting mass on the properties of products in the preparation of covalently cross-linked gels // Colloid and Polymer Science. — 1982. — Vol. 260, № 8. — 776-780 p .

196. Hsieh C.Y., Tsai S.P., Ho M.H., D.M. Wang, Liu C.E., Hsieh C.H., R-C .

Tseng, H.-J. Hsieh. Analysis of freeze-gelation and cross-linking processes for preparing porous chitosan scaffolds // Carbohydrate Polymers. — 2007 .

— Vol. 67, № 1. —124-132 p .

197. Noppe W., Plieva F. M., Vanhoorelbeke K., Deckmyn H., Tuncel M., Tuncel A., Galaev I.Yu., Mattiasson B. Macroporous monolithic gels, cryogels, with immobilized phages from phage-display library as a new platform for fast development of affinity adsorbent capable of target capture from crude feeds // Journal of Biotechnology. — 2007. — Vol. 131, № 3. —293-299 p .

198. Damshkaln L.G., Simenel L.A., Lozinsky V.I. Study of cryostructurization ofpolymer systems. XV. Study of cryostructuration of polymer systems. XV .

Freeze–Thaw-induced formation of cryoprecipitate matter from lowconcentrated aqueous solutions of poly(vinyl alcohol) // Journal of Applied Polymer Science. — 1999. — Vol. 74, № 8. —1978–1986 p .

199. Сергеев Г.Б., Батюк В.А. Криохимия. — М.: Химия, 1978. — 296 с .

200. Сергеев Г.Б., Батюк В. А. Реакции в многокомпонентных замороженных системах // Успехи химии. — 1976. — Т. 45, № 5. —793-826 c .

201. Konstantinova N.R., Lozinsky V.I. Cryotropic gelation of ovalbumin solutions // Food Hydrocolloids. — 1997. — Vol. 11, № 2. — 113–123 p .

202. Lozinsky V.I., Golovina T.O., Gusev D.G. Study of cryostructuration of polymer systems: XIII. Some characteristic features of the behaviour of macromolecular thiols in frozen aqueous solutions // Polymer. — 2000. — Vol. 4. — 35-47 p .

203. Лозинский В.И. Криогели на основе природных и синтетических полимеров: получение, свойства и области применения // Успехи химии .

— 2002. — Т. 71, № 6. —559-585 с .

204 Моргачёва А. А., Артюхов А. А., Панов А. В., Гордиенко М. Г., Межуев Я.О., Штильман М. И. Синтез поливинилового спирта с метакрилатными группами и гидрогелей на его основе // Журнал прикладной химии. — 2015. —Т. 88, вып. 4. — 617-621 с 205 Моргачёва А.А., Артюхов А.А., Флегонтов П.А., Жаворонок Е.С., Штильман М.И., Панов А.В. Новые метакрилатосодержащие производные гидроксиэтилкрахмала // Журнал общей химии. — 2016 .

— Т. 86, № 4. — 699-704 с 206 Rosiak J.M., Ulanski P. Synthesis of hydrogels by irradiation of polymers in aqueous solution // Radiation Physics and Chemistry. — 1999. — Vol. 55. — 139-151 p .

207 Дуфлот А.В., Китаева Н.К., Артюхов А.А., Дуфлот В.Р., Штильман М.И .

Радиационно-химический синтез и свойства гидрогелей на основе модифицированного поливинилового спирта // Все материалы .

Энциклопедический справочник. — 2013. — № 2. — 31-38 с .

208 Ожиганов В.В. Структурно-кинетические аспекты формирования густосетчатых макромолекулярных структур в присутствии полимеров разветвленного строения: автореф. дис… канд. хим. наук: 02.00.06/ Ожиганов Виктор Викторович. — М., 2010. — 26 с .

209 Семчиков Ю.Д. Высокомолекулярные соединения. — Н. Новгород: Издво Нижегородского государственного университета имени Н.И. Лобачевского, 2003. — 367 с .

210 Тагер А.А. Физико-химия полимеров. — М.: Научный мир, 2007. — 576 с .

211. Нестеров А.Е. Справочник по физической химии полимеров в трех томах. Т 1. Свойства растворов и смесей полимеров. — Киев: Наукова Думка, 1984. — 374 с .

212 Артюхов А.А., Моргачева А.А., Кусков А.Н., Штильман М.И.Биодеградируемые макропористые полимерные гидрогели на основе поливинилового спирта и 2-гидроксиэтилкрахмала // Все материалы. Энциклопедический справочник. — 2016. — № 4. — 2-8 с .

