«Арифулии Евгений Альбертович СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ НУКЛЕОПРОТАМИНОВОГО ХРОМАТИНА В СПЕРМАТОЗОИДАХ ЧЕЛОВЕКА ...»

На правах рукописи

Арифулии Евгений Альбертович

СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ НУКЛЕОПРОТАМИНОВОГО

ХРОМАТИНА В СПЕРМАТОЗОИДАХ ЧЕЛОВЕКА

03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

2 1''^

1 /Г:'

Москва-2012

Работа выполнена в отделе электронной микроскопии Научно-исследовательского института физико-химической биологии имени А. Н. Белозерского Московского государственного университета имени М. В. Ломоносова

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Поляков Владимир Юрьевич

Официальные оппоненты:

Коломиец Оксана Леонидовна доктор биологических наук, доцент .

Институт общей генетики имени Н. И. Вавилова, заведующая лабораторией Бураков Владимир Владиславович кандидат биологических наук, доцент М Г У имени М. В. Ломоносова, старший научный сотрудник

Ведущая организация:

Институт биоорганической химии имени академиков М. М. Шемякина и Ю. А .

Овчинникова РАН, Москва

Защита состоится «20» марта 2012 г. в 15 часов 30 минут на заседании диссертационного совета Д 501.001.52 при Московском государственном университете имени М. В. Ломоносова по адресу: 119899, Москва, Ленинские горы, д .

1, корп. 12, МГУ, Биологический факультет, ауд. М-1 .

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им. М. В. Ломоносова

Автореферат разослан « » февраля 2012 г .

Учёный секретарь диссертационного совета, ]) кандидат биологических наук Калистратова Елена Николаевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы, Известно, что геном эукариот имеет сложив иерархическую организацию. которая обсспечипастся специфическим взаимодействием ДНК с различными классами белков .

В соматических клетках «низший» уровень компактизации создается за счет взаимодействия ДНК с тстрамором гистонов (Н2А, Н2П, ИЗ и Н4). в результате формируются «элементарные» ДИП фибриллы, состоящие из дискретных пуклеопротеиновых частиц - нуклеосом (Derneret et al,, 2001). Другой представитель гистонов - белок HI комнактизуст «1лсмс1ггарные» пуклсосомныс фибриллы в ДИП фибриллы толщиной около 30 нм (Butler, 1984).

В ряде работ описаны более сложные уровни организации хроматина соматических клеток эукариот (Zatsepina et ai., 1983:

Prusov

–  –  –

В настоящее время в области изучения ремоделирования хроматина достигнут существенный прогресс, однако представления о макромолекулярной организации нуклеопротамииовых комплексов в хроматине сперматозоидов остаются во многом гипотетическими. По одной из гипотез фундаментальными структурными единицами нуклеопротаминового хроматина являются тороиды - кольцевые структуры толщиной около 20 нм, с внешним диаметром около 90 нм и внутренним диаметром около 15 нм (Ward, 1993; 2010). Основу тороидов составляют петлевые домены ДНК (средний размер около 46 кЬ). линкеры между индивидуальными тороидами ассоциированы с белками ядерного матрикса. Главный недостаток этой модели состоит в том. что формирование тороидальг{ЫХ структур наиболее убедительно продемонстрировано в системе ш vitro. Существование тороидоа в «нативном» или искусственно декомпактизованном хроматине сперматозоидов не документировано .

Кроме того, в некоторых работах показано, что нуклеопротаминовый хроматин имеет не тороидальную, а, скорее, иерархическую фибрилляр1Ю-гло6улярную организацию .

Имеются также данные о наличии в хроматине сперматозоидов крупных ДНКсодержащих сферических комплексов диаметром около 300 нм и 500 нм (Sobhon et al., 1982а; Worawiltayawong et al., 2008) .

Отсутствие хорошо обоснованной и общепринятой модели структурной организации нук-чеопротаминовых комплексов означает, что мп010численные данные но анализу молекулярных преобразований генома в ус;ювиях его ремоделирования трудно сопоставимы с представлениями о структурной реорганизации хроматина, сопровождающей этот процесс. Исследования в этой области чрезвычайно актуальны не только в теоретическом плане. В ряде работ показано, что нарушения в компактизации хроматина в сперматозоидах человека могут приводить к существенным нарушениям в нормальном развитии беременности, вплоть до ее преждевременного прерывания (Брагина и др., 2009) .

Цель исследования. Идентифицировать уровни структурной организации нуклеонротамниового хроматина в сперматозоидах человека .

Задачи исследования .

1. Детально изучить структурную организацию ремоделирующегося хроматина на основных этапах спермиогенеза;

2. Изучить нуклеопротаминовые комплексы, полученные в результате искусственной деконденсации хроматина зрелых сперматозоидов;

3. Исследовать динамику декомпактизации нуклеопрота.минового хроматина на модели гетерокарионов сперматозоид/соматическая клетка .

