WWW.LIT.I-DOCX.RU
Ѕ≈—ѕЋј“Ќјя  »Ќ“≈–Ќ≈“  Ѕ»ЅЋ»ќ“≈ ј - различные публикации
 


Ђ–ќ——»…— ќ… ‘≈ƒ≈–ј÷»» ‘≈ƒ≈–јЋ№Ќќ≈ √ќ—”ƒј–—“¬≈ЌЌќ≈ ј¬“ќЌќћЌќ≈ ќЅ–ј«ќ¬ј“≈Ћ№Ќќ≈ ”„–≈∆ƒ≈Ќ»≈ ¬џ—Ў≈√ќ ѕ–ќ‘≈——»ќЌјЋ№Ќќ√ќ ќЅ–ј«ќ¬јЌ»я  ј«јЌ— »… (ѕ–»¬ќЋ∆— »…) ‘≈ƒ≈–јЋ№Ќџ… ”Ќ»¬≈–—»“≈“ »Ќ—“»“”“ ...ї

ћ»Ќ»—“≈–—“¬ќ ќЅ–ј«ќ¬јЌ»я » Ќј” »

–ќ——»…— ќ… ‘≈ƒ≈–ј÷»»

‘≈ƒ≈–јЋ№Ќќ≈ √ќ—”ƒј–—“¬≈ЌЌќ≈ ј¬“ќЌќћЌќ≈

ќЅ–ј«ќ¬ј“≈Ћ№Ќќ≈ ”„–≈∆ƒ≈Ќ»≈ ¬џ—Ў≈√ќ

ѕ–ќ‘≈——»ќЌјЋ№Ќќ√ќ ќЅ–ј«ќ¬јЌ»я

 ј«јЌ— »… (ѕ–»¬ќЋ∆— »…) ‘≈ƒ≈–јЋ№Ќџ… ”Ќ»¬≈–—»“≈“

»Ќ—“»“”“ ‘”Ќƒјћ≈Ќ“јЋ№Ќќ… ћ≈ƒ»÷»Ќџ » Ѕ»ќЋќ√»»

 ј‘≈ƒ–ј ‘»«»ќЋќ√»» „≈Ћќ¬≈ ј » ∆»¬ќ“Ќџ’

Ќаправление: академический бакалавриат 06.03.01 (ќ —ќ 020400.62) Ц биологи€

¬џѕ”— Ќјя  ¬јЋ»‘» ј÷»ќЌЌјя –јЅќ“ј

"÷»“ќЋќ√»„≈— јя ќ÷≈Ќ ј ћќ–‘ќЋќ√»» —ѕ≈–ћј“ќ«ќ»ƒќ¬

„≈Ћќ¬≈ ј ѕ–» –ј«Ћ»„Ќџ’ ћ≈“ќƒј’ ќ –јЎ»¬јЌ»я"

–абота завершена:

У___Ф __________ 2015г. –.“.јбдурахманова _______________

–абота допущена к защите:

Ќаучный руководитель:

д.б.н., профессор У___Ф__________ 2015г. “.¬. Ѕалтина ________________

«аведующий кафедрой, д.б.н., профессор У___Ф__________ 2015г. ________________ √.‘. —итдикова  азань Ц 2015

ќ√Ћј¬Ћ≈Ќ»≈

¬¬≈ƒ≈Ќ»≈

1 ќЅ«ќ– Ћ»“≈–ј“”–џ

1.1 —троение мужской половой системы

1.1.1 –азвитие половых желез

1.1.2 яичко

1.1.3 ƒобавочные половые железы

1.2 —перматогенез

1.3 √ормональна€ регул€ци€ мужской репродуктивной системы................ 20

1.4 »сследование э€кул€та

1.4.1 ћорфологи€ сперматозоидов

Ё —ѕ≈–»ћ≈Ќ“јЋ№Ќјя „ј—“№

2.1 ќбъект исследовани€

2.1.1 ћикроскопическое исследование семенной жидкости

2.1.2 ќпределение подвижности сперматозоидов человека

2.1.3 ќценка морфологии сперматозоидов человека

2.2 ћетоды окрашивани€

2.2.1 ќкраска по ѕаниколау

2.2.2. ќкраска гематоксилином

2.2.3 Ќабор дл€ окрашивани€ "Spermac Stain"

2.3 ѕроцедура исследовани€

3 –≈«”Ћ№“ј“џ » ќЅ—”∆ƒ≈Ќ»≈

3.1 ќкраска семенной жидкости по ѕапаниколау

3.2 ќкрашивание сперматозоидов диагностическим набором "Spermac Stain"

3.2.1 ¬ли€ние центрифугировани€ на процент нормальных сперматозоидов

3.3 ќкраска семенной жидкости гематоксилином

3.4 ѕодсчет числа нормальных и аномальных сперматозоидов с помощью лабораторного счетчика в препаратах э€кул€та, окрашенных разными цитологическими красител€ми

¬џ¬ќƒџ

—ѕ»—ќ  »—ѕќЋ№«ќ¬јЌЌџ’ »—“ќ„Ќ» ќ¬

¬¬≈ƒ≈Ќ»≈

¬ насто€щее врем€ проблема бесплоди€ населени€ становитс€ все более актуальной дл€ многих развитых стран и –оссии, поэтому отмечаетс€ возрастающий интерес к развитию вспомогательных репродуктивных технологий (¬–“) [ улаков c cоавт., 2007]. —огласно определению ¬семирной организации здравоохранени€ (¬ќ«) бесплодие это неспособность сексуально активной, не использующей контрацепцию пары добитьс€ беременности в течение одного года. ќтветственность за неудачу в наступлении беременности традиционно падает на женщину. ƒо XVII века во многих европейских странах мужчине давалось право помен€ть трех жен, под предлогом их бесплоди€, и только в четвертом браке бесплодным могли признать именно его. Ёто подтверждает тот факт, что гинекологи€ имеет тыс€челетнюю историю, а андрологи€ как наука возникла лишь в конце прошлого века. ћужчина-партнер может быть проверен на бесплодие или субфертильность (пониженную плодовитость) с помощью целого р€да клинических методов, а также с использованием лабораторного исследовани€ спермы [–уководство ¬ќ«, 2001] .





—емейные пары, у которых есть желание иметь детей, но нет возможности, были всегда. ќднако в начале XXI века проблема бесплоди€ приобретает особо острый характер. ѕо данным ¬ќ«, эта проблема затрагивает до 15% от общего числа супружеских пар репродуктивного возраста в мире (¬ќ«, 2010). Ќапример, в —Ўј 14,2% семей (в ≈вропе около 10%) испытывают трудности с зачатием. ¬ то же врем€ распространенность бесплоди€ в некоторых област€х –оссии превышает критический порог 15%, определенный ¬ќ« .

ќдним из способов решени€ данной проблемы €вл€ютс€ вспомогательные репродуктивные технологии (¬–“). ќни включают в себ€ процедуры и методы лечени€ бесплоди€, а также манипул€ции in vitro с человеческими ооцитами, спермой и эмбрионами с целью наступлени€ беременности. Ёти технологии включают в себ€, в частности, оплодотворение in vitro и перенос эмбрионов, перенос гамет в фаллопиевы трубы, перенос зигот в фаллопиевы трубы, перенос эмбрионов в фаллопиевы трубы, криоконсервацию гамет и эмбрионов, донорство ооцитов и эмбрионов и суррогатное материнство [Zegers-Hochschild et al., 2009]. Ёффективность лечени€ бесплоди€ при помощи современных репродуктивных технологий достигла в лучших центрах мира 30Ч40% в расчете на одну попытку, что превосходит Ђэффективностьї естественного зачати€ [–адзинский, 2006] .

¬ насто€щий момент методы ¬–“ условно подраздел€ют на:

1)  лассическое экстракорпоральное оплодотворение (Ё ќ) и перенос эмбриона (ѕЁ);

2) »скусственна€ инсеминаци€ спермой мужа (»»—ћ) или спермой донора (»»—ƒ);

3) » —» (от английского ICSI - Intra Cytoplasmic Sperm Injection) внутрицитоплазматическа€ инъекци€ сперматозоида;

4) ƒонорство €йцеклетки и эмбриона;

5) —уррогатное материнство (вынашивание эмбриона женщиной дл€ последующей передачи ребенка генетическим родител€м);

6)  риоконсерваци€ ооцитов и эмбрионов;

7) ѕредимплантационна€ диагностика наследственных болезней;

8) ’этчинг (рассечение блест€щей оболочки эмбриона перед имплантацией в матку);

9) –едукци€ эмбрионов при многоплодной беременности .

ѕри оплодотворении €йцеклетки важнейшее значение имеет не только количество и подвижность сперматозоидов, но и их морфологи€, то есть внешний вид. “олько сперматозоиды с нормальной формой двигаютс€ пр€молинейно с необходимой скоростью и способны к оплодотворению €йцеклетки .

Ќаилучшим показателем фертильности мужчины служит выполненное по строгим критери€м исследование морфологии сперматозоидов в э€кул€те .

ƒл€ достижени€ беременности инфертильной пары внедрение » —» стало прорывом в лечении т€желого фактора мужского бесплоди€, за счет того, что позволило достигать стабильной частоты оплодотворени€ при значительном нарушении оплодотвор€ющей способности спермы. „астота беременностей при процедуре » —» может быть нормальной даже в случае т€желой тератозооспермии. Ёто свидетельствует о том, что морфологи€ сперматозоидов человека св€зана с репродуктивной функцией, играющую важную роль, при взаимодействии гамет и €вл€етс€ одним из методов прогноза оплодотвор€ющей способности мужчины. ќднако есть много методов окрашивани€ и в практике ¬–“ не существует нормативных актов, регламентирующих применение конкретного гистологического красител€ дл€ оценки морфологии сперматозоидов, поэтому проблема выбора крас€щего реактива сотрудником конкретных лабораторий всегда €вл€етс€ актуальной .

Ќа основании вышесказанного целью нашей работы было определить оптимальный метод окрашивани€ сперматозоидов человека дл€ более точной оценки их морфологии .

ƒл€ достижени€ цели были поставлены следующие задачи:

1.  ак вли€ет процесс центрифугировани€ на процент нормальных сперматозоидов .

2. ќпределить процент нормальных сперматозоидов в препаратах, с различными методами окрашивани€ .

3. —равнить результаты подсчета, при разных способах окраски мазков э€кул€та и найти лучший метод .

1 ќЅ«ќ– Ћ»“≈–ј“”–џ

1.1 —троение мужской половой системы ћужска€ репродуктивна€ система состоит из €ичка, системы канальцев, включающих придаток €ичка и сем€вынос€щий проток, добавочных желез, к которым относ€тс€ семенные пузырьки и предстательна€ железа, и наконец, уретры и полового члена. Ёти органы вместе обеспечивают выработку сперматозоидов и доставку их в женские половые пути .

1.1.1 –азвитие половых желез ѕоловые органы тесно св€заны с мочевывод€щими и формируютс€ из первичной почки зародыша - mesonephros. Ќа 3-й неделе эмбриогенеза в стенке желточного мешка возникают первичные половые клетки - гоноциты предшественники оогониев и сперматогониев. Ќа 5-й неделе эмбрионального развити€ гоноциты мигрируют через мезенхиму в гонадные валики, которые располагаютс€ на средней части мезонефрального гребн€ и представл€ют собой зачатки будущих гонад - €ичников или €ичек. ¬ течение последующих двух недель гоноциты многократно дел€тс€ путем митоза, формиру€ пул будущих зародышевых клеток попул€цию предшественников гамет .

Ќарушение их развити€ и заселени€ ими гонадных валиков может привести к дефектам развити€ гонад. ¬ процессе дифференцировки гоноциты оказываютс€ погруженными в первичный герминативный эпителий, формиру€ половые т€жи. Ќа этом этапе гонады уже гистологически различимы и представл€ют собой бипотентный орган, способный стать €ичком или €ичником .

ѕри развитии гонад по мужскому типу гоноциты локализуютс€ во внутреннем мозговом слое половой железы. ќни внедр€ютс€ в семенные т€жи, образованные клетками целомического эпители€. Ќачина€, с 8-й недели эмбрионального развити€ первичные половые т€жи активно разрастаютс€ и превращаютс€ в семенные канальцы, в просвете которых наход€тс€ незрелые половые клетки - сперматогонии. »з клеток половых т€жей развиваютс€ клетки, выполн€ющие опорную и трофическую функции,

- клетки —ертоли.  летки —ертоли, известные как сустентоциты, окружают мужские гаметы. ” млекопитающих с самых ранних этапов пренатального развити€ до начала мейоза, завершающегос€ образованием сперматозоидов, взаимодействие между половыми клетками и клетками —ертоли весьма важно и необходимо. ќсновной функцией поддерживающих клеток €вл€етс€ питание сперматозоидов на разных стади€х развити€; кроме этого они формируют и поддерживают ниши дл€ стволовых клеток сперматогенеза .

[Austin, 1972, de Kretzer, et al. 1982, Robaire B, 1998, Glover, 1999] .

»з мезенхимы, по€вл€ющейс€ под зародышевым эпителием, развиваютс€ клетки Ћейдига, также известные как интерстициальные клетки Ћейдига. ¬ присутствии лютеинизирующего гормона они вырабатывают тестостерон.  летки Ћейдига имеют полигональную форму, крупное €дро, эозинофильную цитоплазму и множество везикул, наполненных липидами .

ќсновной функцией клеток Ћейдига €вл€етс€ синтез и высвобождение андрогенов под воздействием лютеинизирующего гормона. [Austin, 1972, de ƒальнейша€ Kretzer, et al. 1982, Robaire 1998, Glover, 1999] .

дифференцировка органов половой системы целиком зависит только от продуктов секреции €ичка. “естостерон, синтезируемый тестикул€рными клетками, которые в дальнейшем станов€тс€ клетками Ћейдига, стимулирует развитие придатков €ичка, сем€вынос€щих протоков и семенных пузырьков .

ќбразование тестостерона эмбриональными €ичками уже с 7-8-й недели внутриутробного развити€ контролируетс€ плацентарным гормоном хорионическим гонадотропином. ќсь гипоталамус-гипофиз-гонады начинает функционировать у мальчиков с 10-й по 24-ю недели эмбрионального развити€, после чего выключаетс€ более чем на 10 лет. — наступлением полового созревани€ она вновь активируетс€ и обеспечивает нормальное функционирование половой системы .