213 Дубровский С.А., Сорокина Н.В., Артюхов А.А., Штильман М.И .

Необычные осмотические свойства гидрогелей поливинилового спирта, получаемых через макромеры // «Полимеры 2012». XIII Ежегодная научная конференция отдела полимеров и композиционных материалов Сборник трудов. — М.: ИХФ РАН, 2012. — 125 с 214 Obukhov S. P., Rubinstein M., Colby R. H. Network modulus and superelasticity // Macromolecules. — 1994. — Vol. 27, № 12. — 3191–3198 p .

215 James H. M., Guth E. Simple presentation of network theory of rubber, with a discussion of other theories // J. Polym. Sci. — 1949. — Vol. 4, № 2 — 153– 182 p .

216 Katchalsky A., Michaely I. Polyelectrolyte gels in salt solutions //J. Polym .

Sci. — 1955. — Vol. 15, № 79. —69–86 p .

217 Wall F. T., Flory P. J. Statistical thermodynamics of rubber elasticity // J .

Chem. Phys. — 1951. — Vol. 19, № 12. — 1435–1439 p .

218 James, H. M. Statistical properties of networks of flexible chains // J. Chem .

Phys. — 1947. — Vol. 15, № 9. —651–668 p .

219 Дубровский С. А., Харитонова Л. А. Упругость гидрогелей, получаемых фотополимеризацией макромономеров полиэтиленоксида // Высокомолек. соед., А. — 2004. — Т. 46, № 9. — 1505– 1510 с .

220 Дубровский С.А. Набухание и упругость слабосшитых полимерных гидрогелей: дис… д-ра физ.-мат. наук: 02.00.06 / Дубровский Сергей Александрович. — М., 2008. — 408 с .

221 Geissler E., Hecht A.-M., Horkay F., Zrinyi M. Congressional modulus of swollen polyacrylamide networks // Macromolecules. — 1988. — Vol. 21, № 8 — 2594-2599 p .

222 Muta H., Miwa M., Satoh M. Ion-specific swelling of hydrophilic polymer gels // Polymer. — 2001. — Vol. 42. — 6313-6316 p .

223 Де Жен П. Концепция скейлинга в физике полимеров. — М.: Мир, 1982 .

— 448 c .

224 Baker J. P., Le H. Hong, Blanch H. W., Prausnitz J. M. Effect of initial total monomer concentration on the swelling behavior of cationic acrylamidebased hydrogels // Macromolecules. — 1994. — Vol. 27. — 1446-1454 p .

225 Берлин Ал.Ал., Вольфсон С.А., Ениколопян Н.С. Кинетика полимеризационных процессов. — М.: Химия, 1978. — 320 с .

226 James, H. M. Statistical properties of networks of flexible chains // J. Chem .

Phys. — 1947. — Vol. 15, № 9. —651–668 p .

227 Де Жен П. Концепция скейлинга в физике полимеров. — М.: Мир, 1982 .

— 448 c .

228 McKenna G. В., Horkay F., Effect of crosslinks on thethermodynamics of poly(vinyl alcohol) hydrogels // Polymer. — 1994. — Vol. 26, № 35. — 5737-5742 p .

229 Martens P., Blundo J., Nilasaroya A, Odell R A., Cooper-White J., PooleWarren L. A. Effect of Poly(vinyl alcohol) Macromer Chemistry and Chain Interactions on Hydrogel Mechanical Properties // Chem. Mater. — 2007. — Vol. 19. — 2641-2648 p .

230 P. Martens, K.S. Anseth, Characterization of hydrogels formed from acrylate modified poly(vinyl alcohol) macromers // Polymer. — 2000. — Vol. 41. — 7715-7722 p .

231 Ковалева C.C., Струсовская Н.Л., Ферапонтов Н.Б. Особенности поведения сшитого поливинилового спирта в водных растворах низкомолекулярных электролитов // Сорбционные и хроматографические процессы. — 2006. — Т. 6, Вып.2. — 198-210 с .

232 Peppas N.A., Merrill E.W. Determination of interaction parameter for poly(vinyl alcohol) and water in gels crosslinked from solutions // J. Polym .

Sci. Polym. Chem. Ed. — 1976. — Vol. 14. — 459-464 p .

233 Paradossi G., Cavalieri F., Capitani D., Crescenzi V. Physicochemical Characterization of Chemical Hydrogels Based on PVA // J. Polym. Sci.: Part B: Polym. Phys. — 1999. — Vol. 37. — 1225-1233 p .