Научная новизна. Впервые на ультраструктурном уровне описана динамика ремоделирования хроматина в ядрах дифференцирующихся сперматозоидов человека как процесс поэтапного преобразования «элементарных» нуклеосомных ДИПфибрилл в фибриллярные нуклеопротаминовые структуры более высокого порядка организации .

Разработана и экспериментально обоснована модель гетерокарионов, полученных слиянием сперматозоидов с культивируемыми клетками .

Электронномикроскопический анализ сперматид на поздних стадиях дифференцировки и эксперименты по декомпактизации ядер зрелых сперматозоидов в гетерокарионах показали, что «элементарной» структурной единицей нуклеопротаминового хроматина являются фибриллы толщиной около 8 нм, которые на конечном этапе ремоделирования формируют фибриллярные «макрокомплексы»

толщиной 40-60 им - нуклеопротаминовые хромонемы .

Удаление из нуклеопротаминового хроматина части белков и разрыв дисульфидных связей позволило выявить элементы спиральной упаковки «элементарных» нуклеопротаминовых фибрилл в фибриллярных макрокомплексах (нуклеопротаминовых хромонемах). Этот факт косвенно свидетельствует о возможной кардинальной «переупаковке» хроматина на последних стадиях ремоделирования .

На основании полученных данных предложена динамическая модель организации нуклеопротаминового хроматина в сперматозоидах человека .

Ппактичсскос значение. Проблема целостности генома и структуры хроматина сперматозоидов имеет большое практическое значение для диагностики и лечения мужхкого бесплодия, повыигения эффективности методов вспомогательных репродуктивных техгюлогий (ВРТ) и предотвращения передачи генетических дефектов при их использовании, особенно при инъекции сперматозоида в яйцеклетку (ИКСИ) .

Апробация работы. Результаты работы представлены на Итоговой конференции по результатам выполнения мероприятий за 2009 год в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработка по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы», Москва; XVI Всероссийском симпозиуме «Структура и функции клеточного ядра», Санкт-Петербург; 10-ом Юбилейном российском научнообразовательном форуме в рамках одноименной 10-й Юбилейной международной медицинской выставки «Мужское здоровье и долголетие», Москва .

Основные результаты работы были доложены на семинарах отдела электронной микроскопии НИИ Ф Х Б им. Л. И. Белозерского М Г У и кафедры клеточной биологии и гистологии биологического факультета МГУ, П у б л и к а ц и и. По теме диссертации опубликована 3 печатные работа в журнале, рекомендованном ВАК .

Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 123 страницах, включает введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты исследования и их обсуждение, выводы и список цитируемой литературы, Материал диссертации содержит 29 рисунков и одну таблицу. В списке цитируемой литературы приведены 115 источников, из низ 3 п отечественных и 112 зарубежных .

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы Используемые сокращения DMEM (ДМЕМ) - Dulbecco's Modified Eagle's Medium; BSA (БСА) - Bovine serum albumin; PEG (ПЭГ) 1500 - polyethylene glycol с молекулярной массой 1500 Да;

D I T (ДГГ) - Dithiothreitol; FA (ФА) - formaldehyde; OA (ГА) - gkitiiraldehyde; PBS Phosphale biiliered saline; PBST - PBS с добавлением 0,05% Tween; SSC - salinesodium citrate; Tris (ТРИС) - tris(hydroxymethyl)aminomethane; BrdU (БрдУ) - 5-bromodeoxyuridine; EdU - 5-ethynyl-2'-deoxyuridine; FIJ - 5-Fluorouridine; DABCO Diazobicyclooctane; DAPl - 4';6-Diamidino-2-phenylindole .

Образцы эякулята человека Сусиензии сперматозоидов здоровых доноров предоставлены для исследования клиникой ЭКО АльтраВита, г. Москва. После забора образцы спермы подвергали очистке от не клеточных компонентой, соматических клеток и неподвижных сперматозоидов с использованием препарата PureCeption Sperm Separation Media (SAGE Media, США) no методике, рекомендованной производителем. Для экспериментов использовали криоконсервированные образцы эякулята, замороженные с использованием криопротектора SpermPreez (FertiProN. V., Бельгия) .

Биопсии семенников человека Материал биопсий предоставлен для электронно-микроскопического исследования ФГУ «Эндокринологический научный центр», г.Москва. Для экспериментов использовали теегикулярные биопсии пациентов с азооспермией (отсутствие сперматозоидов в эякуляте) .

Культура клеток Клетки линии VERO (эпителий почки африканской зелёной мартышки) культивировали во флаконах емкостью 50 мл на среде DMEM (ПанЭко, Россия) с добавлением 1% по объему смеси антибиотиков и антимикогиков (Sigma) и 10% эмбрионалыюй телячьей сыворотки (HyClone, США), в атмосфере с 5%-ным содержанием СО2 при температуре 37°С. Для проведения экспериментов клетки высаживали на квадратные 12x12 или круглые диаметром 24 мм покровные стёкла, а так же пластиковые чашки с адгезивным покрытием (Costar Coming, США) диаметром 3,5 см и культивировали до достижения необходимой плотности монослоя .