1.1.2 яичко яичко (лат. testis) Ц представл€ет собой парную половую железу, располагающуюс€ в нижней части мошонки. яички имеют несколько уплощенно-овальную форму и достигают веса 20Ч30 г. яичко крепитс€ посредством семенного канатика, образованного мышцами, фасци€ми, нервами, кровеносными и лимфатическими сосудами, а также сем€вынос€щими протоками. яичко выполн€ет две основные функции Ч репродуктивную и эндокринную. –епродуктивна€ функци€ заключаетс€ в продукции мужских гамет. Ёндокринна€ функци€ - в выделении в кров€ное русло половых гормонов, которые вли€ют на развитие первичных и вторичных половых признаков. яичко образовано паренхимой, заключенной в плотную соединительнотканную белочную оболочку. ќт белочной оболочки в толщу железы радиально отход€т перегородки, раздел€ющие €ичко на 250-300 долек. ƒолька придатка €вл€етс€ структурной единицей €ичек .

¬ каждой дольке располагаютс€ по 1-3 извитых семенных канальца длиной 50-80 см. ќбща€ длина всех канальцев одного €ичка достигает 300м. ¬ семенных канальцах происходит сперматогенез Ч образование из стволовых клеток (сперматогоний) сперматозоидов. —перматозоиды, сформировавшиес€ в семенных канальцах, попадают через вынос€щие (эфферентные) протоки в придаток €ичка (эпидидимис). ѕридаток €ичка, €вл€€сь хранилищем сперматозоидов в течение 12-14 дней, выполн€ет важную функцию в их дальнейшем созревании. “олько после прохождени€ через придаток €ичка сперматозоиды приобретают окончательную оплодотвор€ющую способность. ѕроток придатка €ичка переходит сем€вынос€щий проток, который входит в состав семенного канатика .

 онечный отдел сем€вынос€щего протока, расшир€€сь, образует ампулу, сливаетс€ с выводными протоками семенных пузырьков и формирует сем€выбрасывающий проток, который проходит через предстательную железу и открывает узким щелевидным отверстием на семенном бугорке задней части мочеиспускательного канала. «релые сперматозоиды движутс€ по направлению к сем€вынос€щему протоку и затем выбрасываютс€ в составе семенной жидкости через отверстие уретры благодар€ мышечным сокращени€м .

1.1.3 ƒобавочные половые железы   ƒобавочным половым железам мужской половой системы относ€т семенные пузырьки, предстательную железу и бульбоуретральные железы .

¬клад секрета семенных пузырьков и предстательной железы в общий объем семенной жидкости составл€ет 95% (около 35% приходитс€ на секрет предстательной железы, 60% - на секрет семенных пузырьков), и только 5% приходитс€ на секрет гонад. ѕоэтому колебани€ объема э€кул€та в первую очередь завис€т от секрета добавочных половых желез .

—еменные пузырьки —еменные пузырьки €вл€ютс€ парным железистым органом, расположенным над предстательной железой. —еменные пузырьки выдел€ют секрет, необходимый дл€ питани€ и движени€ сперматозоидов. —еменные пузырьки €вл€ютс€ андрогензависимыми секреторными органами. —екрет семенных пузырьков в€зкий, желатинообразной крнсистенции, беловатосерого цвета, без запаха, имеет рH 7,3, содержит азотистые вещества, простогландины, белки в частности, семиногелин, соли аскорбиновой кислоты и лимонной кислот, фруктозу и другие вещества. —екрет семенных пузырьков составл€ет основной объем э€кул€та. Ќаиболее важной функцией семенных пузырьков €вл€етс€ секреци€ фруктозы, уровень которой Ч косвенный показатель андрогенной насыщенности организма.  роме того, фруктоза обеспечивает энергетический потенциал сперматозоидов, повышает их выживаемость и функциональную активность. Ќормальна€ концентраци€ фруктозы в спермоплазме составл€ет 6.7-33,3 мкмоль\мл. —нижение уровн€ фруктозы в спермоплазме сопровождаетс€ нарушением жизнеспособности сперматозоидов .

Ѕульбоуретральные железы Ѕульбоуретральные ( уперовы) железы Ч парные округлые мелкие железы внешней секреции в репродуктивной системе мужчин, расположенные между пучками мышц мочеполовой диафрагмы. ∆елезы вырабатывают в€зкий секрет, представл€ющий собой бесцветную, прозрачную слизь щелочной реакции, выдел€емый в период полового возбуждени€. —екрет нейтрализует кислую реакцию мочевых путей перед э€кул€цией. “акже выдел€ющий секрет защищает слизистую оболочку стенки мужского мочеиспускательного канала от раздражени€ ее мочой .

ѕредстательна€ железа ѕредстательна€ железа Ч непарный железисто-мышечный орган, охватывающий мочеиспускательный канал ниже мочевого пузыр€ .

ѕредстательна€ железа состоит из 30-50 трубчато-альвеол€рных желез с большим количеством гладкомышечных волокон между ними. ¬ыводные протоки предстательной железы открываютс€ в задней части уретры. — наступлением полового созревани€ предстательна€ железа активно растет, преимущественно за счет желез, которые к старости редуцируютс€. ќсновна€ функци€ предстательной железы Ч выработка секрета, необходимого дл€ поддержани€ активности и жизнеде€тельности сперматозоидов .

ѕредстательна€ железа вырабатывает в сутки до 2 мл секрета, составл€ющего 25%-35% объема семенной плазмы. –егул€ци€ функции предстательной железы осуществл€етс€ андрогенами, поэтому при снижении их уровн€ секреторна€ активность предстательной железы значительно падает. —екрет предстательной железы, полученный после ее массажа, представл€ет собой беловатую, опалесцирующую, в€зкую жидкость со специфическим запахом и рH 6,3-6,4. —пецифический запах секрета обуславливает спермин, а беловатый опалесцирующий цвет ему придают мицеллы фосфолипидов (липоидные тельца). ѕри охлаждении в э€кул€те по€вл€ютс€ кристаллы фосфата спермина. —пермин и спермидин, €вл€€сь основани€ми, поддерживают на посто€нном уровне концентрацию водородных ионов. —екрет предстательной железы содержит простагландины, ферменты - гиалуронидазу, фибринолизин и фиброкиназу, которые способствуют разжижению э€кул€та. ќн оказывает антимикробное, буферное и ферментативное действие на э€кул€т в целом, активиру€ движение сперматозоидов .

ѕростато-специфическа€ кисла€ фосфатаза (ѕ— ‘) Ч изофермент кислой фосфатазы, представл€ющий собой гликопротеин с молекул€рной массой 97 кƒа. ѕредполагают, что кисла€ фосфатаза участвует в гидролизе фосфолипидов, увеличива€ содержание фосфата и холина в э€кул€те, последний оказывает сенсибилизирующий эффект на сперматозоиды .

—ущественное вли€ние на подвижность сперматозоидов и оплодотвор€ющие свойства э€кул€та оказывают такие микроэлементы, как железо, магний, марганец и цинк. »х секреци€ осуществл€етс€ в основном предстательной железой. ќсобое внимание в насто€щее врем€ придают исследованию содержани€ катионов цинка, биологическа€ роль которого многообразна. ÷инк важный внутриклеточный микроэлемент, принимающий активное участие в физиологии мужской репродуктивной системе. ¬ насто€щее врем€ известно, что цинк оказывает модулирующее воздействие на систему регул€ции гипоталамус-гипофиз-гонады у мужчин .

÷ентральное действие цинка заключаетс€ в угнетении синтеза пролактина, относительном повышении уровн€ гонадотропных гормонов Ч ‘—√ и Ћ√ .

÷инк принимает участие в сперматогенезе. ќн входит в состав более 70 внутри€дерных ферментов, катализирующих ключевые этапы синтеза ƒЌ  и –Ќ , поэтому цинк улучшает процессы делени€ и дифференцировки сперматозоидов. ÷итрат цинка €вл€етс€ важным компонентом секрета предстательной железы, улучшающим подвижность сперматозоидов в э€кул€те.  роме того, цинк €вл€етс€ мощным фактором антиоксидантной защиты и обладает способностью стабилизировать мембраны клеток. ¬ норме концентраци€ ионов цинка в э€кул€те около 2,08 ммоль\л .

1.2 —перматогенез —перматогенез - сложный динамический процесс, в результате которого из первичных половых клеток образуютс€ сперматозоиды .

—перматогенез млекопитающих представл€ет собой серию высокоспециализированных строго регулируемых процессов, включающих митоз, мейоз и дифференцировку клеток-предшественников сперматозоидов .

Ќормальный процесс сперматогенеза предетерминирован уже на стадии сперматогониев, а затем процесс идет с часовой точностью и последовательностью. [Turkington —перматогенез and Majumder,1975] .

начинаетс€ в период половой зрелости и продолжаетс€ в течение всей жизни .

—перматогенез находитс€ под строгим генетическим и гормональным контролем .

” млекопитающих есть существенные отличи€ между развитием ооцитов и сперматозоидов. ” женщин оогонии пролиферируют только во врем€ внутриутробного развити€, тогда же происходит переход в фазу мейоза. »х развитие останавливаетс€ на стадии ооцита в профазе I делени€ мейоза, в данной стадии они могут пребывать до 50 лет. ќтдельные ооциты из этого ограниченного пула созревают и овулируют через определенные промежутки времени. ќбычно за раз овулирует один ооцит.  ак правило, начало овул€ции совпадает с началом полового созревани€. ” мужчин мейоз и сперматогенез не начинаютс€ до начала полового созревани€ .

¬последствии сперматогенез происходит непрерывно в эпителиальной выстилке очень длинных, компактно свернутых трубочек, называемых семенными канальцами. [Austin, 1972, de Kretzer, et al. 1982]. —перматогенез проходит в извитых семенных канальцах €ичек - мужских половых железах .

 омплекс клеточных трансформаций, привод€щих к дифференцировке половых зародышевых клеток в сперматозоиды, осуществл€етс€ в семиноформенном эпителии, выстилающем семенные канальцы. ¬ составе семиноформенного эпители€ можно различить две клеточные попул€ции Ч половые зародышевые клетки на различных стади€х дифференннровки и соматические Ђподдерживающиеї клетки - клетки —ертоли .

 летки —ертоли формируют стенки семиноформенных канальцев €ичка: базальна€ часть клеток —ертоли примыкает к базальной мембране, окружающей семенной каналец; апикальна€ часть клеток —ертоли образует просвет канальца и носит название адлюминальной [Fawcett, 1975, Kretser and Kerr, 1988]. —пециализированные тесные контакты между клетками —ертоли отдел€ют интерстициальное пространство между канальцами, в котором циркулирует тканева€ жидкость, от просвета канальцев, формиру€ так называемый гемато-тестикул€рный барьер. ѕри наступлении половой зрелости гоноциты трансформируютс€ в сперматогонин. —перматогонии лежат между клетками —ертоли вдоль базальной мембраны и по мере дифференцировки в зрелые сперматозоиды продвигаютс€ в адлюминальном направлении. ѕри исследовании ультраструктуры семенных канальцев было обнаружено, что незрелые половые клетки и сперматозоиды на разных стади€х созревани€ расположены в ограниченных плазматической мембраной впадинах на боковых поверхност€х клеток —ертоли [Fawcett, 1975] .

—перматогенез состоит из трех последовательных фаз: пролиферации сперматогоний, мейоза и спермиогенеза. ¬ процессе сперматогенеза сперматогенные клетки по мере созревани€ перемещаютс€ от базальной мембраны к просвету извитого канальца .

Ќа базальной мембране извитых семенных канальцев наход€тс€ сперматогонии. ќбщее их количество в €ичке человека составл€ет около 1 млрд. ћорфологически выдел€ют несколько типов сперматогониев [Clermont, 1972, Rowley et al., 1971] - сперматогонии типа ј и сперматогонин типа ¬. ¬ свою очередь сперматогонии типа ј различаютс€ по степени конденсации хроматина в €дре на темные (конденсированный хроматин) и светлые клетки (диффузный хроматин), содержащие €дрышки вблизи €дерной мембраны. “емные сперматогонии типа ј в обычных услови€х не про€вл€ют пролиферативной активности. Ёто резервные стволовые клетки, которые переход€т в состо€ние митоза, когда количество сперматогонии значительно снижаетс€, в частности после радиационного облучени€ .

¬осстановление сперматогенной функции и нормального сперматогенеза может происходить только за счет сперматогоний типа ј, так как все остальные клетки сперматогенного эпители€ необратимо дифференцированы. ѕо мере апикального продвижени€ от базальной мембраны в сторону протока семенных канальцев сперматогонии типа ј дел€тс€ митотически, дифференциру€сь в сперматогонии типа ¬, клетки со светлым €дром и хорошо выраженным периферическим гетерохроматином .

¬ цитоплазме сперматогониев типа ¬ характерно наличие кристаллов Ћюбарха [Nagano, 1969] .

Ќекоторые темные сперматогонии типа ј превращаютс€ в светлые сперматогонии типа ј, которые непрерывно дел€тс€ путем митоза. —ветлые сперматогонии типа ј €вл€ютс€ обновл€ющимис€ стволовыми клетками, которые дают равное количество дочерних клеток типов ј и ¬. ¬ результате делени€ светлой клетки типа ј образуютс€ либо две сперматогонии типа ¬, либо одна сперматогони€ типа ¬ и одна светла€ сперматогони€ типа ј. ƒл€ превращени€ светлой сперматогонии в сперматогонию типа ¬ требуетс€ четыре последовательных митотических делени€, при которых генетически клетки не мен€ютс€, но происходит их морфофункциональна€ перестройка .

—перматогонии типа ¬ не всегда располагаютс€ на базальной мембране. ќни отличаютс€ от сперматогоний типа ј светлым округлым €дром с хорошо конденсированным хроматином .

—перматогонии типа ¬ проход€т несколько митотических делений, дифференциру€сь в сперматоциты I пор€дка или первичные сперматоциты. Ёти клетки соединены между собой цитоплазматическими мостиками, в результате чего образуетс€ синцитий, клетки которого составл€ют клон. ¬ процессе развити€ сперматоциты I пор€дка сначала удваивают свое количество хромосом, а затем проход€т первое мейотическое деление, в результате которого образуетс€ два сперматоцита II пор€дка (вторичные сперматоциты). ѕосле второго мейоза сперматоциты дифференцируютс€ в четыре сперматиды, имеющие гаплоидный набор хромосом (22 аутосомы и 1 полова€ хромосома). ѕроцесс первого мейотического делени€ у человека занимает несколько недель, тогда как второе завершаетс€ в течение 8 часов. —уммарно из одной стволовой сперматогонии образуютс€ 64 сперматиды. √енетически сперматиды представл€ют конечный продукт мейоза, но, прекраща€ деление, они подвергаютс€ глубоким преобразовани€м, превраща€сь в сперматозоиды .