234 Shapiro L., Cohen S. Novel alginate sponges for cell culture and transplantation // Biomaterials. — 1997. — Vol. 18. — 583-593 p .

235 Chen J., Park P., Park K. Synthesis of superporous hydrogel: Hydrogels with fast swelling and superabsorbent properties // Biomed. Mater. Res. — 1999 .

— Vol. 44. — 53-62 p .

236 Chen J, Blevins W.E, Park H, Park K. Gastric retention properties of superporous hydrogel composites //J Controlled Rel. — 2000. — Vol.64. — 39-51 p .

237 Horak D., Lednicky F., Bleha M. Effect of inert components on the porous structure of 2-hydroxyethyl methacrylate–ethylene dimethacrylate copolymers // Polymer. — 1996. — Vol. 37. — 4243–4249 p 238 Liu Q, Hedberg E.L., Liu Z., Bahulekar R., Meszlenyi R.K., Mikos A.G .

Preparation of macroporous poly(2-hydroxyethyl methacrylate) hydrogels by enhanced phase separation // Biomaterials. — 2000. — Vol. 21. — 2163p .

239 Lozinsky V.I., Plieva F.M., Galaev I.Yu. The potential of polymeric cryogels in bioseparation // Bioseparation. — 2001. — Vol. 10. — 163-188 p .

240 Oxley H.R, Corkhill P.H., Fitton J.H., Tighe B.J. Macroporous hydrogels for biomedical applications: methodology and morphology // Biomaterials. — 1996. — Vol.14. — 1064–1072 p .

241 Padn M., Lesn P., Fiala J., Vack J., lof M., Michlek J., Sukova E .

Macroporous hydrogel based on 2-hydroxyethylmethacrilate. Part 1 .

Copolymers of 2-hydroxyethylmethacrilate with methacrilic acid // Collect .

Czech.Commun. — 2003. — Vol. 68. — 812-822 p .

242 Штильман М.И., Артюхов А.А., Золотайкина Т.С., Коршак А.Ю., Горчаков А.В., Тсатсакис А.М. Сшитые макропористые полимерные гидрогели поливинилового спирта: исследование влияния условий синтеза// Пластические массы. — 2005. — №12. — 27-29 с .

243 Shtilman M.I., Artyukhov A.A., Zolotaikina T.S., Korshak A.Yu., Gorchakov A.V., Tsatsakis A.M. Crosslinked macroporous polymeric hydrogels of polyvinyl alcohol: a study of the influence of the synthesis conditions // International Polymer Science and Technology. — 2006. — Vol. 33, № 10 —25-29 p .

244 Артюхов А.А., Штильман М.И., Чалых А.Е., Золотайкина Т.С.,

Тсатсакис А.М. Макропористые гидрогели поливинилового спирта:

исследование формирования структуры // Пластические массы. — 2006 .

— № 1. —27-31 с .

245 Артюхов А.А., Голунова А.С., Пашкова Л.И., Кусков А.Н., Лесовой Д.Е., Фомина А.П., Штильман М.И. Макропористые полимерные гидрогели поливинилового спирта, содержащие аминогруппы // Пластические массы. — 2010. — № 4. — 15-21 с .

246 Artyukhov A.A., Shtilman M.I. Kuskov A.N. Fomina A.P., Lisovyy D.E .

Golunova A.S. Tsatsakis A.M. Macroporous polymeric hydrogels formed from acrylate modified polyvinyl alcohol macromers // Journal of polymer research. — 2011 —Vol. 18, № 4. —. 667-673 p .

[247] Артюхов А.А., Голунова А.С., Штильман М.И. Макропористые гидрогели сшитого поливинилового спирта, содержащие карбоксильные группы // Энциклопедия инженера-химика. — 2011. — №11. — 13-21 c .

248 Artyukhov A.A., Shtilman M.I., Kuskov A.N., Pashkova L.I., Tsatsakis A.M., Rizos A.K.. Polyvinyl alcohol cross-linked macroporous polymeric hydrogels: structure formation regularities investigation // Journal of noncrystalline solids. — 2010. — Vol.357, №2. — 700 -706 p .

249 Артюхов А.А., Моргачева А.А., Кусков А.Н., Штильман М.И.Биодеградируемые макропористые полимерные гидрогели на основе поливинилового спирта и 2-гидроксиэтилкрахмала // Все материалы. Энциклопедический справочник. — 2016. — № 4. — 2-8 с .