Получение клеточных гетерокарионов Для обеспечения проникновения сперматозоидов внутрь соматических клеток была модифицирована процедура, описанная в работе Elsevier, Ruddle, 1976 .

Предварительно, с гюмощью камеры Горяева, проводили оценку концентрации сперматозоидов в суспензии и процент подвижных клеток. В эксперименте использовали суспензию с концентрацией сперматозоидов 2-20 млн/^^л. Далее суспензию наслаивали на растущие на покровных стёклах клетки и осаждали сперматозоиды центрифугированием 10 минут при 1000g. Для удаления не осаждённых сперматозоидов клетки промывали в двух сменах PRS .

Слияние индуцировали, инкубируя клетки 1 минуту в 50%-ном р-рс PEG на PBS .

Отмывали PEG тремя сменами PBS и инкубировали клетки в среде культивирования при 37 ' С от 3 до 6 часов. Для удаления большей части не проникших сперматозоидов клетки отделяли от субстрата раствором Версспа (ПанЭко. Россия) и центрифугировали суспензию при 200g в течение 1 минуты. Осадок ресуспендировали в минималыюм объёме среды культивирования. Далее суспензию разбавляли средой культивирования в 4 - 100 раз и высаживали клетки в чашки Петри со стеклами для дальнейшего культивирования .

Фиксация препаратов для световой микроскопии .

Для выявления функционирующих митохондрии клетки до фиксации инкубировали 30 минут в срсдс культивирования содержаний 0,01 M MitoTrackcr Red (Molecular Probes, США) .

Клетки фиксировали при помощи 3,7%-ного р-ра РЛ (Sigma) на PBS 15 минут при 37'С, избыток фиксатора отмывали двумя сменами PBS по 5 минут .

Псрмеабилизировали клетки в 0,5%-ном р-рс Triton Х-100 на PBS 10 мин при комнатной температуре и отмывали тремя сменами PBS по 5 минут. Ядра клеток окрашивали р-ром DAPI (Sigma) на PBS в концентрации 0,1 мкг/мл в течение 10 минут и отмывали двумя сменами PBS по 5 минут. Препараты заключали в MOVIOL (Calbiochem) с добавлением DABCO (Sigma) в концентрации 50 мг/мл .

Функциональный анализ хроматина сперматозоидов в гетерокариотических системах Репликацию ДНК в клетках выявляли при помощи набора Click-iT EdU Alexa Fluor 555 (Invitrogen, США). Для одновременного мечения новосинтезированной ДНК и РНК клетки инкубировали в среде культивирования, содержащей 20 мкМ EdU и 100 мкМ FU, в течение 10 мин при 37°С. Затем препараты пермеабилизировали 0,005% Triton Х-100 на PBS в течение 5 мин при комнатной температуре и сразу фиксировали в 3.7% FA на PBS 10 мин, так же при комнатной температуре. После отмывки от фиксатора клетки инкубировали 30 минут в PBS с 1% BSA .

Реакцию выявление меченой ДНК проводили согласно протоколу производителя набора. Для последующего выявления меченой РНК клетки помещали в раствор антител против BrdU (Sigma, клон BU-33, разведение 1; 100) на PBST с добавлением 0,1% BSA, Клетки инкубировали в растворе антител 60 минут при комнатной температуре, а затем отмывали в трёх сменах PBST с 0,1% BSA по 5 мин)т каждая .

Далее препарат инкубировали 60 минут при температуре в растворе KOMnaTtro поликлональных антител против иммуноглобулинов мыши (Sigma, разведение 1;200 на PBST с 0,1% BSA), конъюгированных с флуорохромом Alexa 488. После повторения процедуры отмывки от антител, препараты дополнительно контрастировали DAP1 в течение 10 минут и заключали в M 0 V 1 0 L .

При выявлении ламинов использовали стандартную фиксацию для световой микроскопии. Далее клетки инкубировали 60 мин при комнатной температуре в расгворс антител против ламинов А, С (клон Jol 2, Hutchison, разведение 1;20 на PBST с 0,1% BSA). Дальнейшая процедура окраски вторыми антителами и последующей обработки препарата ана/югична описанной выше .

Детектирование разрывов ДНК в хроматине сперматоюидов Для выявления разрывов ДНК в хроматине сперматозоидов использовали набор DeadEnd Fluorimetric TUNEL system (Promega). Согласно протоколу производителя клетки фиксировали 3,7% FA на PBS 20 минут при +4 'С, отмывали от фиксатора двумя сменами PBS по 5 минут и пермеабилизировали в 0,2% Triton Х-100 на PBS 5 минут. Далее клетки тщательно отмывали в трёх сменах PBS по 5 минут и проводили реакцию мечения разрывов ДНК в течение часа при 37'С. Для ингибирования реакции мечения клетки инкубировали в 2xSSC 20 минут. После трёхкратной отмывки в PBS по 5 минут препараты окрашивали DAP1 и заключали в M 0 V 1 0 L по стандартной методике .