’арактерной и уникальной особенностью сперматогенеза €вл€етс€ то, что в процессе митотических и мейотических делений не происходит полного разделени€ (цитокинеза) цитоплазмы образующихс€ дочерних клеток. ¬се дифференцирующиес€ сперматозоиды, происход€щие из одной стволовой клетки сперматогенеза, остаютс€ св€занными клеточными мостиками вплоть до выхода в просвет семенного канальца и образуют синцитий. “аким образом, развитие гаплоидных сперматозоидов регулируетс€ полиплоидным геномом, что позвол€ет дифференцироватьс€ и сперматозоидам с неполным геномом (например, клетки, содержащие только X или только Y хромосому). —уществует и друга€ точка зрени€, согласно которой белки, регулирующие течение поздних стадий сперматогенеза (спермногенеза), накапливаютс€ в период существовани€ в клетке диплоидного генома и продолжают работать в то врем€, когда геном становитс€ гаплоидным [Willison and Ashworth, 1987] .

“ретий период сперматогенеза - спермиогенез - сложный процесс превращени€ сперматид в сперматозоиды .

¬ результате мейотического делени€ получаютс€ округлые гаплоидные клетки сперматиды. ќни подвергаютс€ морфологическим и биохимическим преобразовани€м в процессе спермиогенеза, в результате которого округлые сперматиды трансформируютс€ в удлиненные высокоспециализированные клетки сперматозоиды. —пермиогенез человека описан в р€де обзоров [Burgos et al., 1970, Holstein, 1976] .

ѕроцесс спермиогенеза можно условно разделить на несколько стадий:

1) ‘аза интенсивного развити€ аппарата √ольджи в цитоплазме сперматиды .

—перматида имеет округлую форму, €дро сферическое с диффузным хроматином. Ќа этой стадии начинают формироватьс€ проакросомные гранулы, содержащие литические ферменты и €вл€ющиес€ производными комплекса √ольджи [Bowen, 1924]. ћитохондрии вначале дисперсно расположены в цитоплазме, затем занимают положение непосредственно под плазматической мембраной [Yasazumi, 1956]; парные центриоли мигрируют к полюсу €дра, противоположному полюсу, зан€тому акросомным пузырьком .

2) ‘аза Ђшапочкиї, во врем€ которой на переднем конце €дер сперматозоидов вы€вл€етс€ акросома - небольшое полушарие у переднего конца €дра. ѕри формировании акросомы несколько проакросомных гранул сливаютс€ в одну большую гранулу, котора€ контактирует с €дерной оболочкой. ¬ этот период гликопротеины перенос€тс€ из комплекса √ольджи в акросому с помощью мембранных пузырьков [Clermont and Tang, 1985] .

3) ‘аза формировани€ удлиненной сперматиды Ч €дро сперматозоида удлин€етс€, начинаетс€ конденсаци€ хроматина. ¬ клетке хорошо вы€вл€етс€ ось симметрии, проход€ща€ через передний и задний полюсы €дра. јкросома, расположенна€ на переднем полюсе €дра, но мере удлинени€ €дра приходит в тесный контакт с плазматической мембраной .

јппарат √ольджи отдел€етс€ от акросомы. ѕара центриолей, расположенных на периферии цитоплазмы сперматиды, передвигаетс€ к хвостовому полюсу €дра. ќдна из них, выт€нута€ вдоль длинной оси будущего жгутика (дистальна€ центриоль), дает начало аксиальному филаменту или аксонеме жгутика [de Kretscr, 1969, Fawcett and Phillips, 1969]. ƒруга€ центриоль, ориентированна€ перпендикул€рно аксонеме, сохран€етс€ как рудиментарна€ (остаточна€) структура и носит название проксимальной. јксонема отходит от центриоли, доходит до плазматической мембраны ранней сперматиды выт€гиваетс€, образу€ выступ. ћитохондрии образуют, спиральный воротникообразный футл€р вокруг средней части будущего жгутика .

4) ‘аза созревани€, во врем€ которой происходит удаление, Ђсбрасываниеї

цитоплазматической капли с шейки сперматозоида в виде Ђостаточных телецї и фагоцитоз их клетками —ертоли или эпителиальными клетками эпидидимиса .

—озревание сперматозоидов происходит в цитоплазме клеток —ертоли .

ѕри микроскопическом исследовании канальцевого эпители€ кажетс€, что незрелые половые клетки случайным образом сгруппированы в цитоплазме клеток —ертоли, однако при более тщательном изучении видно, что в канальцевом эпителии половые клетки различной степени зрелости образуют стабильные ассоциации.  оличество ассоциаций посто€нно и видоспецифично, у человека описано 6 клеточных ассоциаций [Clermont, 1963].  леточные ассоциации впервые по€вл€ютс€ при пролиферации сперматогоний, когда формируетс€ синцитий. Ќезавершенный цитокинез во врем€ митотических и мейотнческих делений половых клеток приводит к тому, что количество клеток в синцити€х увеличиваетс€ в тыс€чи раз к тому времени, когда сперматозоиды выход€т в просвет семенных канальцев .

 ажда€ клеточна€ ассоциаци€ состоит из нескольких синцитиев, наход€щихс€ на разных стади€х дифференцировки. ¬ €ичках человека кажда€ клеточна€ ассоциаци€ занимает четко очерченный сектор эпители€ извитого семенного канальца .

ƒлительность цикла сперматогенеза человека была определена с помощью методов авторадиографического исследовани€ [Heller et al., 1969] .

ѕод циклом подразумеваетс€ изменение семиноформенного эпители€, при котором клеточный состав эпители€ полностью повтор€етс€ .

“ак, врем€ от по€влени€ прелептотенного сперматоцита до по€влени€ сперматоцита той же стадии развити€ следующей клеточной ассоциации (т.е. один цикл развити€ клеточной ассоциации) у человека занимает 16 суток. ѕолностью процесс сперматогенеза занимает 4 - 6 циклов и длитс€ 74±4 дн€.. Ётот процесс наиболее активен при 34∞—, поэтому избыток тепла или длительное лихорадочное состо€ние за 2-3 мес€ца до оценки сперматогенеза могут отрицательно вли€ть на количество сперматозоидов, их подвижность и морфологическое строение .

—формированные сперматозоиды выход€т в просвет семенных канальцев. —перматозоиды, выход€щие в проток семенных канальцев, не способны к успешному оплодотворению в естественных услови€х. ¬ протоке придатка €ичка сперматозоиды созревают и приобретают подвижность [Mooney et al., 1972, Moore, 1996]. ƒл€ созревани€ сперматозоидов необходимы андроген-зависимые факторы, секретируемые эпителием придатка €ичка. ¬ эпидидимисе сперматозоиды претерпевают значительные изменени€. ќни полностью тер€ют цитоплазматические капли (остатки цитоплазмы сперматиды), которые фагоцитируютс€ спермиофагами эпидидимиса.  роме того, происходит стабилизаци€ хроматина €дра и плотных фибрилл жгутика за счет дисульфидных св€зей, измен€етс€ липидна€ композици€, текучесть и зар€д плазматической мембраны, стабилизируютс€ мембраны митохондрий [Moore, 1990]. —перматозоиды приобретают подвижность и способность св€зыватьс€ с мембраной ооцита .

—перматозоиды человека проход€т придаток €ичка за 2 - 6 дней [Johnson and Varner, 1988], однако могут накапливатьс€ в хвостовом участке эпидидимиса, что приводит к увелечению их концентрации. Ќеизвестно в течение, какого времени сперматозоиды, хран€щиес€ в дистальном отделе эпидидимиса, могут оставатьс€ живыми. —екрет эпидидимиса содержит ферменты, инактивирующие литические ферменты дегенерирующих сперматозоидов, а также антиоксиданты [Kirchhoff et al., 1991] .

¬ хвостовом отделе проток эпидидимиса становитс€ менее извитым и выходит из придатка, превраща€сь в сем€вынос€щий проток. ¬ области мочевого пузыр€ в сем€вынос€щий проток впадают протоки семенных пузырьков. —еменные пузырьки содержат большое количество фруктозы и €вл€ютс€ ее источником в семенной плазме.  роме того, в семенных пузырьках секретируютс€ простагландины, которые стимулируют гладкие мышцы и, возможно, облегчают перемещение сперматозоидов в половых пут€х женщины. ƒалее сем€вынос€щий проток превращаетс€ в сем€извергающий канал, проходит через предстательную железу и открываетс€ в уретру .

1.3 √ормональна€ регул€ци€ мужской репродуктивной системы  ак известно, €ички человека имеют дво€кую функцию.  ак эндокринный орган, они синтезируют и секретируют половые гормоны.  ак экзокринный орган, они производ€т сперматозоиды. √ормональна€ регул€ци€ мужской репродуктивной системы включает в себ€ несколько уровней: ÷Ќ—, гипоталамус, гипофиз, гонады и периферические органы и ткани-мишению .

ƒействие коры больших полушарий головного мозга на репродуктивную функцию осуществл€етс€ через гипоталамус, где синтезируютс€ и секретируютс€ рилизинг-факторы (либерины) и ингибирующие факторы (статины) .

√онадотропный рилизинг-гормон √онадотропный рилизинг-гормон (√н–√), или гонадолиберин декапептид (состоит из 10 аминокислот). ≈го секреци€ происходит не посто€нно, а в виде коротких пиков, с периодом примерно 2 часа. √н–√ поступает в переднюю долю гипофиза и, воздейству€ на его специфические клетки, вызыва€ секркцию гонадотропных гормонов. Ёти гормоны называютс€ гонадотропными гормонами, так как органом мишеныо дл€ них €вл€ютс€ клетки гонад. ¬ регул€ции репродуктивной функции участвуют три гонадотропных гормона: фолликулосгимули- рующий (‘—√), лютеинизирующий (Ћ√) и пролактин (ѕ–Ћ), секреци€ которых регулируетс€ по принципу обратной св€зи: при снижении концентрации определенного гормона в крови соответствующие клетки гипоталамуса вырабатывают √н–√, который поступает по разветвлени€м аксонов в переднюю долю гипофиза. ¬ ответ на это клетки передней доли гипофиза выдел€ют гонадотропные гормоны, стимулирующие образование половых гормонов. » наоборот, повышение содержани€ гормона в крови €вл€етс€ сигналом дл€ клеток гипоталамуса прекратить выработку √н–√.  летки гипофиза отвечают на это замедлением секреции и освобождением гонадотропных гормонов, что приводит к подавлению секреции половых гормонов. ” мужчин основным гормоном, контролирующим секрецию √н–√, €вл€етс€ тестостерон .

“естостерон вли€ет на секрецию гонадотропинов по механизму обратной св€зи, как на уровне гипоталамуса, так и гипофиза .

‘олликулостимулирующий и лютеинизирующий гормоны ‘олликулостимулирующий гормон (‘—√), или фоллитропин, и лютеинизирующий гормон (Ћ√), или лютропин, - гликопротеины. Ћ√ и ‘—√ имеют общий принцип строени€ с другими гликопротеиновыми гормонами, такими, как тиреотропный гормон (““√) и хорионический гонадотропин человека (’√„).

ќни состо€т из двух полипептидных цепей:

-цепь (субъединица) одинакова дл€ всех гормонов, -цепь, несмотр€ на структурную схожесть, придает каждому гормону определенную специфичность. Ћ√ и ‘—√ имеют разные терминальные гликозиды, что определ€ет разный период их полувыведени€ из системы циркул€ции. Ћ√ содержит в своем составе много N-ацетилглюкозаминсульфата и быстро удал€етс€ из системы циркул€ции, так как взаимодействует со специфическими рецепторами на гепатоцитах, которые распознают сульфатные группировки. ‘—√ имеет сиалированные окончани€, что защищает его от метаболического поглощени€ в печени, поэтому он длительно циркулирует в крови. ‘—√ у мужчин необходим дл€ нормального формировани€, развити€ и функции семенных канальцев, также он активно вли€ет на сперматогенез. Ћ√ стимулирует выработку €ичками андрогенов Ц мужских половых гормонов .

ѕосле наступлени€ половой зрелости синтез гормонов активируетс€ импульсами из ÷Ќ—, а также такими факторами, как масса тела и лептин (гормон, вырабатываемый клетками жировой ткани). ” детей до пубертатного периода концентраци€ Ћ√ и ‘—√ в крови низка€. ѕродукци€ Ћ√ и ‘—√ продолжаетс€ в течение всего репродуктивного возраста .

ќсновным ингибитором высвобождени€ Ћ√ €вл€етс€ тестостерон, дл€ ‘—√ ингибин ¬ и фоллистатин (гормоны, вырабатываемые клетками —ертоли) .

—тимулирует секрецию гонадотропных гормонов активин. ¬ысока€ концентраци€ тестостерона по механизму обратной св€зи подавл€ет секрецию гонадотропинов, что может привести даже к уменьшению количества сперматозоидов в э€кул€те .

Ћ√ взаимодействует с интерстициальными клетками Ћейдига .

ќсновным ответом клеток Ћейдига на Ћ√ €вл€етс€ секреци€ тестостерона .

”ровень Ћ√ в крови Ч первичный регул€тор скорости синтеза тестостерона и его секреции в кровь. ”величение уровн€ Ћ√ в крови приводит к гипертрофии клеток Ћейдига и увеличению секреции тестостерона .

–егул€ци€ содержани€ Ћ√ осуществл€етс€ по принципу отрицательной обратной св€зи, высокий уровень тестостерона уменьшает секрецию Ћ√ гипофизом. —нижение уровн€ Ћ√ определ€етс€ секреторной активностью передней доли гипофиза .

‘—√ св€зываетс€ с поверхностными рецепторами клеток —ертоли и сперматогониев. ќтветом на действие этого гормона €вл€етс€ синтез и секреци€ многочисленных белков и низкомолекул€рных компонентов клеток —ертоли, таких, например, как андроген-св€зывающий белок (androgenbinding protein - ј¬–), €вл€ющийс€ рецептором дл€ тестостерона, и ингибин .

который регулирует уровень ‘—√ по принципу обратной св€зи .