250 Lozinsky V.I. A brief history of polymeric cryogel // Advances in Polymer Science. — 2014. — V. 263. —24-38 p .

251 Штильман М.И., Артюхов А.А., Чалых А.Е., Семенчук О.В., Тсатсакис А.М. Криогели ионогенных мономеров // Пластические массы. — 2006 .

— №3. —21-25 с .

252. Ferry P.W. Melchels, Ana M.C. Barradas, Clemens A. van Blitterswijk, Jan de Boer, Jan Feijen, Dirk W. Grijpmaю Effects of the architecture of tissue engineering scaffolds on cell seeding and culturing // Acta Biomaterialia. — 2010. — Vol. 6, № 11. — 4208–4217 p .

253 Murphy C.M., Haugh M.G., O’Brien F.J. The effect of mean pore size on cell attachment, proliferation and migration in collagen-glycosaminoglycan scaffolds for bone tissue engineering // Biomaterials. — 2010. — Vol. 31. — 461–466 p .

254 Козлов В.С. Эпоксидсодержащие криогели 2-гидроксиэтилметакрилата :

дис. … канд. хим. наук: 02.00.06 / Козлов Василий Сергеевич. — М.:

РХТУ, 2003. — 136 с .

255 Чалых А.Е., Штильман М.И., Артюхов А.А. Строение пористых гидрогелей // Структура полимеров. — 2004. — 35-41 с .

256 Чалых А.Е., Штильман М.И., Артюхов А.А. Упругие свойства криогелей поливинилового спирта // Структура полимеров. — 2004. — 42-46 с .

257 Сидорова А.С., Голунова А.С., Артюхов А.А., Штильман М.И. Сорбция белка на поверхности макропористых полимерных гидрогелей на основе модифицированного поливинилового спирта // Успехи в химии и химической технологии: сб. науч. тр. – М.: РХТУ им. Д.И. Менделеева .

— 2012. — Том XXVI, № 1 (130) — 88-93 с .

258 Macroporous hydrogels based on 2-hydroxyethyl methacrylate. Part 3 .

Hydrogels as carriers for immobilization of proteins. Michlek J., Padn M., Artyukhov A., louf M., Smetana K. // Journal of Materials Science: Material in Medicine. — 2005. — Vol. 16, № 8. — 783-786 p .

259. Surface and Interfacial Aspects of Biomedical Polymers / Andrade J. D. — New York: Plenum Press, 1985, Vol. 2 — 347 p .

260 Sukhanova T., Semenikhina M., Artyukhov A., Prudchenko I., Shtilman M., Markvicheva E. Delta-sleep inducing peptide entrapped in polymer matrices for biomedical applications // FEBS Journal. — 2010. — Vol. 277. — 250Sukhanova T.V., Artyukhov A.A., Prudchenko I.A., Golunova A.C., Semenikhina M. A., Shtilman M.I., Markvicheva E.A.. Entrapment and in vitro release of delta_sleep inducing peptide from polymer hydrogels based on modified polyvinyl alcohol // Biochemistry (Moscow) Supplement Series B: Biomedical Chemistry. — 2012. — Vol. 6, №. 2. —. 149–155 p 262 Kuskov A.N., Voskresenskaya A.A., Goryachaya A.V., Artyukhov A.A., Shtilman M.I., Tsatsakis A.M. Preparation and characterization of amphiphilic poly-N-vinylpyrrolidone nanoparticles containing indomethacin // Journal of Materials Science: Materials in Medicine. — 2010. — Vol .

21. № 5. — 1521-1530 p .

263 Ланина С.Я., Суслова В.Ю., Беняев Н.Е. Токсикологическая и биологическая безопасность медицинских изделий // Медицинские технологии. — 2011. — №4. — 31-35 с .

264 Ланина С.Я. Санитарно-химические исследования как обязательный этап в оценке безопасности полимерных материалов и изделий для медицины // 1-я Международная научно-практическая конференция «Современные полимерные материалы в медицине и медицинской технике». — С.-Петербург, 2005. — 216-221 с .

265 Лаппо В.Г., Ланина С.Я., Тимохина В.И. Токсиколого-гигиенический контроль полимеров и изделий медицинского назначения // Ж .

Всесоюзного химического общества им. Д.И.Менделеева. — 1985. — Т. ХХХ, № 4. —461-465 с .

266 Предельно допустимые количества химических веществ, выделяющихся из материалов, контактирующих с пищевыми продуктами .

Гигиенические нормативы. ГН 2.3.3.972-00. МЗ РФ. — М., 2000. —16-25 с .