Искусственная деконденсация хроматина сперматозоидов Суспензию сперматозоидов наносили на стекла, покрытые полилизином и осаждали центрифугированием 10 минут при lOOg. После осаждения пермеабилизировали мембраны клеток 0,5% раствором Triton Х-ЮО на 50 мМ ТРИСНС! (рН 7,6) 5 минут. Далее препараты промывали 50 мМ ТРИС-НС1 и либо фиксировали, либо обрабатывали деконденсирующим раствором, содержащим 0,05 мг/мл гепарина и 5 мМ DTT в течение 10-25 минут. Отмывку от деконденсирующего раствора и фиксацию проводили на 50 мМ ТРИС. Для световой микроскопии препараты фиксировали 3,7% FA 15 минут, а для электронной - 2,5% OA в течение 2 часов .

Препараты для свето-микросконического исследования окрашивали DAP1 и заключали в M 0 V 1 0 L, а для электронно-микроскопического - обрабатывали по стандартной методике заключения в эпоксидную смолу и приготовления ультратонких срезов .

Изучение препаратов и регистрация результатов Полученные препараты изучали и фотографировали в оптическом микроскопе Саг! Zeiss Axiovert 200М, оборудованном объективом Plan-Neoluar ЮОх с числовой апертурой 1,3 и цифровой камерой Hamamatsu Orca-ll ER-2 (размер пиксела 6,45x6,45 мкм), управляемом программным комплексом AxioVision v4.3 .

Полученные изображения обрабатывали в программах ImageJ vi.44p и Adobe Photoshop v7.0 LE (Adobe Inc. США). Трехмерную деконволюцию серий оптических срезов осуществляли по алгоритму Constrained Iterative Filter с помощью соответствующего модуля из комплекта поставки демонстрационной версии программы AxioVision v3.1 (Carl Zeiss, Германия) .

Электронно-микроскопические исследования Для электропно-микроскопического исследования клетки фиксировали 2.5% рром GA на буфере Зеренсена или какодилатном буфере (в случае биопсий) в течение минимум 60 минут (минимум сутки для биопсий). Далее клетки заключали п Эпом согласно процедуре, включающей обезвоживание в серии спиртов повышающейся концентрации, обезвоживание ацетоном, пропитку в трех сменах смеси зпон-ацетон с повышающейся долей Эпона. Полимеризацию проводили при 60°С в течение минимум 48 часов .

Ультратонкие срезы толншной 60-100 им получали на ультрамикротоме Reichert

•Fung Ultracut Е с использованием стеклянных ножей. Материал на срезах контрастировали водным 1% р-ром ацетата урана 30 минут и реактивом Рсйнольдса 10 минут .

Изучение и обработка электронно-микроскопических данных Изучали и фотографировали полученные препараты на электро(Н1ых микроскопах Hitachi HU-11B, Ни-12П и 700Н (Япония). Для дальнсйитей обработки негативы сканировали в монохромном режиме с разрешением 1200 точек на дюйм (472 точки на сантиметр) и глубиной представления цвета 16 бит. Сканирование осуществляли с помощью слайд-сканнера (Epson Perfection 4990 PHOTO) .

Сканированные изображения обрабатывали и монтировали в программе Adobe Photoshop v7.0 .

Точное увеличение микроскопов определяли с помощью препарата частиц латекса диаметром 262 нм .

Результаты исследования и их обсуждение .

1. Динамнка структурных преобразований хроматина в дифференцирующихся сперматидах Для изучения динамики ремоделирования хроматина были исследованы образцы спермы инфертильных доноров, в эякуляте которых присутствовали сперматиды на различных стадиях дифференцировкн и материал тестикулярных биопсий, взятый у доноров с азооспермией (отсутствие сперматозоидов в эякуляте). В связи с тем, чго электронномикроскопический анализ показал, практически, полную идентичность в организации сперматид, полученных двумя использованными подходами, в этом разделе излагаются данные только по анализу биопсийного материала .

Первая стадия спермиогенеза В качестве «репера» для идентификации стадий спермиогенеза использовали акросомный комплекс. Стадию определяли по протяженности акросомы и по ее структуре. На первой стадии спермиогенеза хроматин сперматид имеет рыхлую фибриллярную структуру с редкими вкраплениями конденсированного материала (Рис. 1а). Наиболее часто встречаются фибриллы толщиной около 15 нм, переходящие в оди1ючные или сблоченые гранулы диаметром до 25 нм. Кроме того, в ядре присутствуют многочисленные фибриллы толщиной около 8 нм, как лежащие отдельно, так и соединенные с гранулами или более толстыми фибриллами. Ещё одним характерным элементом для ядер ранних сперматид являются крупные плотные глобулы диаметром 30-35 нм, располагающиеся, преимущественно, на периферии ядер. Вокруг таких глобул, как правило, имеется область рыхлого материала .

Вторая стадия спермиогепеза На второй стадии созревания ядро сперматиды уменьшается в размере и приобретает вытянутую форму. Как и на предыдущей стадии, в ядре присутствуют фибриллы Г0ЛЩИ1ЮЙ 8 и 15 им, однако их сгановится существенно меньше (Рис. 16) .