“естостерон диффундирует в цитоплазму клеток —ертоли и св€зываетс€ с рецептором Ч ј¬–.  омплекс тестостерон-ј¬– активирует синтетические процессы в клетках —ертоли. ¬ €драх клеток —ертоли комплекс распадаетс€, тестостерон может метаболизироватьс€ клетками —ертоли до дегидротестостсрона. „асть тестостерона переноситс€ в адлюминальную часть семенного канальца, св€зыва€сь со сперматоцитами и сперматидами и индуциру€ специфические синтетические процессы сперматогенеза и спермиогенеза. [Hudson et al.,1986, Millette, 1990;

ћихайличенко, 1990] .

ѕролактин ѕролактин (Ћактотропный гормон) - пептидный гормон передней доли гипофиза, который отличаетс€ от других гормонов гипофиза тем, что его секреци€ не регулируетс€ по принципу обратной св€зи, вовлекающей органы-мишени. —екрецию пролактина контролируют локальные факторы, нейромедиаторы и стероидные гормоны. –оль пролактина в мужском организме не€сна; возможно, он потенцирует эффекты двух других гонадотропных гормонов - ‘—√ и Ћ√. ѕовышенный уровень пролактина в крови ведет к дисфункции гонад. Ќа уровне гипоталамуса гиперпролактинеми€ вызывает нарушение режима выброса √н–√, что приводит к снижению уровн€ Ћ√ и ‘—√ и последующему снижению уровн€ тестостерона и вторичной недостаточности гонад .

“естостерон ¬еществами оказывающими стероидный эффект в организме мужчин €вл€ютс€: тестостерон, андростендион, 17-гидроксипрогестерон, андростерон, 5- дигидротестостерон [ƒыгало,1993.] “естостерон имеет, регулирующее значение в половой дифференцировке в неонатальный период необходим, необходим дл€ стимул€ции сперматогенеза и степени активности репродуктивной системы в подростковом периоде и его поддержани€ в зрелом возрасте. ¬ начале пубертатного периода тестостерон ускор€ет рост трубчатых костей, когда же его уровень резко возрастает, наступает окостенение диа- и эпифизарных хр€щей и остановка роста. “естостерон поддерживает нормальный минеральный состав костной ткани. “акже тестостерон оказывает пр€мой анаболический эффект как на гладкие, так и на поперечно-полосатые мышцы, увеличива€ мышечную массу за счет гипертрофии миофибрилл .

¬ли€ние тестостерона на эритропоэз обусловлено усилением продукции эритропоэтина в почках и соответственно стимул€цией клеток красного ростка в костном мозге. ѕоэтому более высокие нормальные показатели количества эритроцитов и концентрации гемоглобина у мужчин объ€сн€ютс€ стимулирующим эффектом андрогенов на эритропоэз.  роме того, тестостерон способен активировать экспрессию тромбоксановых рецепторов на тромбоцитах, вызыва€ усиление их агрегации, что можно рассматривать как повышенную предрасположенность к тромбозам .

“естостерон стимулирует размножение сперматогониев и мейоз сперматоцитов. ƒаже незначительное нарушение ритма секреции тестостерона или малейший дефицит тестостерона могут привести к торможению сперматогенеза и даже к бесплодию .

“естостерон синтезируетс€ в основном эндокриноцитами Ц клетками Ћейдига €ичек (гораздо в меньшей степени Ц надпочечниками), путем последовательного превращени€ холестерина липопротеидов низкой плотности в прегненолон, дегидроэпиандростерон и андростендион.

ѕроцесс синтеза и секреции тестостерона регулируетс€ гипоталамо-гипофизарногонадной системой по механизму обратной св€зи следующим образом:

падение уровн€ свободного тестостерона в плазме крови последовательно стимулирует выработку √н–√ и секрецию Ћ√, который, непосредственно действу€ на клетки Ћейдига, вызывает продукцию тестостерона .

ћеханизм действи€ тестостерона на клетки-мишени ќсновным путем метаболизма тестостерона €вл€етс€ образование более активного андрогена - 5 -дигидротестостерона (ƒ√“) под вли€нием ароматаз - формирование эстрадиола с полной утратой специфического действи€ и приобретением новых свойств. ¬осстановление тестостерона до ƒ√“ происходит на уровне эндоплазматического ретикулума с участием фермента 5 -редуктазы. ƒ√“ инактивируетс€ путем восстановлени€ до 17кетостероидов, которые экскретируютс€ с мочой. ѕродукты дальнейшего превращени€ дигидротестостерона значительно менее активны, чем тестостерон и дигидротестостерон .

ќбразовавшийс€ в клетках-мишен€х ƒ√“ взаимодействует со специфическими цитоплазматическими рецепторами, число которых в пределах одной клетки может достигать 100 ќќќ.. ¬ результате взаимодействи€ рецепторов и ƒ√“ формируетс€ андроген-рецепторный комплекс, который проникает в €дро клетки, соедин€етс€ со специфическими участками ƒЌ  и измен€ет активность определенных генов .

јндрогены оказывают положительный эффект на стабильность андрогеновых рецепторов в клетках. ”меньшение концентрации андрогенов приводит к деградации рецепторов.  оличество андрогеновых рецепторов снижаетс€ с возрастом, зависит от ткани и клеточной попул€ции. ƒефекты андрогенового рецептора, возникающие в результате делеции или инактивации гена андрогенового рецептора, способствуют изменению функции рецептора, и, как следствие, возникает недоразвитие €ичек. ѕолное исчезновение андрогенового рецептора приводит к развитию женского фенотипа с отсутствием любых про€влений мужской сексуальности .

Ѕиологические эффекты тестостерона

ќсновными биологическими эффектами тестостерона €вл€ютс€:

стимулирующее вли€ние на половые органы;

Х стимулирующее вли€ние на добавочные половые железы (предстательна€ Х железа, семенные пузырьки);

активаци€ сперматогенеза;

Х маскулинизирующее воздействие на развитие и выраженность вторичных Х половых признаков (строение скелета, состо€ние мышечной и костной систем, характер оволосени€, голосовой аппарат, кожный покров);

активаци€ метаболических процессов (вли€ние на обмен жиров, белков, Х углеводов, микроэлементов, а также эритропоэз) .

1.4 »сследование э€кул€та ќсновной целью исследовани€ э€кул€та €вл€етс€ определение способности спермы к оплодотворению и вы€вление заболеваний и/или патологических процессов, вызвавших поражени€. ¬ последнее врем€ исследование э€кул€та проводитс€ дл€ значительно более широкого диапазона диагностических задач, чем это проводилось раньше, и обусловлено развитием вспомогательных репродуктивных технологий (¬–“) .

¬спомогательные репродуктивные технологии позвол€ют в насто€щее врем€ добитьс€ беременности в большинстве случаев при нарушени€х фертильности спермы. ќбразцы спермы, используемые в лаборатории ¬–“, могут быть получены из э€кул€та, придатка €ичника или самого €ичка. ¬ клинике провод€тс€: ¬ћ» - внутримагочна€ инсеминаци€, когда э€кул€т предварительно обрабатываетс€, чтобы увеличить концентрацию нормальных сперматозоидов и вводитс€ в полость матки женщины в период овул€ции; Ё ќ экстракорпоральное оплодотворение, когда у женщины изымаютс€ €йцеклетки и помещаютс€ вместе со сперматозоидами дл€ наступлени€ оплодотворени€ вне организма женщины, в пробирке; » —»

Ц IntraCitoplasmatical Sperm Injection) или (англ. ICSI интрацитоплазматическа€ инъекци€ сперматозоида Ц разновидность Ё ќ, при которой в €йцеклетку под микроскопом вводитс€ всего один сперматозоид. Ёта технологи€ произвела революцию в репродуктологии, позвол€€ получить беременность даже при т€желых случа€х мужского бесплоди€. ƒл€ этого необходим один нормальный сперматозоид, который с помощью микроиглы помещаетс€ внутрь €йцеклетки. —перматозоид (или сперматиду) можно получить при пункции €ичка, если имеетс€ обтурационна€ азоосперми€. ѕолученные с помощью Ё ќ или » —» эмбрионы впоследствии перенос€тс€ в подготовленную матку .

¬ большинстве случаев дл€ ¬–“ используютс€ сперматозоиды из э€кул€та, полученного путем мастурбации (желательно в комнате, расположенной недалеко от лаборатории). »ногда может использоватьс€ ретроградный э€кул€т (получаемый после центрифугировани€ мочи), возможно, получение спермы в операционной комнате с помощью электроэ€кул€ции (например, у парализованного пациента). —перму также можно извлекать хирургическим путем Ч при открытой биопсии €ичка (“≈«≈, экстракци€ сперматозоидов из ткани €ичка) или при аспирации сперматозоидов из придатка €ичка (ћ≈«ј, аспираци€ сперматозоидов из придатка €ичка) Ё€кул€том называют совокупность секреторного материала, который выходит из уретры в кульминационный момент сексуальной стимул€ции, обычно совмещенной с оргазмом. Ёкул€т состоит приблизительно на 10 % из клеток и на 90 % из жидкости. —равнени€ объема э€кул€та из пре- и постсем€вынос€щего протока показали, что около эти 90% объема э€кул€та составл€ет секрет желез дополнительной секреции [Weiske,1994], преимущественно семенных пузырьков, бульбоуретральной и предстательной желез, меньший вклад внос€т  уперовы железы (Glandulae Cuperi), или луковичные железы и эпидидимис.    леткам э€кул€та относ€тс€, главным образом, сперматозоидами, а также могут круглые клетки, эпителиальные клетки или эритроциты. “аким образом, во врем€ сем€извержени€ концентрированна€ суспензи€ сперматозоидов, хран€ща€с€ в эпидидимисе, смешиваетс€ и разжижаетс€ с помощью секрета дополнительных желез мужского полового тракта .

—еменна€ жидкость имеет три основных показател€:

общее количество сперматозоидов: оно отражает продукцию 1 .

сперматозоидов €ичками и потенцию посттестикул€рной канальцевой системы;

общий объем э€кул€та, состо€щий из выделений желез 2 .

дополнительной секреции: параметр отражает секреторную активность желез;

качество сперматозоидов (их жизнеспособность, подвижность и 3 .

морфологи€) .

ќбычно различают четыре фракции э€кул€та: в первую преэ€кул€торную фракцию входит секрет  упферовских желез и желез Ћитта. Ёта фракци€ имеет в€зкую консистенцию и, возможно, служит дл€ нейтрализации остатков мочи в уретре и подготовки к транспорту сперматозоидов; ¬тора€ - предварительна€ фракци€, состоит из секрета простаты, который, собственно, и обеспечивает характерный запах Ђцветов каштанаї .

—екрет простаты содержит ферменты, разжижающие гелеобразный э€кул€т, прошедший через сем€вынос€щие протоки и эпидидимис; “реть€ - основна€ фракци€ состоит частично из секрета простаты, из секрета семенных пузырьков, эпидидимиса и €ичек. ѕредварительна€ и основна€ фракции содержат большую часть сперматозоидов; „етверта€ фракци€ терминальна€. “ерминальна€ фракци€ состоит исключительно из секрета семенных пузырьков. Ёта фракци€ желатиноподобна€ по консистенции и содержит массу неподвижных сперматозоидов. ¬ окончательном виде э€кул€т представл€ет собой в€зкую жидкость. Ќижний границей нормы дл€ объема э€кул€та, согласно критери€м ¬ќ« (2010), €вл€етс€ 1,5 мл .

¬о врем€ сексуального контакта, богата€ сперматозоидами фракци€ э€кул€та вступает в контакт с цервикальной слизью влагалища [Sobrero and MacLeod, 1962], остальные фракции остаютс€ во влагалище в виде свободной жидкости. ¬ отличие от естественных условий, в лаборатории весь э€кул€т собирают в один контейнер, где сперматооиды формируют коагул€нт с протеинами семенных пузырьков. «атем этот коагул€нт разжижаетс€ под вли€ние протеаз простаты, при этом осмол€рность возрастает [Bjо®rndahl and Kvist, 2003, Cooper, 2005]. ѕолучены некоторые доказательства тому, что качество образцов семени зависит от того, как э€кул€т был собран. Ё€кул€т, собранный с помощью мастурбации в специальной комнате р€дом с лабораторей, может иметь более низкое качество по сравнению с э€кул€том, полученным в неспермицидный презерватив по врем€ коитуса в домашних услови€х [Zavos and Goodpasture, 1989]. Ёто различие может отражать различные формы сексуального возбуждени€, так как врем€, потраченное на сбор образца семени посредством мастурбации Ч промежуток времени до э€кул€ции Ч также вли€ет на качество э€кул€та [Pound, 2002]. ќднако следует отметить, что, несмотр€ на услови€ сбора семени, качество э€кул€та в большей степени зависит от факторов, которые обычно не могут быть изменены, такие как продукци€ сперматозоидов €ичками, секрет желез и недавно перенесенна€ болезнь (особенно лихорадка). “акже следует записать и прин€ть во внимание при интерпретации результатов, такой фактор, как врем€ воздержани€. ѕри отсутствии э€кул€ции сперматозоиды накапливаютс€ в эпидидимисе, затем избыток клеток попадает в уретру и вымываетс€ вместе с мочой [Cooper et al.,1993, De Jonge C, 2004]. ”величение времени воздержани€ не отражаетс€ на жизнеспособности сперматозоидов и состо€нии хроматина [Tyler,1982, De Jonge, 2004], однако при этом нарушаетс€ функци€ эпидидимиса [CorreaPerez, 2004]. “аким образом, э€кул€т должен быть получен после полового воздержани€ в течение не менее суток и не более 7 дней .

ѕродолжительность дн€ воздержани€ перед первым и вторым забором спермы должна быть одинаковой. Ёто св€зано с тем, что дополнительный день воздержани€ может увеличить концентрацию сперматозоидов в э€кул€те на 25% [Carlsen et al., 2004]. ƒлительные (в течение нескольких мес€цев) периоды воздержани€ перед обследованием могут привести к нарушению эффективного процесса сперматогенеза, по€влению старых, дегенеративных форм, снижению качественных параметров сперматозоидов .

Ёти изменени€ и большинство неконтролируемых факторов объ€сн€ют хорошо известную внутрииндивидуальную вариабельность качества э€кул€та [Baker and Kovacs, 1985, Alvarez, 2003], что доказывает невозможность характеристики качества э€кул€та мужчины при анализе единственного образца спермы. ƒл€ получени€ достоверных данных важно оценить два или три образца семени [Poland, 1985, Berman et al., 1996, Carlsen et al., 2004, Keel, 2006] .