267 Ланина С. Я., Ивлев Л. Я., Вдовина З. Н. Методологические и методические вопросы гигиены и токсикологии полимерных материалов и изделий медицинского назначения. Научный обзор. — М., 1982. — 61с .

268 ГОСТ Р ИСО 10993.12-99 Изделия медицинские. Оценка биологического действия медицинских изделий. Часть 12 .

Приготовление проб и стандартные образцы. — М.: ИПК Издательство стандартов, 2000. — 16 с .

269 ГОСТ Р 50855-96 Контейнеры для крови и ее компонентов. Требования химической и биологической безопасности и методы испытаний. — М.:

ИПК Издательство стандартов, 1996. — 46 с .

270 Стандарты серии ГОСТ Р ИСО 10993 «Оценка биологического действия медицинских изделий: Ч.9. Основные принципы идентификации и количественного определения потенциальных продуктов деструкции .

271 Ермаченко Л.А. Атомно-абсорбционный анализ в санитарногигиенических исследованиях / Л.Г. Подунова. — М.: Чувашия, 1997. — 208 c .

272 ГОСТ Р ИСО 10993-4-2009 Изделия медицинские. Оценка биологического действия медицинских изделий. Часть 4. Исследование изделий, взаимодействующих с кровью. — М.: Стандартинформ, 2010 .

— 32 с .

273 ГОСТ Р ИСО 10993-5-2009 Изделия медицинские. Оценка биологического действия медицинских изделий. Часть 5. Исследование на цитотоксичность: методы «in vitro». — М.: Стандартинформ, 2010. — 16 с .

274 ГОСТ Р ИСО 10993-10-2009 Изделия медицинские. Оценка биологического действия медицинских изделий. Часть 10. Исследование раздражающего и сенсибилизирующего действия. — М.:

Стандартинформ, 2010. — 42 с .

275 ГОСТ Р ИСО 10993-11-2009 «Изделия медицинские. Оценка биологического действия медицинских изделий. Часть 11. Исследование общетоксического действия. — М.: Стандартинформ, 2009. — 27 с .

276 Назаренко Г.И., Кишкун А.А. Клиническая оценка результатов лабораторных исследований. — М.: Медицина. - 2000. — 544 с .

277 ГОСТ Р ИСО 10993-3-2009 Изделия медицинские. Оценка биологического действия медицинских изделий. Часть 3. Исследование генотоксичности, канцерогенности и токсического действия на репродуктивную функцию — М.: Стандартинформ, 2009. — 20 с .

278 Altankov G., Richau K., Groth Th. The role of surface zeta potential and substratum chemistry for regulations of dermal Fibroblast interaction // Materialwissenschaft und Werkstofftechnik. — 2003. — Vol 34, № 12.— 1120—1128 p .

279 Lee J.H., Jung H.W., Kang I.-K., Lee H.B. Cell behaviour on polymer surfaces with different functional groups // Biomaterials. — 1994. — Vol. 15 .

— 705–711 p .

280 Chen H., Huang J., Yu J., Liu S., Gu P. Electrospun chitosan-graft-poly ( caprolactone)/poly (-caprolactone) cationic nanofibrous mats as potential scaffolds for skin tissue engineering // Int. J. Biol. Macromol. — 2011. — Vol. 48. — 13–19 p .

281 J.H. Lee, J.W. Lee, G. Khang, H.B. Lee. Interaction of cells on chargeable functional group gradient surfaces // Biomaterials. — 1997. — Vol. 18. — 351–358 p .

282 Kishida A., Iwata H., Tamada Y., Ikada Y. Cell behaviour on polymer surfaces grafted with non-ionic and ionic monomers, Biomaterials. — 1991 .

— Vol. 12. — 786–792 p .

283 Sugimoto Y. Effect on the adhesion and locomotion of mouse fibroblasts by their interacting with differently charged substrates. A quantitative study by ultrastructural method // Exp. Cell Res. — 1981. — Vol. 135, №1. — 39-45 p .

284 K. Smetana, J. Vacik, D. Souckova, Z. Krcova, J. Sulc, The influence of hydrogel functional groups on cell behavior // J. Biomed. Mater. Res. — 1990. — Vol. 24. — 463–470 p .

285 Lydon M.J., Clay C.S. Substratum topography and cell traction on sulphuric acid treated bacteriological-grade plastic // Cell Biol. Int. Rep. — 1985. — Vol. 9. — 911–921 p .

286 N.G. Maroudas. Adhesion and spreading of cells on charged surfaces // J .

Theor. Biol. — 1975. — Vol. 49. — 417–424 p .