В то же время, возрастаег количество 1-ра11ул диаметром 20-25 нм, кочорыс часто формируют с.ходные по толщине короткие толстые фибриллы. Сохраняются зоны пониженной плотности хроматина, в которых преобладают тонкие фибриллы. Как и на предыдущей стадии, хотя и в меньшем количестве, в ядре присутствуют крупные плотные одиночные пюбулы, окружённые областью рыхлого материала. Д и а м е ф таких глобул составляет 45-50 нм, что примерно в полтора раза больше, чем диаметр сходных по структуре глобул в более ранних сперматидах .

Третья стадия спермиогенеза По мере созревания хроматин сперматид становится визуально более плотным, однако до третьей стадии спермиогенеза вкгпочительно это, тю-видимому, не приводит к появлению структур более высокого порядка. Если на первой стадии спермиогенеза в ядре преобладали тонкие фибриллы толщиной 8 и 15 нм, то к третьей стадии их почти не остаётся (Рис, 1в). Ооювным структурным мотивом здесь являются фибриллы и глобулы Т0ЛЩИ1ЮЙ 25 нм. Наиболее плотные участки хроматина сходны по структуре с агрегатами глобул, выявляемыми на предыдущей стадии. На третьей стадии созревания, в ядре всё ещё сохраняются участки низкой плотности хроматина, где преобладают тонкие фибриллы. Количество крупных глобул диаметром 40-50 нм, на этой стадии значительно меньше, чем на предыдущих .

Четвёртая/пятая стадия спермиогенеза В рамках данного исследования не бьшо произведено чёткого деления на четвёртую и пятую стадии спермиогенеза, так как характер упаковки хроматина на этих двух стадиях не имеет принципиальных отличий .

Хроматин спсрматид на этом этапе созревания кардиналыю отличается от хроматина более ранних сперматид тем. что имеет четко выражс1Н1ую глобулярную структуру (Рис. 1г). От глобул диаметром 50-60 нм радиально расходятся тонкие, около 8 нм толщиной, фибриллы, заполняющие всё пространство между глобулами .

Материал внзтри глобул имеет гетерогенную плотность и в ряде слу'^шев можно идентифицировать тонкие фибриллы толщиной 8 нм. На пятой стадии созревания в ядре сохраняются области низкой плотности хроматина, где толщина структурных элементов меньше, чем в остальном ядре .

Шестая стадия спермиогеиеза При переходе от пятой стадии спермиогенеза к шестой ядра сперматид приобретают фибриллярно-глобулярную структуру. Хроматин сперматид на последней изучешюй в работе стадии спермиогенеза имеет плотную структуру (Рис .

1д), близкую к структуре хроматина зрелых сперматозоидов (Рис. 2а). Основным отличием являются тонкие протяжённые области рыхлого материала между конденсированными блоками хроматина. Главным структурным мотивом в ядрах поздних сперматид являются фибриллярные макрокомплексы толщиной около 40 нм, а так же более крупные глобулы диаметром около 60 нм. Пространство между крупными хроматиновыми блоками заполнено тонкими фибриллами толщиной около 8 нм. Как и на предыдущих стадиях в ядре сперматиды имеется область с низкой плотностью материала, сходная по размеру с вакуолями в зрелых сперматозоидах .

В целом, полученные данные позволяют описать ремоделирова1Гие хроматина в ядрах формирующихся сперматозоидов как процесс последовательного замеще1шя «элементарных» нуклеосомных ДНП-фибрилл на фибриллярные нуклеопротаминовые структуры более высокого порядка организации .

–  –  –

Деконденсация хроматина в буфере, не содержащем двухвалентных катионов В качестве среды для искусствопюй декомпактизации хроматина использовали буфер 50 мМ Tris-lICl, не содержащий двухвалентных катионов .

Для ультраструктурного анализа контрольные образцы фиксировали по стандарт1ЮЙ методике, принятой в электронной микроскопии: 2.5% глyтapoвы^^ альдегидом на каколилатном буфере. В этих условиях фиксации хроматин сперматозоидов выглядит, как плотная гомоген}1ая структура, в которой не удаётся визуализировать дискретных элементов (Рис. 2а). В то же время, после фиксации предварительно пермеабилизированных сперматозоидов в декондснсируюшем буфере, хроматин приобретает четко выраженное фибриллярное строение (Рис. 26) .

Деконденсация хроматина, в целом, происходит равномерно по всему объёму головки сперматозоида, хотя в местах наибольшей плотности встречаются крупные хроматиновые блоки различного размера. Основным структурным мотивом в этих условиях являются гетерогенные по толщине (20 - 40 нм) фибриллы и глобулы диаметром около 60 нм. Таким образом, можно допустить, что удаление двухвалентных катионов из хроматина сперматозоидов приводит к частич1юй «реконструкции» нуклеопротаминовой фибриллы, которая характерна для конечных стадий спермиогенеза .