ѕри исследовании образца э€кул€та оцениваетс€ три основных параметра. Ќормальные диапазоны значений дл€ этих параметров предоставлены ¬семирной организацией здравоохранени€ (¬ќ«) в 2010 г., и они соответствуют данным о качестве спермы здоровых мужчин, у партнерш которых наступила беременность в течение первых 12 мес€цев при регул€рной половой жизни. ѕервым важным параметром €вл€етс€ концентраци€, котора€ рассчитываетс€ как количество сперматозоидов в миллионах на миллилитр. Ќижней границей нормы дл€ концентрации спермы, согласно критери€м ¬ќ« (2010) €вл€етс€ 15 миллионов на миллилитр, общее количество сперматозоидов в э€кул€те Ч 39 миллионов .

¬торым параметром €вл€етс€ качественна€ и количественна€ оценка подвижности сперматозоидов. ѕодвижность выражаетс€ как процентное соотношение разных категорий сперматозоидов, различающихс€ по скорости движени€.

Ёто следующие четыре категории:

“ип A, или активноподвижные сперматозоиды с поступательным движением, скорость которых превышает 25 микрометров в секунду (в течение секунды перемещаютс€ на рассто€ние, равное половине длины хвоста) .

“ип B, или малоподвижные сперматозоиды с поступательным движением, скорость которых составл€ет от 5 до 25 микрометров в секунду (в течение секунды перемещаютс€ на рассто€ние не менее длины одной головки) .

“ип C Ч это малоподвижные сперматозоиды с отсутствием поступательных движений, скорость которых составл€ет менее 5 микрометров в секунду .

“ип D Ч неподвижные сперматозоиды .

Ќижн€€ граница нормы дл€ сперматозоидов с поступательным движением составл€ет 32 %, а дл€ общей подвижности Ч 40 % (¬ќ« 2010) .

≈сли показатели ниже критериев ¬ќ«, такое состо€ние определ€етс€ как астенозоосперми€. ќтсутствие подвижных сперматозоидов во всем образце обозначаетс€ термином некрозоосперми€. —тандартным методом исследовани€ подвижности €вл€етс€ визуальна€ микроскопическа€ оценка, однако также полезным может оказатьс€ компьютерный анализ спермы (Computer Assisted Sperm Analysis, CASA), позвол€ющий оценить не только скорость, но и параметры кинетики. ѕодвижность €вл€етс€ решающим параметром, определ€ющим фертильность, субфертильность или бесплодие .

ќбщее процентное содержание сперматозоидов категории ј + ¬ €вл€етс€ важнейшим критерием дл€ проведени€ Ё ќ и внутриматочной инсеминации .

ѕри обнаружении только сперматозоидов категории D, необходимо применить дополнительные тесты дл€ отбора подход€щих жизнеспособных сперматозоидов .

“ретьим важным параметром €вл€етс€ морфометрическа€ и морфоструктурна€ оценка сперматозоидов. —огласно строгим критери€м ¬ќ« (2010), содержание сперматозоидов с нормальной морфологией должно составл€ть 4 и более процента. ѕри более низком значении состо€ние определ€етс€ как тератозоосперми€. √лобозоосперми€ Ч это дефект сперматозоидов, характеризующийс€ отсутствием акросомы и наличием сперматозоидов только с круглой головкой .

»сследование э€кул€та €вл€етс€ основой диагностики репродуктивного потнциала мужчины. Ќесмотр€ на отсутствие точных параметров отличающих фертильных мужчин от бесплодных, морфологи€ сперматозоидов €вл€етс€ наилучшим фактором прогнозировани€ фертильности. ”ровень успешности экстракорпорального оплодотворени€ коррелирует со строгими критери€ми  рюгера дл€ оценки морфологии сперматозоидов. [Kruger et al.,1986]. Ќаличие более чем одного показател€ с отклонением от нормы значительно повышает риск наличи€ бесплоди€ .

1.4.1 ћорфологи€ сперматозоидов «релые сперматозоиды €вл€ютс€ конечной стадией в процессе образовани€ мужских половых клеток (сперматогенеза). »сследование морфологии, наравне с подвижностью и концентрацией сперматозоидов, €вл€етс€ одним из основных параметров в оценке оплодотвор€ющей способности э€кул€та [Mankveld et al.,1991]. ќтмечаетс€ четка€ коррел€ци€ между высоким процентом содержани€ патологических форм сперматозоидов и низкой способностью спермы к оплодотворению. ¬ то же врем€ не обнаружено зависимости между этим параметром и частотой аномальных беременностей или частотой спонтанных абортов [Bostofte et al.,1984] .

ћорфологи€ сперматозоидов человека обладает гетерогенностью, среди них всегда присутствуют как нормальные, так и атипичные, дефектные клетки. “ака€ вариабельность морфологических характеристик сперматозоидов затрудн€ет их оценку .

—перматозоиды были обнаружены с момента создани€ первого микроскопа Ћевенгуком [Leeuwenhoeck,1677] с этого времени посто€нно производились попытки изучени€ и классификации их морфологии. —аrу (1916) указал на взаимосв€зь нарушенной морфологии сперматозоида и снижени€ оплодотвор€ющей способности. (1934) создал Williams современное деление сперматозоида на головку, шейку, хвостик. MacLeod (1951) разработал классификацию сперматозоидов. ¬ разных вариаци€х эта классификаци€ просуществовала до конца 80-х годов (на ее основе разработаны классификации ¬ќ« ранних протоколов 1980 и 1987 гг.) .

впервые попыталс€ прив€зать классификацию Hofmann (1985) сперматозоидов к клиническим показател€м (так называема€ ƒюссельдорфска€ классификаци€). ¬ конечном итоге, Kruger (1987) предложил считать нормальными сперматозоиды, обнаруженные в верхнем отделе цервикального канала женщин через 8 часов после коитуса. —чита€, что эта попул€ци€ сперматозоидов представлена клетками, прошедшими селекцию в цервикальном секрете. јномальные сперматозоиды с нарушением морфологичнских структур, которые важны дл€ обеспечени€ подвижности и оплодотвор€ющей способности, выбраковываютс€ и не участвуют в процессе оплодотворени€. Ѕольшинством исследователей в насто€щее врем€ прин€ты, так называемые Ђстрогие критерииї  рюгера дл€ оценки морфологии сперматозоидов, в основу которых положена характеристика сперматозоидов, прошедших в верхний отдел цервикального канала при посткоитальной пробе [Menkveld et al., 1991].  ритерии нос€т название Ђстрогиеї, так как принцип анализа при оценке сперматозоида сперматозоид идеален, или патологический. ¬се пограничные, субнормальные, незрелые сперматозоиды отнесены к патологии. ѕри этом даны четкие границы размеров и рекомендации по морфометрическим показател€м .

»сследование сперматозоидов, полученных из женского репродуктивного тракта, особенно из цервикальной слизи после полового контакта [Fredriesson and Bjо®rk, 1977; Menkveld, 1990], а также с поверхности зоны пеллюцида [Menkveld, 1991; Liu and Baker, 1992] позвонило определить внешний вид морфологически нормального сперматозоида, который способен к оплодотворению .

ѕрименение строгих критериев в изучении морфологии сперматозоида позвол€ет установить анологию между процентом морфологически нормальных форм и времнем до наступлени€ беременности (time-topregnancy) in vivo и in vitro. [Eggert-Kruse, 1996, Jouannetet, 1988, Menkveld, 2001, Liu, 2003]. ѕолученные данные можно использовать дл€ оценки фертильного статуса мужчины .

—огласно строгим критери€м зрелый нормальный сперматозоид человека состоит из головки, шейки, средней части, основной части и концевой части жгутика. ¬ микроском сложно увидеть концевую часть жгутика. ѕоэтому клетку можно рассматривать как состо€щую из головки, шейки, и жгутика (средн€€ и основна€ части). ƒл€ сперматозоида, который считают морфологически нормальным, как головка, так и жгутик должны быть нормальными. ¬се пограничные формы следует считать аномальными .

√оловка должна быть гладкой овальной формы с четким контуром. ќна должна иметь четко выраженную акросомную область, занимающую 40Ц70% площади головки [Menkveld, 2001]. ¬ акросома не должно быть больших вакуолей и не более двух маленьких вакуолей, которые не должны занимать больше 20% головки. ѕостакросомна€ область не должна содержать никаких вакуолей. »ногда головка может быть заострена в постакросомальном районе .

ƒлина головки сперматозоида достигает 4,5-5,0 мкм, ширина 1,5-1,75 мкм .

Ўейка соедин€ет головку и жгутик. Ўейка должна быть тонка€, четко выражена и примерно той же длины, что и головка. ѕри этом главна€ ось шейки должна совпадать с центральной осью головки сперматозоида .

÷итоплазматическа€ капл€ рассматриваетс€ как патологическа€ в том случае, если она чрезмерна, велика, то есть когда она превышает одну треть размера головки сперматозоида [Mortimer and Menkveld, 2001] .

÷итоплазматические капли (окруженные мембраной пузырьки на средней части в месте соединени€ головки со жгутиком, €вл€ютс€ остатком цитоплазмы сперматиды) представл€ют нормальным компонентом физиологически функционального сперматозоида. ≈сли капли чрезмерно увеличены, они могут располагатьс€ вдоль средней части жгутика, что наблюдают в фазовоконтрастном микроскопе, в дифференциальном контрасте и при рентгеновой микроскопии живых клеток в сперме и цервикальной слизи [AbrahamPeskir,2002, Fetic, 2006] ∆гутик сперматозоида по длине подраздел€етс€ на среднюю зону, основной участок и концевую зону. ’вост должен быть пр€мым, одинаковой толщины на всем прот€жении и несколько уже в средней части. ќсновна€ часть жгутика должна иметь одинаковый диаметр по всей длине, быть тоньше шейки и составл€ть приблизительно 45 мкм в длину (примерно в 10 раз больше длины головки). ∆гутик может закручиватьс€ сам на себ€, при условии, что нет его поломки. «акрученные жгутики (360о) могут указывать на дисфункцию эпидидимиса [Pelfrey, 1982] .

Ѕольшую часть головки зрелого сперматозоида занимает €дро с плохо различимой €дерной оболочкой и гомогенной, плотно упакованной массой хроматина. “ака€ структура €вл€етс€ результатом физико-химического и морфологического преобразовани€, которое осуществл€етс€ на последней стадии спермиогенеза и продолжаетс€ во врем€ прохождени€ сперматозоидов через эпидидимис [Golan et al., 1996]. ѕри Ђсозреванииї

хроматина происходит удаление (элиминаци€) –Ќ  [Monesi, 1971], замещение соматических гистонов протаминами, богатыми аргинином [Bellve, 1979, Green et al., 1994], образование между протаминами дисульфидных мостиков, обеспечивающих стабильность хроматина, что €вл€етс€ завершающим этапом диф- ференцировки сперматозоидов при прохождении через эпидидимис [Saowaros and Raniym, 1979]. ядра зрелых сперматозоидов устойчивы к различным внешним воздействи€м, в том числе и к бактериальным токсинам .

ѕриблизительно 2/3 передней поверхности €дра покрыто акросомой или €дерной шапочкой. јкросома - это просветление в верхней части головки, имеет наружную и внутреннюю мембраны. јкросома содержит лизосомные ферменты протеаза, акрозин и гиалуронидаза, необходимые дл€ проникновени€ (пенетрации) сперматозоидами фолликул€рных клеток лучистого венца и прозрачной оболочки €йцеклетки [Yanagimachi, 1994] .

–азрыв внешней мембраны и высвобождение указанных ферментов нос€т название акросомальной реакции. ¬ норме акросомна€ реакци€ происходит при св€зывании сперматозоида с прозрачной оболочкой €йцеклетки .

«ачастую в €драх нормальных сперматозоидов вы€вл€ютс€ небольшие вакуоли, которые считаютс€ остаточными €влени€ми конденсации хроматина. ¬акуоли могут содержать гранул€рный или филаментозный материал, липидные и другие включени€ [Holstein, 1975,1976] .

Ўейка сперматозоида имеет сложное строение. Ќа тотальном препарате она вы€вл€етс€ как утолщение жгутика. ” сформированного сперматозоида шейка представл€ет собой усеченный конус, содержащий центриол€рный комплекс. ÷ентриол€рный комплекс состоит из перпендикул€рно расположенных проксимальной и дистальной центриолей .

ќт дистальной центриоли отходит аксонема, составл€юща€ морфологическую основу жгутика. јксонема жгутика образована по универсальной схеме, котора€ характерна дл€ большинства типов ресничек и жгутиков клеток эукариотических организмов [Gibbons, 1981]. ќна состоит из 9 периферических пар микротрубочек, расположенных по окружности, и центральной пары - микротрубочек (9+2).  аждый периферический дуплет состоит из полной микротрубочки (субъединица ј) и примыкающей к ней неполной микротрубочки (субъединица ¬). ќт субъединицы ј каждого дуплета в сторону субъединицы ¬ следующего по часовой стрелке дуплета отход€т выросты, состо€щие из белка динеина, про€вл€ющего Mgзависимую ј“‘-азную активность. ƒуплеты соединены тонкими, состо€щими из белка нексина мостиками. Ёта сложна€ организаци€ обеспечивает скольз€щее движение микротрубочек, лежащее в основе ундул€ции жгутика. ћикротрубочки аксонемы прикреплены к проксимальной центриоли непосредственно под головкой сперматозоида и т€нутс€ от шейки сперматозоида до кончика жгутика. ¬округ аксонемы расположены добавочные структуры. ¬ зависимости от их строени€, морфологически жгутик можно разделить на среднюю часть, основной участок и концевой участок. ¬ средней части аксонема окружена дополнительным слоем из 9 плотных наружных фибрилл и митохондрий, в основном участке они замен€ютс€ фиброзным слоем, в концевом участке остаетс€ только аксонема [Fawcett, 1975]. ¬ средней зоне жгутика морфологически нормальных сперматозоидов митохондрии образуют спираль вокруг аксонемы.  оличество витков спирали у человека от 5 до 14 [Schultz-Larsen, 1958] .