287 Bratosin D., Mitrofan L., Palii C., Estaquier J., Montreuil J. Novel fluorescence assay using calcein-AM for the determination of human erythrocyte viability and aging // Cytom. Part A. — 2005. — Vol. 66. — 78– 84 p .

288 Лесовой Д. Е., Артюхов А. А., Чудных С. М., Штильман М. И .

Макропористые полимерные гидрогели поливинилового спирта как материал для местного лечения ран // Все материалы .

Энциклопедический справочник. — 2011. — №12. — 19-27 c .

289 Lamke L.O., Nilsson G.E., Reithner H.L. The evaporative water loss from burns and the water permeability of grafts and artificial membranes used in the treatment of burns // Burns. — 1977. — Vol. 3. — 159–165 p .

290 Wu P., Fisher A.C., Foo P.P., Queen D., Gaylor J.D. In vitro assessment of water vapour transmission of synthetic wound dressings // Biomaterials. — 1995. — Vol. 16. — 171–175 p .

291 Басинский С.Н. Способ адресной доставки лекарственных препаратов в лечении дистрофических состояний глаз // Клиническая офтальмология .

— 2004. — Т. 5, №1. — 5-7 c .

292 Del Amo E.M., Urtii A. Current and future ophthalmic drug delivery systems // Drug Discov. Today. — 2008. — Vol. 13, № 3-4. — 135-143 p .

293 Eljarrat-Binstock E., Raiskup F., Frucht-Pery J. et al. Transcorneal and transscleral iontophoresis of dexomethasone phosphate using drug loaded hydrogel // J. Control Release. — 2005. — Vol. 106, N3. — P. 386-390 294 Olsen T.W., Feng X., Wabner K. et al. Cannulation of the suprachoroidal space: a novel drug delivery methodology to the posterior segment//Am. J .

Ophthalmol. — 2006.—Vol. 142, № 5.— 777-787 p .

295 Mohammad D.A., Sweet B.V., Elner S.G. Retisert: Is the New Advance in Treatment of Uveitis a Good One? //The Annals of Pharmacotherapy. — 2007. — Vol. 41, №3. — 449-454 p .

296 Шишкин М.М., Штильман М.И., Юлдашева Н.М., Артюхов А.А. О возможности применения сшиваемого поливинилового спирта в качестве носителя лекарственных веществ для интравитреального введения. (Экспериментальное исследование) // Вестник национального медико-хирургического центра им. Н.И. Пирогова. — 2010. —Т. 5, № 1 .

— 16-21 c .

297 Шишкин М.М., Штильман М.И., Юлдашева Н.М., Артюхов А.А .

Cупрахороидальная имплантация биодеградирующего имплантата «ММ-гель» в качестве носителя лекарственных веществ (Экспериментальное исследование) // Вестник Национального медикохирургического Центра им. Н.И. Пирогова. — 2010, Т. 5, № 2. — 71-76 с .

298 Mittl R.N., Tiwari R. Suprachoroidal injection of sodium hyaluronate as an «internal» buckling procedure // Ophthalmic. Res. —1987. — Vol.19. — 255-260 p .

299 Poole T.A., Sudarsky R.D. Suprachoroidal implantation for the treatment of retinal detachment// Ophthalmology. — 1986. — Vol.93. — 1408-1412 p .

300 Nussenblatt R.B., Palestine A.G., Chan C.C. Cyclosporine therapy for uveitis:

long—term followup // J. Ocul. Pharmacol. 1985. — Vol. 1, № 4. — 369 – 382 p .

301 ШамшиноваА.М., Волков В.В. Функциональные методы исследования в офтальмологии. — М.: Медицина, 1999. — 416 с .

302 Сидорук А.А., Чудных С.М., Кулезнева Ю.В., Штильман М.И., Артюхов А.А., Королюк Г.М., Николин О.П. Новые малоинвазивные методы лечения острого холецистита //Хирург. — 2014. — № 10. — 55-68 с .

303 Хатьков И.Е., Чудных С.М., Кулезнева Ю.В., Штильман М.И., Сидорук А.А., Артюхов А.А. Новые малоинвазивные методы лечения больных острым холециститом // Эндоскопическая хирургия. — 2012. — №1. — 3-8 p 304 Чудных С.М., Кулезнева Ю.В., Сидорук А.А., Штильман М.И., Артюхов А.А. Облитерация полости желчного пузыря «ММ-гелем»

(клинико-экспериментальное исследование) // Хирург. — 2014, №8. — 66-75 с .