Декоиденсация хроматина под действием гепарина и дитиотрейтала В ранних и современных работах для декомпактизации нуклеопротаминового хроматина различные деконденсирующие агенты добавлялись либо к нермеабилизированным, либо к нативным сперматозоидам (8оЬЬоп е! а1., 1981;

8оЫ1оп е1 а1., 1982а; ЗоЬЬоп е! а1., 19826; Нис1 е! а1., 1993; А11еп е1 а1., 1993) .

Полученные результаты крайне противоречивы, что, по-видимому, связано с неконтролируемым восстановлением дисульфидных групп и неспецифическим удалением белков из объема ядер. В связи с тем, что в буфере, не содержащем двухвалентных катионов, наблюдается частичная «реконструкция»

нуклеопротаминовых фибрилл, задача этой части работы - определить характер упаковки ДНК именно на этом уровне компактизации. Таким образом, в качестве исходного субстрата для воздействия деконденсирующих агентов и последующего микроскопического анализа были использованы пермеабилизированные в 50 мМ ТпзНС1 сперматозоиды .

Полученные данные показали, что после обработки таких сперматозоидов раствором, содержащим 0,05 мг/мл гепарина и 5 мМ дитиотрейтола, на препаратах выявляются сперматозоиды, демонстрирующие два типа реакции на деконденсирующее воздействие .

В первом случае происходит значительное набухание ядер сперматозоидов, при этом градиент интенсивности флуоресценции после окрашивания ОДР! сохраняется .

На светооптическом уровне в хроматине таких сперматозоидов какие-либо структурные ^ютивы не выявляются .

В то же время, по данным электронномикроскопического анализа, обработка гепарином и дитиотрейтолом приводит к значительным изменениям в организации исходных 40 нм фибрилл; их максимальная и минимальная толщина уменьшается, преимущественно находясь в интервале от 10 до 30 нм (Рис. 2в). В целом, плотность хроматина увеличивается от периферии к центральной области ядер, где сохраняются крупные блоки конденсированного материала .

Во втором случае наблюдается экструзия хроматина из ядер, что, по-видимому, связано с прогрессирующей деструкцией ядерной oбoJЮЧKи и/или с нарушениями акросомалыюго комплекса, возиикшощими в ходе пермеабилизации клеток. В пользу этого говорит тот факт, что при увеличении времени воздействия до 25 минут количество сперматозоидов с частично разруше|и1ыми ядрами увеличивается, однако их внешний вид остаётся прежним .

Электронно-микроскопический анализ показал, что структура экструзированного хроматина различается в разных зонах ядер. В их базальной области декомпактизованный хроматин представлен как тонкими фибриллами толщиной 7-8 нм, так и более крупными фибриллярными комплексами переменной толщины, в ряде случаев, формирующими подобие спиралей. По мере удаления от бщальной части ядра плотность хроматина нарастает. 'Гем не менее, за исключением зон с максимальной плотностью хроматина, в нём выявляются глобулы диаметром около 50 им. В зоне экструзии плотный хроматин резко переходит в рыхлую сеть фибрилл и бJЮKoв различного размера .

Рис. 2 Искусапвениая деконденсация хро.матина сперматозоидов (верхний ряд -увеличение.\10000, иижний ряд -хЗОООО) .

а - контроль, фикащия 2.5% г.чутаровы.м альдегидом на какодилатно.м буфере: го.могенная структура хро.мапшна:

6 - фиксацю! 2.5% г.чутировьш альдегидом на 50 мМ Тп^-НС1: фибриллы и глобулы толщиной 20, 40 и 60 н.м;

в - фиксаци 2.5% глутаровьш альдегидом на 50 мМ Тг18-НС.1 после воздействия в 0,05мг/мл гепарина и 5мМ дитиотрейтола (время инкубаг/ии !5 минут):

фибриллы 10 и 30 нм .

3. Д е к о м п а к т т а н и я хроматина сперматозоидов, слитых с культивируемыми клетками Для изучения структуры нуклеопротаминового хроматина большой интерес представляют данные по декомпактизации ядер сперматозоидов, интродуцированных в культивируемые клетки (Meel, Pearson, 1979). Авторы цитированной работы преследовали цель изучить на этой модели динамику реактивации сперматозоидов, связанную с заменой протаминов на гистоны, которая в норме осуществляется после слияния сперматозоида с яйцеклеткой. Для того, чтобы получить эффект реактивации, предварительно обрабатывали сперматозоиды дитиотрейтолом, а затем с помощью инактинированного вируса сендай осуществляли процедуру слияния .

В нашей работе модель гетерокариотических клеток была использована по следующим причинам, прямо не связанным с реактивацией сперматозоидов. Вопервых, логично допустить, что культивируемые клетки не имеют специализированной системы, позволяющей эффективно удалять протамины из хроматина мужского пронуклеуса в цитоплазме ооцитов. Во-вторых, ДНК нуклеопротаминового хроматина, по определению, должна быть защищена от агрессивной внутриклеточной среды, в том числе и от действия нуклеаз (Carrell et al., 2007). И, в-третьих, известно, что окислительно-восстановительный потенциал цитозоля клетки способствует восстановлению атомов серы цистеиновых остатков (Оки, Sakai, 2011). Таким образом, можно предположить, что введение в культивируемые клетки нативных, не обработанных дитиотрейтолом. сперматозоидов должно, сопровождаться только декомпактизацией нуклеопротаминового хроматина, но не его реактивацией .