ѕатологические формы сперматозоидов ќбразцы э€кул€та человека содержат сперматозоиды с различными типами аномалий, что вы€вл€етс€ при микроскопировании. Ќеполный сперматогенез и некоторые формы патологии эпидидимиса часто св€заны с увеличенным количеством дпатологических сперматозоидов. јномальный сперматозоид обычно имеет сниженную способность к оплодотворению. ћорфологические дефекты могут быть св€заны с усиленной фрагментацией ƒЌ  [Gandini,2000], повышенным риском структурных хромосомных перестроек [Lee, 1996], незрелым хроматином [Dadoune, 1988] и анеуплоидией [Devillard,2002; Martin, 2003] .

»менно поэтому акцент сделан на форму головки сперматозоида, хот€ жгутик (средн€€ и основна€ его части) также рассматриваютс€ при оценке морфологии клетки .

Ќеобходимо отмечать следующие категории аномалии (дефекта):

јтипичные формы головки:

а) аномалии размера головки Ч большые или маленькие;

б) аномалии формы головки - каплевидные, грушевидные, конусообразные, округлые, аморфные;

в) аномалии акросомы - маленька€ акросома (40% площади головки), вакуолизированна€ акросома (если вакуолей более двух и их объем более 20% головки), несимметрична€ акросома;

г) вакуолизированные головки (вакуоли занимают 20% площади головки);

д) двойные и множественные головки;

е) много€дерные головки .

јтипичные формы шейки:

а) гетероаксиалыюсть - ассиметричное прикрепление средней части к головке (угол между головкой и жгутиком 180∞);

б) толста€ или с неправильным контуром, чрезмерно изогнута€, аномально тонка€ шейка;

в) цитоплазматические капли на шейке .

јтипичные формы основной части жгутика:

а) коротка€;

б) сломанна€;

в) с резко выраженным углом;

г) закрученный на конце или закрученный полностью;

д) неравномерной толщины;

е) с тонкой средней частью .

»злишне резидуальна€ цитоплазма (excess residual cytoplasm, ERC) св€зана с патологичным сперматозоидом, формирующимс€ при аномальном сперматогенезе. —перматозоид с большим количеством окрашенной цитоплазмы с неровным контуром, размером более одной трети головки, часто сочетаемым с дефектом средней части (Mortimer and Menkveld, 2001), считают аномальным. “акую аномалию не следует называть цитоплазматической каплей [Cooper, 2005] .

—ледует учитывать, что дефектные сперматозоиды могут иметь более одной аномалии в разных сочетани€х .

Ё —ѕ≈–»ћ≈Ќ“јЋ№Ќјя „ј—“№ 2 ћј“≈–»јЋџ » ћ≈“ќƒџ

2.1 ќбъект исследовани€ ќбъектом исследовани€ служил э€кул€т человека. ћатериал собирали на базе ќќќ " линика Ќуриевых,  линика –епродуктивного «доровь€" .

—бор образцов производили согласно рекомендаци€м, описанных в –уководство ¬ќ« по исследованию и обработке э€кул€та человека [ѕ€тое издание, 2012] .

2.1.1 ћикроскопическое исследование семенной жидкости ћикроскопическое исследование э€кул€та согласно рекомендаци€м ¬ќ« следует проводить в 2 этапа после полного его разжижени€. Ќа первом этапе оцениваетс€ концентраци€, подвижность (кинезиограмма), агрегаци€ и агглютинаци€ сперматозоидов, а также наличие других клеточных элементов в камере ћаклера. »сследование перечисленных параметров проводитс€ на неокрашенных нативных мазках с использованием световой или фазовоконтрастной микроскопии. Ќа втором этапе проводитс€ морфологическа€ оценка сперматозоидов в окрашенных препаратах, вы€вл€етс€ наличие антиспермальных антител, при необходимости оцениваютс€ окрашенные препараты на жизнеспособность сперматозоидов .

2.1.2 ќпределение подвижности сперматозоидов человека ѕроцент прогрессивно-подвижных сперматозоидов св€зывают с эффективностью наступлени€ беременности [Jouannet et al.,1988, Larsen et al., 2000, Zinaman et al., 2000]. ѕодвижность сперматозоидов в э€кул€те оценивали сразу же после разжижени€ образца (период с 30 до 60 мин после получени€), чтобы ограничить действие обезвоживани€, рЌ или температурных колебаний на подвижность .

1. “щательно и осторожно без образовани€ пузырьков перемешали трансфер

- пипеткой образец спермы,

2. ¬з€ли 5 мкл э€кул€та и нанесли на камеру ћаклера по центру, осторожно без образовани€ пузырьков притерли покровное стекло до образовани€ радужных колец Ќьютона .

3. „ерез 2 мин под микроскопом рассчитали число сперматозоидов каждой категории подвижности в 9-ти квадратах камеры с помощью лабораторного счетчика .

ѕодвижность каждого сперматозоида оценивалась следующим образом .

ѕрогрессивно-подвижные (PR, сперматозоиды,

progressive motility):

двигающиес€ активно, либо линейно, либо по кругу большого радиуса, независимо от скорости .

Ќепрогрессивно - подвижные (NP, non- progressive motility): все другие виды движений с отсутствием прогрессии, то есть плавающие по кругу небольшого радиуса, жгутик с трудом смещает головку или когда наблюдают только биение жгутика .

Ќеподвижные (IM immotility): отсутствие движени€. [¬ќ«, ѕ€тое издание 2012] .

ƒальнейший эксперимент проводили с образцами э€кул€та, которые входили в референтные значени€ показателей э€кул€та основанные на рекомендаци€х ¬ќ« .

–еферентные значени€ показателей э€кул€та в большинстве методзависимые, поэтому имеютс€ рекомендации, согласно которым Ђнормальные значени€ї устанавливаютс€ в собственной лаборатории. ќднако технологи€ получени€ Ђсобственных нормї очень сложна€. ¬ частности, дл€ получени€ нормативных значений, согласно рекомендации ¬ќ«, необходимо исследовать образцы э€кул€та мужчин, у партнерш которых наступила беременность, причем желательно в течение 12 мес€цев после прекращени€ приема супругами контрацептивов. Ќеобходимо исследовать достаточно большое число (1000) образцов э€кул€та и затем сопоставить результаты с наступлением беременности. ѕоэтому трудно предположить, что  ƒЋ самосто€тельно могут получить нормальные значени€ э€кул€та. Ѕолее того, практически повсеместно не определены истинные пределы нормативных показателей э€кул€та. ¬ то же врем€ нет достаточно веских доказательств каких-либо их различий между разными этническими группами .

ѕриводимые в таблице 1 референтные значени€ э€кул€та основаны на рекомендаци€х ¬ќ«, в которых подчеркиваетс€, что эти нормы получены, исход€ из клинического опыта многих специалистов .

“аблица 1- –еферентные значени€ э€кул€та (руководство ¬ќ«, 2010)

Ц  Ц  Ц

Ёти показатели не €вл€ютс€ минимально необходимыми дл€ наступлени€ зачати€. ћужчины, показатели э€кул€та у которых ниже указанных, также могут быть фертильны. Ѕолее того, стандартный параметр Ђконцентраци€ сперматозоидовї €вл€етс€ собирательным за счет функционировани€ двух систем Ч системы выработки Ђконцентратаї сперматозоидов (€ички) и жидкой части э€кул€та (придаточные половые железы). ѕоэтому он никоим образом не может быть исследован как критерий оценки сперматогенеза и его нарушений, в расчет идут только выраженные отклонени€ от нормы .

(таблица 2) .

“аблица 2 -  лассификаци€ показателей э€кул€та (руководство ¬ќ« 2010) Ќормозоосперми€ Ќормальный э€кул€т в соответствии с нормативными значени€ми ќлигозоосперми€  онцентраци€ сперматозоидов ниже нормативных значений јстенозоосперми€ ѕодвижность ниже нормативных значений “ератозоосперми€ ћорфологи€ ниже нормативных значений ќлигоастенозоосперми€ Ќаличие нарушений всех трех показателей (также подходит при комбинации нарушений двух показателей) јзоосперми€ Ќет сперматозоидов в э€кул€те јсперми€ Ќет э€кул€та 2.1.3 ќценка морфологии сперматозоидов человека ќпределение морфологии сперматозоидов состоит из следующих этапов (которые описаны более подробно в соответствующих разделах

–уководства ¬ќ« 2012):

1. ѕриготовление мазка спермы на предметном стекле [¬ќ«, –аздел 2.13.2] .

1. ¬ысушивание мазка на воздухе, фиксаци€ и окраска [¬ќ«, –аздел 2.14] .

2. ќценка предметного стекла в световом поле при увеличении х1000 с иммерсионным маслом [¬ќ«, –аздел 2.15 и 2.16] .

ѕодсчет числа нормальных и аномальных сперматозоидов с помощью 3 .

лабораторного счетчика. ќценка 200 сперматозоидов в каждом дупликате (на втором предметном стекле), дл€ достижени€ приемлемо низкой статистической ошибки. [¬ќ«, –аздел 2.15.2] .

2.2 ћетоды окрашивани€ ƒл€ окраски препаратов ¬ќ« рекумендует использовать такие методы, как окраска по ѕапаниколау, Ўорру, гематоксилином, с помощью методов быстрого окрашивани€ Diff-Quik или Spermac Stain .

2.2.1 ќкраска по ѕаниколау ќкраска цитологических мазков по ѕапаниколау [Papanicolaou et.al,1943] - общепризнанный метод, широко примен€емый при скрининге рака шейки матки, в цитологической диагностике. ѕринцип метода заключаетс€ в том, что €дра клеток избирательно окрашиваютс€ гематоксилином, цитоплазма смесью красителей в разные цвета в зависимости от типа клеток и их зрелости.   сожалению, данна€ методика довольно сложна и многостадийна, требует много дефицитных и дорогосто€щих реактивов. ѕри окраске по ѕапаниколау последовательно используютс€ следующие реактивы: гематоксилин дл€ окраски €дер, краски OG6 и EA дл€ окраски цитоплазмы. ѕри окраске в комбинированной цитоплазматической краске EA, сначала быстро окрашиваетс€ цитоплазма эозином в розовый цвет, затем, часть клеток перекрашиваетс€ в зелЄный цвет в результате действи€ красител€ светло-зелЄный и протравы Ц фосфорновольфрамовой (или фосфорно-молибденовой) кислоты. ќкраска цитоплазмы клеток эозином в розовый цвет осуществл€етс€ в течение нескольких дес€тков секунд. ѕроцесс окраски в зелЄный цвет происходит относительно медленно и требует, согласно рекомендаци€м [Gary,2006, Gill, 2012] около 8 минут .

—ам ƒж.Ќ. ѕапаниколау видел достоинство своей методики в том, что препарат получаетс€ прозрачным. ¬ протоколах, опубликованных ѕапаниколау, использовалось врем€ окрашивани€ в ≈ј 2-3 минуты [Papanicolaou, 1942, Papanicolaou et.al, 1943, Papanicolaou, 1963] .

2.2.2. ќкраска гематоксилином

Ёта методика €вл€етс€ одной их самых распространЄнных способов окраски в гистологии и цитологии. √ематоксилин сам по себе не €вл€етс€ красителем, поэтому его подвергают окислению, в результате чего он превращаетс€ в крас€щее вещество - гематеин. √ематеин представл€ет активный ингредиент в крас€щем растворе. ¬ соединении с некоторыми сол€ми, такими, как соли аммони€, железа, меди, хрома гематин дает четкое окрашивание клеточных структур в €рко-синий цвет [Lillie, 1965] .

»спользуют гематоксилин Ёрлиха, ћайера, железный гематоксилин √ейденгайна .

2.2.3 Ќабор дл€ окрашивани€ "Spermac Stain" ƒиагностический набор Spermac Stain, позвол€ет оценить морфологию сперматозоидов, и дифференцировать нормальные сперматозоиды от аномальных спермальных клеток. ¬ набор включены следующие реагенты:

–еагент ј: красный; –еагент Ѕ: бледно-зеленый; –еагент —: темно-зеленый;

‘иксатор .

2.3 ѕроцедура исследовани€ –азжиженный образец э€кул€та тщательно перемешали с помощью пипетки трансфер. — помощью дозатора вз€ли аликвоту в количестве 5Ц10 мкл в зависимости от концентрации сперматозоидов, не позвол€€ сперматозоидам осесть в суспензии. ƒалее нанесли аликвоту на конец предметного стекла.  аплю, взвеси сперматозоидов размазали по поверхности предметного стекла при помощи пипетки в горизонтальном положении. —делали дополнительно два мазка из данного образца э€кул€та на случай проблем с окрашиванием или поломкой одного предметного стекла. ќб€зательно промаркировали предметные стекла информацией об образце, то есть нанесли идентификационный номер. ќценку морфологии выполн€ли дважды на каждом стекле, в соответствии с рекомендаци€ми ¬ќ« [–уководство ¬ќ«, 2012], с помощью лабораторного счетчика —‘  ћ»Ќ»ЋјЅ". ¬ исследовании были изучены 20 образцов спермы с диагнозом нормозоосперми€ .

ƒл€ окраски готовых препаратов использовали три методики: окраску по ѕапаниколау, окраску гематоксилином, набор дл€ окрашевани€ Spermac ќкрашивание образцов производили согласно рекомендаци€м, Stain .

описанных в соответствующих инструкци€х к наборам гистологических красителей .

3 –≈«”Ћ№“ј“џ » ќЅ—”∆ƒ≈Ќ»≈

3.1 ќкраска семенной жидкости по ѕапаниколау

–исунок 1. ћазок, окрашенный по ѕапаниколау .

ћикрофотографи€ сперматозоидов. »ммерси€. x1000 ¬ препаратах, окрашенных по ѕапаниколау сперматозоиды с бледно окрашенной головкой, отсутствует контраст между €дром и акросомальной частью, хвостик также слабо окрашен, вакуоли не заметны. ѕолученный результат окрашивани€ усложнил оценку морфологии половых клеток и способность дифференцировать нормальный сперматозоид от аномального сперматозоида. ћетод ѕапаниколау оказалс€ более длительным, сложным и включает много стадий окрашивани€ цитологического препарата, по сравнению с другими методами окраски .

Ц  Ц  Ц

–исунок 2. ћазок, окрашенный набором "Spermac Stain" .