305 Hrouz J., Ilavsky M., Havlicek I., Dusek K. Comparison of the penetration, tensile and compression moduli of elasticity of poly(n-alkyl acrylate) networks in the rubberlike state // Collect. Czech. Chem. Commun. — 1978 .

— Vol. 43. № 8. —1999–2007 p .

306 Роговина Л. З., Васильев В. Г., Слонимский Г. Л. Регулярные сетки на,-дигидроксиолигодиметилсилоксана, основе полученные при различных условиях разбавления // Высокомолек. Соед. А. — 1982. — Т. 24, № 2.— 254–260 с .

307 Ландау Л. Д., Лифшиц Е. М. Теоретическая физика. Т. 7. Теория упругости.— М.: Наука, 1987. — 119–123 с .



Pages:     | 1 ||

Похожие работы:

«Федеральное государственное бюджетное Рабочая тетрадь образовательное учреждение высшего по нормальной физиологии образования "Волгоградский государственный медицинский университет" Министерства 1 Тема: Физиология высшей здравоохранения Российской Федерации нервной деятельности (занят...»

«Межгосударственная координационная водохозяйственная комиссия Центральной Азии (МКВК) Канадское агентство международного развития (CIDA) Университет МакГилл Центр Брейса по управлению водными ресурсами Международная комиссия по ирригации и дренажу Публикации Тренингового центра МКВК. Выпуск 4 Ташке...»

«ШОРИНА Марина  Владимировна АККУМУЛЯЦИЯ КАДАВЕРИНА И ЕГО ФИЗИОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ ПРИ ДЕЙСТВИИ СОЛЕВОГО СТРЕССА 03.00.12 - "физиология и биохимия растений" АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва - 2005 Работа  выполнена  в  лабор...»

«МОЧАЛОВА Ольга Инаровна ПРИРОДНО-АНТРОПОГЕННЫЕ ПРОЦЕССЫ И СОВРЕМЕННЫЕ ЛАНДШАФТЫ ЗОНЫ БРАТСКОГО ВОДОХРАНИЛИЩА 25.00.36 - геоэкология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата географических  наук Москва - 2005 Работа выполнена на кафедре физичес...»

«Исследовательский командный конкурс Геккон.ПЦ Новая школа. www.n-sh.org Предметное Название команды Тема доклада (буква) направление С Исследователи Биология Формулировка темы Вора – бей! В 1958 году в Китае по инициативе Мао Цзэдуна была организована кампания по борьбе с вредителями поле...»

«Н А У Ч Н Ы Е ВЕД О М О СТ И Серия Естественные науки. 2012. № 3 (122). Выпуск 18 5 БИОЛОГИЯ УДК 581.81 : 582.681.81 ОСОБЕННОСТИ АНАТОМИЧЕСКОГО СТРОЕНИЯ ДРЕВЕСИНЫ ТОПОЛЯ БЕЛОГО, ПРОИЗРАСТАЮЩЕГО В ЗАПАДНОЙ СИБИРИ Впервые приводится характеристика анатомического строения древ...»

«Муниципальное казенное учреждение дополнительного образования "Станция юных натуралистов" с.Дивное ЭКОЛОГИЧЕСКИЙ КАЛЕЙДОСКОП сборник методических материалов по проведению мероприятий в рамках Дней защиты от экологической опасно...»

«Всесибирская олимпиада по БИОЛОГИИ 2016-17. 3аключительный этап. 7-8 кл. Стр. 1 из 3 16. Животные с внутренним известковым скелетом НЕ Всесибирская олимпиада по встречаются среди би...»

«Содержание 1 Перечень компетенций с указанием этапов их формирования в процессе освоения ОПОП..3 2 Описание показателей и критериев оценивания компетенций на различных этапах их формирования, о...»

«ТРЕБОВАНИЯ К УРОВНЮ ОСВОЕНИЯ ПРОГРАММЫ ПО КУРСУ "ОСНОВЫ БЕЗОПАСНОСТИ ЖИЗНЕДЕЯТЕЛЬНОСТИ" В результате освоения Программы обучающиеся должны иметь сформированность: — представлений о культуре безопасности...»

«РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ТЕХНОЛОГИИ ПРОИЗВОДСТВА СЕРТИФИЦИРОВАННОГО ПОСАДОЧНОГО МАТЕРИАЛА ВИНОГРАДА В.С.Петров, Л.М.Малтабар, А.И.Талаш, Л.П.Трошин, К.А.Серпуховитина Принципиальная схема, сост...»