Морфологические и функциональные особенности гетерокариотической системы: сперматозоид/соматическая клетка Слияние нативных сперматозоидов с культивируемыми клетками проводили посредством инкубации в течение 1 минуты в 50%-ном растворе полиэтиленгликоля на фосфатном буфере. В результате формировались клеточные гетерокарионы, содержащие от одного до трёх сперматозоидов .

Для наблюдений за судьбой сперматозоидов в составе гибридных клеток препараты фиксировали через различные промежутки времени после индукции слияния (от 1 часа до 6 суток). Проникновение сперматозоидов в соматические клетки начинается через три часа после индукции слияния. При этом первые полностью проникшие в клетки сперматозоиды, регистрируются только через шесть часов. В дальнейшем, происходит постепенное увеличение доли проникших сперматозоидов, однако единичные сперматозоиды, лежащие вне клеток, присутствуют на препаратах вплоть до шестых суток с момента индукции слияния .

После проникновения сперматозоидов внутрь соматических клеток постепенно изменяется форма и размеры их ядер, которые приобретают округлую форму и на четвёртые сутки после слияния достигают размеров, близких к размерам ядер клетокреципиешов .

При этом в ядрах сперматозоидов, слившихся с соматическими клетками, изменяется оптическая плотность материала, контрастируя с окружающей цитоплазмой. В тех же условиях, сперматозоиды, лежащие вне клетки, но вплотную примыкающие к её оболочке, имеют темную центральную область, более светлую периферию и яркий светлый ореол вокруг головки .

Результаты изучения препаратов, окрашенных 0АР1, позволяют предположить, что одна из причин изменения светопреломления - деконденсация хроматина сперматозоидов, которая сопровождается увеличением размеров их ядер. По интенсивности окрашивания сперматозоиды в составе гибридов занимают промежуточное положение между интерфазиым ядром и митотическими хромосомами. В то же время, хроматин сперматозоидов, находящихся вне клетки, флуоресцирует заметно ярче митотичееких хромосом. Для ответа на вопрос, сопровождается ли процесс декомпактизации хроматина функциональной реактивацией генома были поставлены эксперименты в ходе которых выявляли синтез ДНК и РНК в гибридных клетках. Инкубация клеток в среде, содержащей смесь меченых нуклеотидов (ЕсШ, ри), конкурирующих с каноническими нуклеотидами при синтезе нуклеиновых кислот, позволяет раздельно выявить в одних и тех же клетках новосинтезированную ДНК и РНК. До четвёртых суток включительно не было выявлено признаков синтетической активности в ядрах сперматозоидов, в то время как ядра клеток-реципиентов включали оба типа меченых нуклеотидов .

Так как на ультраструктурном уровне вокруг ядер сперматозоидов, проникших в соматические клетки, обнаруживаются элементы ядерной оболочки, было проведено иммуноцитохимическое выявление ламинов А и С. Полученные, в ходе этого эксперимента, результаты свидетельствуют о том, что ядра сперматозоидов не обладают полиоцеиной ядерной оболочкой, выявляемой в соматических ядрах гегерокарионов при помощи антител против лами1юв. Таким образом, анализ ядер нативных сперматозоидов, слитых с культивируемыми клетками, показывает, что в полученных клеточных гибридах не происходит функциональная реактивация генома сперматозоидов, однако нуклеопротаминовый хроматин способен к декомпактизации .

Разрывы ДНК в хроматиие сперматозоидов в контроле и после слияния с культивируемыми клетками .

Известно, что на начальных этапах дифференцировки в ядрах ранних сперматид наблюдаются множественные разрывы ДНК, индуцированные активностью топоизомеразы, которые, по-видимому, необходимы для топологических перестроек ремоделирующегося хроматина (Akama et al., 1999; Kierszenbaum, 2001; Carrell et al., 2007). Впоследствии, эти разрывы репарируются, однако даже в эякуляте здоровых доноров выявляется небольшое количество (около 1 - 5%) дефектных по этому признаку сперматозоидов. Причины появления сперматозоидов с разрывами ДНК до настоящего времени не выяснены, однако, в медицинской практике тест на наличие разрывов ДНК (TUNEL) широко используется и является важной характеристикой «качества» эякулята .

В использованном образце спермы (контроль) разрывы ДНК детектируются только в 50% сперматозоидов. Оказалось неожиданным, что после формирования гетерокарионов (на 1-3 сутки после слияния), разрывы ДНК выявляются в ядрах всех исследованных сперматозоидов, внедренных в клетки .

При этом характер окрашивания и общая яркость свечения варьирует. Было выделено два основных паттерна распределения разрывов ДНК; гомогенное окрашивание всего ядра сперматозоида и окрашивание периферии акросом1юго полюса. При этом не было отмечено случаев выявления разрывов ДНК в ядрах и хромосомах клеток-реципиентов .