ћикрофотографи€ сперматозоидов. »ммерси€. x1000 ѕрименение диагностического набора дл€ окраски сперматозоидов "Spermac Stain" позволило нам оценить морфологию и лучше выделить различные части спермальной клетки (голова, акросома, средн€€ часть и хвост) в сравнении с окраской по ѕапаниколау. јкросома окрасилась в светло-зеленый цвет, €дро клетки приобрело темно-зеленый тон иногда, присутствовал оттенок красного, средн€€ часть и хвост окрасились в зеленый цвет. ќднако подсчет усложн€ли артефакты (рыхлые скоплени€ краски), клеточный дебрис и окрашенные т€жи слизи.   тому же данна€ методика окрашивани€ требовала отмывку э€кул€та 0,9% физиологическим раствором перед приготовлением препарата, что, во-первых, вли€ет на процент нормальных сперматозоидов (рисунок 3), а во-вторых - увеличивает врем€ анализа .

3.2.1 ¬ли€ние центрифугировани€ на процент нормальных сперматозоидов ѕри воздействии центробежного ускорени€ 1500 оборотов в минуту в течение 15 минут на образец э€кул€т человека наблюдали уменьшение процента нормальных сперматозоидов на 1,3±0,3% по сравнению с образцом без отмывки. ƒальнейшее увеличение обротов до 3000 оборотов в минуту привело к еще большому снижению процента нормальных сперматозоидов на 2,3 ± 0,4%, относительно контрол€. ¬ препаратах спермы после отмывки физиологическим раствором увеличилось количество сперматозоидов с оторванными хвостиками .

Ц  Ц  Ц

–исунок 3. - ¬ли€ние центрифугировани€ на процент нормальных сперматозоидов в препаратах, окрашенных гематоксилином .

ѕо оси абцисс - обозначено количество оборотов в минуту; по оси ординат значени€ нормальных сперматозоидов в процентах;

* - достоверность, p 0.05 ¬озможным объ€снением этому €вл€етс€ тот факт, что действие центробежных сил повли€ло на соединение между белками, составл€ющие основу микротрубочек хвоста сперматозоида .

3.3 ќкраска семенной жидкости гематоксилином –исунок 4. ћазок, окрашенный гематоксилином. ћикрофотографи€ сперматозоидов. »ммерси€. x1000 ѕри оценке препаратов э€кул€та человека, окрашенных гистологическим красителем гематоксилин мы смогли легче провести дифференцировку нормальных сперматозоидов от аномальных спермальных клеток. ћы отчетливо смогли выдилить различные части сперматозоида:

акросома окрасилась в бледно- синий цвет, €дра приобрели темно-синее окрашивание, хвостик стал светло-синего цвета. —ледует отметить, что €дрышки в головке сперматозоида выгл€дили отчетливее, по сравнению с результатами предыдущих окрашиваний, что €вл€етс€ важным морфометрическим критерием при оценке нормального сперматозоида .

—лизь, присутствующа€ в образцах не окрасилась. Ёто доказывает то, что данна€ методика не требует отмывки э€кул€та и позвол€ет нам исключить вли€ние центрифугировани€ и сэкономить врем€ анализа .

3.4 ѕодсчет числа нормальных и аномальных сперматозоидов с помощью лабораторного счетчика в препаратах э€кул€та, окрашенных разными цитологическими красител€ми ѕри дифференциальном подсчете было показано, что процент нормальных сперматозоидов в окрашенных препаратах Spermac stain и гематоксилином ћайера имеют не большие расхождени€, но максимальные значени€ принадлежали окраске √ематоксилином ћайера. ¬ мазках, окрашенных набором "Spermac Stain" после центрифугировани€ при 1500 об/мин показатель нормальных сперматозоидов составил 8.1 ± 0,5%. (p0.01) .

ѕроцент нормальных сперматозоидов в образце э€кул€та отмытый при тех же услови€х и окрашенный красителем √ематоксилин составил 11.2 ± 0,4 (p0.01). ѕри увеличении оборотов до 3000 в минуту результат составил 7.4 ± 0.4% (p0.01) при окраске "Spermac Stain" и 10.3 ± 0,4%(p0.01) при использовании методике окраски √ематоксилином (рисунок 5,6)

Ц  Ц  Ц

–исунок 6 - ƒифференциальный подсчет сперматозоидов человека при использовании разных цитологических красителей .

ѕо оси абцисс - значени€ нормальных сперматозоидов в процентах;

* - достоверность, p0.001 ѕолученные результаты при подсчете нормальных и патологических сперматозоидов в препаратах, окрашенных разными красител€ми, позволило нам выбрать √ематоксилин, как лучший методом окрашивани€ сперматозоидов в нашем исследовании при сравнении трех методик. Ёто св€зано с тем, что данна€ методика обеспечивает более четкое и контрастное окрашивание, способность реактива не окрашивать слизь в препаратах спермы, возможность использовать э€кул€т без отмывки дл€ приготовлени€ мазков .

¬џ¬ќƒџ

1. ¬ли€ние процесса центрифугировани€ на э€кул€т человека уменьшает процент морфологически нормальных сперматозоидов .

2. ѕри дифференциальном подсчете было показано, что процент нормальных сперматозоидов в окрашенных препаратах Spermac stain и гематоксилином ћайера имеют не большие расхождени€, но максимальные значени€ принадлежали окраске √ематоксилином ћайера .

3.  ачественное окрашивание √ематоксилином ћайера по сравнению с другими гистологическими красител€ми облегчило идентификацию морфометрических критериев сперматозоида и оценку их особенностей при микроскопии .

—ѕ»—ќ  »—ѕќЋ№«ќ¬јЌЌџ’ »—“ќ„Ќ» ќ¬

1. Ѕрагина ≈.≈. –уководство по сперматологии [“екст]/ Ѕрагина ≈.≈.јбдумаликов –.ј. ћосква - 2002 .

2. ƒолгов ¬. ¬. Ћабораторна€ диагностика мужского бесплоди€ [“екст]//  афедра  ƒЋ ћосква 2006 .

3. ƒыгало Ќ.Ќ. ѕриобретение стероидами гормональных функций в эволюции и их эффекты в раннем онтогенезе [“екст]// ”спехи современной биологии. 1993. ≈.113. вып 2. с. 162-175. 19-29 .

4.  улаков ¬. ». √инекологи€ [“екст]/  улаков ¬. ». ћанухин ». Ѕ., —авельева √. ћ // Ќациональное руководство. ћ.: √Ёќ“ј–-ћедиа, 2007 .

—. 890Ц897 .

5. ћихайличенко ¬.¬. ‘изиологи€ мужских половых органов. [“екст] // Ћенинград. ћедицина.1990 .

6. –адзинский ¬.≈. Ѕесплодие и экстракорпоральное оплодотворение в свете контраверсии [“екст]//јкушерство и гинекологи€. 2006.-є 1.- — .

60-62

7. –уководство ¬ќ« по исследованию и обработке э€кул€та человека [“екст]// ѕ€тое издание. ћосква-2012 .

8. –уководство ¬ќ« по лабораторному исследованию э€кул€та человека и взаимодействи€ сперматозоидов с цервикальной слизью [“екст]//„етвертое издание Ц ћосква 2001

9. Abraham-Peskir J. Response of midpiece vesicles on human sperm to osmotic stress [Text]// Human Reproduction, 17:375-382.2002 .

10. Alvarez C. Biological variation of seminal parameters in healthy subjects [Text]// Human Reproduction, 2003;18:2082-2088 .

11. Austin & Short. Germ cells and Fertilition [Text]//Camdridge University Press, Cambridge,UK (1972) .

12. Baker H. Spontaneous improvement in semen quality: regression towards the mean [Text]// International Journal of Andrology, 1985; 8:421-426 .

13. Ballve A. The molecular biology of mammalian spermatogenesis [Text]// Oxford Rewiews of reproductive Biology. 1979. Oxf. Univ. Press. London 159-261

14. Berman N. Methodological issues in the analysis of human sperm concentration data [Text]// Journal of Andrology, 1996; 17:68-73 .

15. Bjо®rndahl L. Sequence of ejaculation affects the spermatozoon as a carrier and its message [Text]/Bjо®rndahl L, Kvist U. // Reproductive Biomedicine Online, 2003; 7:440-448 .

16. Bowen R. On the acrosome of the animal sperm [Text] // Anat. Rec. 1924; 28:

1-13 .

17. Burgos N. Fine structure of the testis and its functional significance [Text] / Burgos N., Vitale-Calpe R., Aoki A. In: Johnon A., Gomes W., Vandemark N .

(eds). // The testis.1970. N.Y., Acad Press. p.551-649 .

18. Carlsen E. Effects of ejaculatory frequency and season on variations in semen quality [Text] /Carlsen E, Petersen JH, Andersson AM.// Fertil Steril. 2004;

82:358Ц66 .

19. Carlsen E. Effects of ejaculatory frequency and season on variations in semen quality [Text]// Fertility and Sterility,2004; 82:358-366 .

20. Clermont Y. Glycoprotein synthesis in the Golgi apparatus of spermatids during spermiogenesis of the rat [Text] / Clermont Y., Tang X. // Anat. Rec .

1985;213: 33-4

21. Clermont Y. Kinetics of spermatogenesis in mammals: seminiferous

epithelium cycle and spermatogonial renewal [Text] // Physiol. Rev.1972: 52:

198-236

22. Cooper T. Changes in osmolality during liquefaction of human semen [Text]// International Journal of Andrology, 2005 28:58-60 .

23. Cooper T. Changes in osmolality during liquefaction of human semen [Text]// International Journal of Andrology, 28:58-60.2005 .

24. Cooper T. Effects of multiple ejaculations after extended periods of sexual abstinence on total, motile and normal sperm numbers, as well as accessory gland secretions, from healthy normal and oligozoospermic men [Text]// Human Reproduction, 1993; 8:1251-1258 .

25. Correa-Perez J. Clinical management of men producing ejaculates characterized by high levels of dead sperm and altered seminal plasma factors consistent with epididymal necrospermia [Text]// Fertility and Sterility, 2004;

81:1148-1150 .

26. Dadoune J. Correlation between defects in chromatin condensation of human spermatozoa stained by aniline blue and semen characteristics [Text]// Andrologia, 20:211-217.1988 .

27. Devillard F. Polyploidy in large-headed sperm: FISH study of three cases [Text]// Human Reproduction, 17:1292-1298.2002 .

28. Eggert-Kruse W. Sperm morphology assessment using strict criteria and male fertility under in-vivo conditions of conception [Text]// Human Reproduction, 11:139-146.1996 .

29. Fawcett D. The fine structure and development of the neck region of the mammalian spermatozoon [Text]/Fawcett D.W., Phillips D. // Anat. Rec 1969;

165: 153-184 .

30. Fawcett D. The mammalian spermatozoon [Text] // Dev.Biol. 1975: 44: 394Fawcett D. Ultrastructure and function of the Sertoli cell [Text] /In: Fawcett D.W. Hamilton D.W., Greep R.O.(eds.). // Handbook of Physiology. saction 7, Endocrinology, v.5, Male Reproductive System, ed. 1975: Baltimore. p.21-55 .

32. Fetic S. Relationship of cytoplasmic droplets to motility, migration in mucus, and volume regulation of human spermatozoa [Text]// Journal of Andrology, 27:294-301.2006 .

33. Fredricsson B. Morphology of postcoital spermatozoa in the cervical secretion and its clinical significance [Text]// Fertility and Sterility, 28:841-845.1997 .

34. Gandini L. Study of apoptotic DNA fragmentation in human spermatozoa [Text]// Human Reproduction, 15:830-839.2000 .

35. Gary W. Gill Enviro-Pap: An Environmentally Friendly, Economical, and Effective Pap Stain – [Text]// 106 LABMEDICINE Number 2, February 2006 .

36. Gibbons I. Cilia and flagella of eukariotes [Text]// J Cell Biol 1981; 91: 107Gill G. Cytopreparation Principles & Practice [Text]// стр. 150-151, Springer ISBN: 978-1461449324 c.144, 154-157 .

38. Glover T. Male fertility and infertility [Text] / GloverTD, Barrat CLR// Camdridge University Press, Cambridge,UK (1999) .

39. Golan R. Changes in chromalin condensation of human spermatozoa during epididymal transit as determined by flow cytometry [Text]/Golan R., Cooper T., Oschry Y., Oberpenning F., Schulze H., Shochat L., Lewin L.// Hum.Reprod. 1996; 11: 1457-1462 .

40. Grenn G. Synthesis and processing of mammalian protamines and transition priteins [Text]/Grenn G., Ballhorn R., Poccia D., Hecht N. // Mol. Reprod .

Dev. 1994; 37: 225-263 .

41. Heller C. Human spermatogenesis: an estimate of duration of each cell

association and each cell tupe [Text] / Heller C., Heller G., Rowley M. // In:

Gual C.(ed) Progess in endocrinology. Expcerpta Medica Foundation .

Amsterdam. Int. Congress Series.1969; 184: 1012-1018 .

42. Holstein A. Morphologische stadien an abnormen spermatiden and spermatozoen des Menschen [Text]// Virchows Arch. A 1975; 93-107

43. Holstein A. Ultrastructural observation on the differentiation of spermatids in man [Text] // Andrologia 1976; 8: 157-163 .

44. Holstein A. Ultrastructural observations on the differentiation of spermatids in man [Text]// Andrologia 1976; 8: 157-163 .

45. Hudson B. Sperm pathology [Text]/Hudson B., Baker H., de Kretser D. // In the book.: infertile marriages. Pepperell R. Hudson B. Wood C. (eds.). 1986 .

Moscow. Medicine. 99-153 .

46. Johnson L. Effect of daily spermatozoan production but not age on transit time of spermatozoa through the human epididymis [Text] / Johnson L., Varner D. // Biol. Reprod. 1988; 39: 812-817 .

47. Jonge C. Influence of the abstinence period on human sperm quality [Text]// Fertility and Sterility,2004; 82:57-65 .

48. Jouannet P. Male factors and the likelihood of pregnancy in infertile couples .

I. Study of sperm characteristics [Text]/Jouannet, P., Ducot, B., Feneux, D .

and Spira, A. // Int. J. Androl., 11, 379-394.1988 .

49. Jouannet P. Male factors and the likelihood of pregnancy in infertile couples .

I. Study of sperm characteristics [Text]// International Journal of Andrology, 11:379-394.1988 .

50. Keel B. Within- and between-subject variation in semen parameters in infertile men and normal semen donors [Text]// Fertility and Sterility,2006;85:128-134 .

51. Kirchhoff C. A major human epididymis specific c DNA encodes a protein with sequence homology to extracellular proteinase inhibitor [Text]/Kirchhoff C., Habben I., Ivell R., Krull N. // Biol. Reprod. 1991; 45: 350-357 .