«Приложение к свидетельству № 66939 Лист № 1 об утверждении типа средств измерений Всего листов 5 ОПИСАНИЕ ТИПА СРЕДСТВА ИЗМЕРЕНИЙ Спектрометр атомно-абсорбционный AI1200 Назначение средства измерений Спектрометр атомно-абсорбц...»

«УДК 630*165.51:632.937.(045) ВЫЯВИТЬ ЭКОЛОГО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ НАКОПЛЕНИЯ ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ В ДРЕВЕСНЫХ ВИДАХ Абжанов Талгат Сагидоллаевич PhD, старший преподаватель кафедры "Лесных ресурсов и лесного хозяйства" АО Казахс...»

«1. Пояснительная записка Место учебного предмета в учебном плане 1.1. Рабочая программа составлена на основе Федерального компонента Государственного стандарта основного общего образования, Примерной программы основного общего образов...»

«Экология животных Юг России: экология, развитие. №4, 2010 Ecology of animals The South of Russia: ecology, development. №4, 2010 ЭКОЛОГИЯ ЖИВОТНЫХ УДК 597.583.1-152.6 (262.81) ЭТОЛОГИЯ МОРСКИХ РЫБ КАСПИЙСКОГО МОРЯ © 2010 Абдурахманов Г.М.,Сокольская Е.А. Дагестанский государственный университет Астра...»

«1 1. ПОЯСНИТЕЛЬНАЯ ЗАПИСКА Программа составлена в соответствии с требованиям Федерального государственного образовательного стандарта основного общего образования. Предлагаемая программа соответствует положениям Федерального государственного образовательного станд...»

«МИНИСТЕРСТВО ОХРАНЫ ЗДОРОВЬЯ УКРАИНЫ ЗАПОРОЖСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ Кафедра медицинской биологии, паразитологи и генетики ПОПУЛЯЦИОННО-ВИДОВОЙ, БИОГЕОЦЕНОТИЧЕСКИЙ И БИОСФЕРНЫЙ УРОВНИ ОРГАНИЗАЦИИ ЖИЗНИ УЧЕБНО-МЕТОДИЧ...»

«Район/ Муниципий MINISTERUL EDUCAIEI, Место жительства CULTURII I CERCETRII Учебное заведение AL REPUBLICII MOLDOVA AGENIA NAIONAL Фамилия, имя ученика PENTRU CURRICULUM I EVALUARE БИОЛОГИЯ ПРЕДВАРИТЕЛЬНОЕ ТЕСТИРОВАНИЕ ЛИЦЕЙСКИЙ ЦИКЛ Профиль: реальный, спортивный 27 апреля 2018 года Время выполнения: 180 минут Необ...»

«П. М. ЗАЛКАН КЛИНИЧЕСКАЯ МИКРОСКОПИЯ В ПОВСЕДНЕВНОЙ ПРАКТИКЕ ВРАЧА—ВЕНЕРОЛОГА Изд-во Пермск. Биолог. Научн.-Иссл. Ин-та П. М З А К А Н. Л Ассистент Пермского Медицинского Института КЛИНИЧЕСКАЯ МИКРОСКОПИЯ В ПОВСЕДНЕВНОЙ ПРАКТИКЕ ВРАЧА—ВЕНЕРОЛОГА Из-во Пермск. Биолог...»

«Самсонова Наталья Николаевна Клонирование  и  функциональная  характеристика  гена ygjG  из Escherichia  oli  12. cK 03.00.03  - Молекулярная  биология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва, 2004 г. Работа  выполнена  в  лаборатории  №2  Научно-исследовательского  инс...»

«1/2009 сентябрь-октябрь ГЕНЕТИКА ГУППИ тема номера ГЕНЕТИКА ОКРАСА ГУППИ бесплатное приложение к сайту www. genetika guppy . my1. ru Над номером работали: к.б.н. С.А. Апрятин, В.В. Сторожев Фотографии: В.В. Сторожев Контакты: genetik...»

«АННОТАЦИИ ДИСЦИПЛИН ООП ПОДГОТОВКИ БАКАЛАВРОВ ПО НАПРАВЛЕНИЮ 18.03.01 "ХИМИЧЕСКАЯ ТЕХНОЛОГИЯ", ПРОФИЛЬ "ХИМИЯ ПОЛИМЕРОВ МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКОГО НАЗНАЧЕНИЯ" ФОРМА ОБУЧЕНИЯ – ОЧНАЯ СРОК ОСВОЕНИЯ ООП – 4 ГОДА Наименовани...»






 
2018 www.lit.i-docx.ru - «Бесплатная электронная библиотека - различные публикации»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.