Хотя существенная часть сперматозоидов, лежащих вне клеток, содержит разрывы ДНК, характер окрашивания их ядер на разрывы ДНК имеет ряд существенных отличий. Во-первых, разрывы ДНК выявляются только примерно в половине всех сперматозоидов. Во-вторых, яркость окрашивания сперматозоидов, не включенных в клетку, заметно ниже, чем в гибридах .

На более поздних сроках (4-6 сутки после индукции слияния) ситуация коренным образом изменяется: в популяции появляются клетки, в которых выявляются крупные ядра сперматозоидов без разрывов ДНК .

Электронно-микроскопический анализ ядер сперматозоидов, внедренных в культивируемые клетки .

Через 48 часов после индукции слияния в цитоплазме клеток-реципиентов можно обнаружить только ядра сперматозоидов, тогда как, элементы акросомального комплекса, митохондрии и центриоли не выявляются. В некоторых гетерокарионах на благоприятных сечениях можно идентифицировать элементы частично деградирующего жгутика. Принципиально важно, что вокруг отдельно лежащих ядер не удается обнаружить плазматических мембран. Эти данные показывают, что ядра сперматозоидов включаются в состав цитоплазмы клеток-реципиентов. При этом хроматин сперматозоидов может существенно различаться по характеру компактизации. Условно, можно выделить два основных типа ядер. Ядра сперматозоидов первого типа характеризуется более высокой плотностью, чем ядра клеток-реципиентов (Рис. За). На границе хроматина и цитоплазмы присутствуют протяжённые структуры толщиной около 20 нм, напоминающие элементы оболочки .

На малом и большем увеличении в хроматине сперматозоида выявляются рыхлые фибриллярные комплексы переменной толщины от 50 до 300 нм (Рис. За) .

«Элементарной» структурой таких комплексов являются гладкие фибриллы толщиной око]Ю 8 нм, иногда лежащие параллельно. Пространство между комплексами заполнено фибриллами сходной толщины. На тангенциальных сечения, выявляемых на периферии ядра «элементарные» фибриллы располагаются более компактно, чем в центральной области .

Сперматозоиды второго типа имеют более декомпактизованный хроматин. В этом случае струюура ядра сперматозоида сравнима по плотности с ядром соматической клетки (Рис. 36). Как и в предыдущем случае в ядре преобладают гладкие фибриллы толщиной около 8 нм. Отдельные фибриллы, формируют зоны локального сгущения, где иногда выявляются розеточные структуры. Сохраняются участки парных, параллельно лежащих фибрилл .

Для достижения большей декомпактизации хроматина внедренных сперматозоидов были изучены гибриды, зафиксированные спустя 6 суток после индукции слияния .

Плотность ядра сперматозоида в данном случае меньше, чем плотность ядра соматической клетки (Рис. Зв). Хроматин сперматозоида, как и на более ранних сроках, представлен рыхлой сетью «элементарных» фибрилл. Однако в данном случае фибриллы имеют переменную толщину от 7 до 10 нм. На периферии хроматина выявляются элементы ядерной оболочки. Особенно четко ядерная оболочка визуализируется в кариоплазматических инвагинациях .

Тот факт, что выявленная структурная реорганизация хроматина строго специфична для гетерокариотических систем, подтверждается ультраструктурным анализом сперматозоидов, заведомо находившихся вне клетки. В таких сперматозоидах наблюдается, практически, полная деградация цитоплазматических структур, однако нуклеопротаминовый хроматин сохраняет относительно высокую степень компактизации .

–  –  –

СПИСОК РАБОТ, О П У Б Л И К О В А Н Н Ы Х ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1) Е. А. Арифулин, Е. Е. Брагина, В. А. Замятнина, Е. Г. Волкова, Е. В. Шеваль, С. А. Голышев, А. Н. Прусов, Л. Н. К и н ц у р а ш в и л и. Г. И. Кирьянов. В. Ю. Поляков Компактизация ДНК в сперматозоидах человека. Г. Динамика изменений компактизации нуклеогистонного и нуклеопротаминного хроматина в дифференцирующихся сперматидах. Онтогенез. (В печати)

2) Е. Е. Брагина, Е. А. Арифулин, С. А. Голышев. Разработка диагностических критериев патологии мужского бесплодия на основе особенностей молекулярных и структурных модификаций инактивированного х р о м а т и н а сперматозоидов. // Тезисы Итоговой конференции по результатам выполнения мероприятий за 2009 год в рамках приоритетного направления «Живые системы» Ф Ц П «Исследования и разработка по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы» .

3) Е. А. Арифулин, Е. Е. Брагина, В. А. Замятнина, Е. В. Шеваль, С. А. Голышев, Л. Н. Кинцурашвили, Г. И. Кирьянов, А. Н. Прусов, В. Ю. Поляков. Динамика изменений компактизации нуклеогистонного и нуклеопротаминного хроматина в дифференцирующихся спермиях. // Тезисы XVI Всероссийского симпозиума «Структура и функции клеточного ядра» .

–  –  –

119421, г. Москва, Ленинский проспект, д.99