52. Kretser D. Anatomical and functional aspects of the male reproductive organs [Text]/de Kretser DM, Temple-Smith PD, Kerr JB. In Bandhauer K, Frick J (eds). // Handbook of Urology, Vol римскими цифрами 16, Disturbances in Male Fertility. Springer-Verfag, Berlin,pp-1-131,1982 .

53. Kretser D. Ultrastructural features of human spermiogenesis [Text]// Z .

Zelforsch. 1969; 98: 477-505

54. Kretser. The cytology of the testis. In: The physiology of reproduction [Text] / De Kretser., Kerr J. Knobil E., NeillJ et al.(eds). //Raven Press, Ltd New York 1988: 837-932

55. Kruger T. Sperm morphologic features as a prognostic factor in in vitro fertilization [Text]/Kruger TF, Menkveld R, Stander FSH,//Fertil Steril.1986;46:1118Ц23 .

56. Larsen L. Computer-assisted semen analysis parameters as predictors for fertility of men from the general population [Text]/Larsen, L., Scheike, T., Jensen, T.K., Bonde, J.P., Ernst, E., Hjollund, N.H., Zhou,Y., Skakkebaek, N.E., Giwercman, A. and The Danish First Pregnancy Planner Study Team // Hum. Reprod., 15, 1562-1567.2000

57. Lee J. Analysis of chromosome constitution of human spermatozoa with normal and aberrant head morphologies after injection into mouse oocytes [Text]// Human Reproduction, 11:1942-1946.1996 .

58. Lillie R. Histopathologic Technic and Practical Histochemistry,3rd edition [Text]// McGraw-Hill Book Co., New York 1965; 52: 350-369 .

59. Liu D. Low proportions of sperm can bind to the zona pellucida of human oocytes [Text]// Human Reproduction, 18:2382-2389.2003 .

60. Liu D. Morphology of spermatozoa bound to the zona pellucida of human oocytes that failed to fertilize in vitro [Text]// Journal of Reproduction and Fertility, 94:71-84.1992 .

61. Martin R. A comparison of the frequency of sperm chromosome abnormalities in men with mild, moderate, and severe oligozoospermia [Text]// Biology of Reproduction, 69:535-539.2003 .

62. Menkveld R. Semen parameters, including WHO and strict criteria morphology, in a fertile and subfertile population: an effort towards standardization of in-vivo thresholds [Text]// Human Reproduction, 16:1165Menkveld R. Sperm selection capacity of the human zona pellucida [Text]// Molecular Reproduction and Development, 1991; 30:346-352 .

64. Menkveld R. Sperm selection capacity of the human zona pellucida [Text]// Molecular Reproduction and Development, 30:346-352.1991 .

65. Menkveld R. The evaluation of morphological characteristics of human spermatozoa according to stricter criteria. Human Reproduction, 5:586Millette C. Reproductive physiology of the male [Text]// In: Seibel M.M. (ed) .

Infertility. A comprehensive text. 1990. Appleton & Lange, Norwalk, Conneticut. 129-147 .

67. Monesi V. Chromosome activities during meiosis and spermiogenesis [Text]// J. Reprod. Fertil. 1971; 13: 1-13

68. Mooney J. Motility of spermatozoa in human epididymis [Text] / Mooney J., Horan A., Latimer J. // J. Urol. 1972; 108: 443-445 .

69. Moore H. The epididymis [Text] // In: Chisholm G., Fair W. (eds). Scientific foundation in Urology. 1990. Heinemann Medical. Oxford. 399-410 .

70. Moore H. The influence of the epididymis on human and animal sperm maturation and storage [Text] // Hum.Reprod. 1996; Natl. Suppl., 11:103-110 .

71. Mortimer D. Sperm morphology assessment Ч historical perspectives and current opinions [Text]// Journal of Andrology, 22:192-205. 2001 .

72. Nagano T. The crystalloid of Lubarsch in the human spermatogonium [Text] // Z.Zellforsch.1969: 97: 491-504 .

73. Papanicolaou G. A new procedure for staining vaginal smears [Text]// Science. 1942;95:438Ц9 .

74. Papanicolaou G. Traut 1 IE. Diagnosis of uterine cancer by the vagina smear [Text]// Commonwealth Fund. New York. 1943 .

75. Pelfrey R. Abnormalities of sperm morphology in cases of persistent infertility after vasectomy reversal [Text]// Fertility and Sterility, 38:112Poland M. Variation of semen measures within normal men [Text]// Fertility and Sterility, 1985; 44:396-400 .

77. Pound N. Duration of sexual arousal predicts semen parameters for masturbatory ejaculates [Text]// Physiology and Behavior, 2002; 76:685-689 .

78. Robaire B/ Handbook of Andrology [Text]//The American Society of Andrology Allen Press Inc, San Francisco,USA (1998) .

79. Rowley M. The ultrastructure of four types of human spermatogonia [Text] / Rowley M.,Berlin J.,Heller C. // Anat.1971.112: 139-146 .

80. Saowaros D. The formation of disulfide bonds in human protamines during sperm maturation [Text]/Saowaros D., Raniaym F.//Experientia 1979; 35: 131Schultz-Larsen J. The morphology of human sperm [Text]// Microbiol.Scand .

1985;suppl.128: 1-121 .

82. Sobrero A. The immediate postcoital test [Text]// Fertility andSterility, 1962;

13: 184-189 .

83. Turkington R. Gene activation during spermatogenes [Text]/ Turkington R,Majumder G. //J. Cell Physiol. 1975, 85: 495-508 .

84. Tyler J. Studies of human seminal parameters with frequent ejaculation II .

Spermatozoal vitality and storage [Text]// Clinical Reproduction and Fertility,1982; 1:287-293 .

85. Weiske W. Minimal invasive Vasektomie mittels Fulgurationstechnik .

Erfahrungen bei 1000 Patienten in 12 Jahren [Text]// Urologe, 1994. B34:448Willison K. Mammalian spermatogenesic gene expression [Text] / Willison K., Ashworth A. //Trends Genet. 1987; 3: 351-355 .

87. Yanagimachi R. Mammalian fertilization. The Physiology of reproduction [Text]// 1994; 2nd edn. Raven Press. 189-317

88. Yasazume G. Spermatogenesis in animals as revealed by electron microscopy [Text] // J.Biophys. Biochem. Cytol. 1956; 2: 445-449 .

89. Zavos P. Clinical improvements of specific seminal deficiencies via intercourse with a seminal collection device versu masturbation [Text]/Zavos PM, Goodpasture JC// Fertility and Sterility, 1989; 51:190-193 .

90. Zegers-Hochschild. ICMART and WHO [Text]/F. Zegers-Hochschild, G. D .

Adamson, J. de Mouzon, O. Ishihara, R. Mansour, K. Nygren, //(—тать€ в журнале "Fertility and Sterility", выпуск 92, номер 5, но€брь 2009) .

91. Zinaman, M. Semen quality and human fertility: a prospective study with healthy couples [Text]/Zinaman, M.J., Brown, C.C., Selevan, S.G. and Clegg, E.D.// J. Androl., 21, 145-153. 2000 .






ѕохожие работы:

Ђ¬≈—“Ќ»  ё√ќ–— ќ√ќ √ќ—”ƒј–—“¬≈ЌЌќ√ќ ”Ќ»¬≈–—»“≈“ј 2016 г. ¬ыпуск 1 (40). —. 204Ц208 ”ƒ  796.015 ћќ–‘ќ‘”Ќ ÷»ќЌјЋ№Ќџ≈ ќ—ќЅ≈ЌЌќ—“» јƒјѕ“ј÷»» ∆≈Ќ— ќ√ќ ќ–√јЌ»«ћј   ‘»«»„≈— »ћ Ќј√–”« јћ ј. —. ’орькова ѕериод юношества Ц врем€ бурного расцвета физических и интеллектуальных способностей челове...ї

Ђ√ќ—”ƒј–—“¬≈ЌЌџ… —“јЌƒј–“ —ќё«ј ——– —ѕ≈–ћј Ѕџ ќ¬ «јћќ–ќ∆≈ЌЌјя ћ≈“ќƒџ Ѕ»ќЋќ√»„≈— »’ »——Ћ≈ƒќ¬јЌ»… √ќ—“ 2 7 7 7 7 -8 8 (—“ —Ё¬ 5 9 6 1 -8 7 ) »здание официальное S' ÷ена 3 коп . √ќ—”ƒј–—“¬≈ЌЌџ…  ќћ»“≈“ ———– ѕќ —“јЌƒј–“јћ ћосква льн€ные скатерти ”ƒ  619:611-013.11.001.4:006.354 √руппа –39 —ќё«ј ——– государственный стандарт —ѕ≈–...ї

Ђ–ќ——»…— јя ј јƒ≈ћ»я Ќј”  ћ»Ќ»—“≈–—“¬ќ ќЅ–ј«ќ¬јЌ»я » Ќј” » –ќ——»» ћ»Ќ»—“≈–—“¬ќ «ƒ–ј¬ќќ’–јЌ≈Ќ»я » —ќ÷»јЋ№Ќќ√ќ –ј«¬»“»я –ќ——»» ћеждународна€ академи€ наук экологии, безопасности человека и природы  убанска€ государственна€ медицинска€ акад...ї

Ђ. ј јƒ≈ћ»я Ќј”  ———– »Ќ—“»“”“ ‘»«»ќЋќ√»» им. акад. ». ѕ. ѕ ј ¬ Ћ ќ ¬ ј (директор акад.  . ћ. Ѕыков) ¬. ј.  ќ∆≈¬Ќ» ќ¬ Ёлектроэнцефалографическое изучение образовани€ временных св€зей на звуковые раздражени€ у человека Т (»з »нститута высшей нервной де€тельности јЌ ———– ^ директор член-корр. јЌ ———– Ё. ј...ї

Ђ√–”Ќ“ќ¬≈ƒ≈Ќ»≈ Ѕ»ќ“≈’ЌќЋќ√»» ¬ »Ќ∆≈Ќ≈–Ќќ… √≈ќЋќ√»» BIOTECHNOLOGIES IN ENGINEERING GEOLOGY MAKSIMOVICH N.G. ћј —»ћќ¬»„ Ќ.√. Head of the Laboratory of Technogenic Processes Geology and deputy «аведующи...ї

Ђ”“¬≈–∆ƒ≈Ќќ ѕриказ ћинистра образовани€ –еспублики Ѕеларусь от 01.11.2017 є 677 ѕрограмма вступительных испытаний по учебному предмету "Ѕиологи€" дл€ лиц, имеющих общее среднее образование, дл€ получени€ высшего образовани€ I ступени или среднего специального образовани€, 2018 год “–≈Ѕќ¬јЌ»я   ѕќƒ√ќ“ќ¬ ≈ јЅ»“”...ї

Ђ”ƒ  615.32 ћќ–‘ќЋќ√ќ-јЌј“ќћ»„≈— ќ≈ »——Ћ≈ƒќ¬јЌ»≈ ѕЋќƒќ¬ ЋјЅј«Ќ» ј Ў≈—“»Ћ≈ѕ≈—“Ќќ√ќ (FILIPENDULA HEXAPETALA GILIB.) —азанова  .Ќ., Ўарипова —.’., –ыжов ¬.ћ.,  уркин ¬.ј., “арасенко Ћ.¬. √Ѕќ” ¬ѕќ "—амарский государственный медицинский университет" ћинистерства з...ї

Ђ—»«ќЌ≈Ўќ ќЋ№√ј ё–№≈¬Ќј – √ Ѕ ќƒ с № Ў 2JQ0 —–ј¬Ќ»“≈Ћ№Ќќ-јЌј“ќћ»„≈— ќ≈ »——Ћ≈ƒќ¬јЌ»≈ ¬“ќ–»„Ќќ…  —»Ћ≈ћџ  ”—“ј–Ќ» ќ¬ »  ”—“ј–Ќ»„ ќ¬ ј– “»„≈— ќ… ‘Ћќ–џ –ќ——»» 03.00,05-Ѕќ“јЌ» ј ј¬“ќ–≈‘≈–ј“ диссертахщи на соискание ученой степени кандидата биологических наук —јЌ “-ѕ≈“≈–Ѕ”–√ –абота вьшолнена в отделе Ѕотанический музей Ѕотанического инстшута им. ¬....ї

Ђћќ„јЋќ¬ј ќльга†»наровна ѕ–»–ќƒЌќ-јЌ“–ќѕќ√≈ЌЌџ≈†ѕ–ќ÷≈——џ†»†—ќ¬–≈ћ≈ЌЌџ≈ ЋјЌƒЎј‘“џ†«ќЌџ†Ѕ–ј“— ќ√ќ†¬ќƒќ’–јЌ»Ћ»ўј 25.00.36†-†геоэкологи€ ј¬“ќ–≈‘≈–ј“ диссертации†на†соискание†ученой†степени кандидата†географических† наук ћосква†-†2005 –абота†выполнена†на†кафедре†физической†географии†мира†и†геоэкологии географического† факультета†ћосковск...ї

Ђ–айон/ ћуниципий MINISTERUL EDUCAIEI, ћесто жительства CULTURII I CERCETRII ”чебное заведение AL REPUBLICII MOLDOVA AGENIA NAIONAL ‘амили€, им€ ученика PENTRU CURRICULUM I EVALUARE Ѕ»ќЋќ√»я ѕ–≈ƒ¬ј–»“≈...ї

Ђ1087 Ѕ»ќЋќ√»„≈— »≈ Ќј” » ”ƒ  58 Ё ќЋќ√»„≈— јяјƒјѕ“»¬Ќќ—“№—ќ–“ќ¬‘ј—ќЋ» ¬«ј¬»—»ћќ—“»ќ“—–ќ ќ¬ѕќ—≈¬ј ¬”—Ћќ¬»я’ё√ќ-«јѕјƒј÷„–  оцареваЌ.¬. ‘√Ѕќ” ¬ќ "Ѕелгородский государственный аграрный университет им. ¬.я. √орина", Ѕелгород, e-mail: knv1510@mail.ru ѕроведено экологи...ї







 
2018 www.lit.i-docx.ru - ЂЅесплатна€ электронна€ библиотека - различные публикацииї

ћатериалы этого сайта размещены дл€ ознакомлени€, все права принадлежат их авторам.
≈сли ¬ы не согласны с тем, что ¬аш материал размещЄн на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.