«I 05002226 ПОСПЕЛОВ АЛЕКСЕЙ ЛЬВОВИЧ РОЛЬ МУТАЦИЙ НЕКОТОРЫХ ГЕНОВ ЕСТЕСТВЕННОГО И ПРИОБРЕТЕННОГО ИММУНИТЕТА В ТЕЧЕНИИ ВПЕРВЫЕ ВЫЯВЛЕННОГО ТУБЕРКУЛЕЗА У ДЕТЕЙ И ПОДРОСТКОВ. ...»

/

/

I

"05002226

ПОСПЕЛОВ АЛЕКСЕЙ ЛЬВОВИЧ

РОЛЬ МУТАЦИЙ НЕКОТОРЫХ ГЕНОВ ЕСТЕСТВЕННОГО И

ПРИОБРЕТЕННОГО ИММУНИТЕТА В ТЕЧЕНИИ ВПЕРВЫЕ

ВЫЯВЛЕННОГО ТУБЕРКУЛЕЗА У ДЕТЕЙ И ПОДРОСТКОВ .

14.03.09 - клиническая иммунология, аллергология

03.02.07 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук ^ 7 НОЯ 2011 Москва -2011 Работа выполнена в лаборатории клинической иммунологии отдела иммунологии Центрального НРШ туберкулеза .

Научный руководитель:

Доктор медицинских наук Авербах Михаил Михайлович

Научный консультант:

Доктор медицинских наук Губкина Марина Федоровна

Официальные онионенты:

Доктор медицинских наук, профессор Ляшенко Всеволод Андреевич Кандидат биологических наук Афанасьев Константин Иванович Ведущая организация: Московский городской научно-практический центр борьбы с туберкулезом Защита диссертации состоится « /. / у » 2011 г. в г ^ ' ' часов на заседании диссертационного совета Д 208.046.02 в Федеральном бюджетном учреждении науки «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им Г. Н. Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Российской Федерации по адресу: 125212, г. Москва, ул. Адмирала Макарова, д. 10 .

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н .

Габричевского, г.Москва .

Автореферат разослан « » 2011 г .

Ученый секретарь диссертационного совета, к.м.н. Новикова Л. И .

Общая характеристика работы Актуальность проблемы Эпидемическая обстановка по туберкулезу (ТБ) в России остается напряженной на протяжении последних двух десятилетий. Это связано с тем, что имеется большое число не выявленных и не излеченных больных туберкулезом, являющихся источником инфекции [Шилова М.В., 2008] .

Регистрируемая заболеваемость существенно различается в субъектах Российской Федеращ1и. Самые высокие показатели как территориальной заболеваемости (229,3/100 тыс. населения), так и заболеваемости постоянного населения (180,9/100 тыс.) зарегистрированы в 2009 г. в Республике Тыва. Они превышают среднероссийские показатели (82,6 и 66,8 на 100 тыс. населения, соответственно) в обоих случаях в 2,7 раза (Аналитический обзор по туберкулезу в Российской Федеращ1и, 2009). При оценке эпидемиологических показателей по туберкулезу большое внимание уделяется заболеваемости детей и подростков, которая наиболее достоверно отражает напряженность ситуации по туберкулезу [Аксенова В.А. и др., 2002; Овсянкина Е.С. и др., 2008; Чернеховская Н.Е. и др., 2008] .

Известно, что туберкулез является мультифакториальным заболеванием .

Исход первичной встречи микобактерии туберкулеза (Mycobacterium tuberculosis) (МБТ) с организмом (человеком) зависит от состояния иммунной системы. Дети и подростки относятся к категории, характеризующейся повышенным риском развития туберкулезной инфекции, поскольку у детей происходит возрастное становление иммунной системы, а в подростковом возрасте происходит физиологическая перестройка гормональной системы [Бережков Л.Ф., 1984] .

Концепщ1Я генетической предрасположенности к туберкулезу получила подтверждение благодаря целому ряду исследований [Newpor M.J. et al., 1995;

Aleis A. et al., 2005]. При проведении популяционных исследований было показано, что неблагоприятное течение туберкулеза у больных различных национальностей наблюдается при наличии определенных антигенов HLA [Поспелов Л.Е. и др., 1987, 2003; Садыков А.С. и др.,]999]. Также изучались различные мутации генов естественного и приобретенного иммунитета и их ассоциация с туберкулезом [Bellamy R. et al., 1998; Lopez-Maderuelo D. et al., 2003; McAdam K.P.W.J., 2004]. Полученные в этих исследованиях результаты были неоднозначны, поскольку аллельные варианты, которые ассоциировались с туберкулезом в одной популяции, не всегда прослеживались на других .

Изучение уровня цитокинов показало, что в антимико бактериальной защите важную роль играют различные цитокины: IFNy, IL-2, TNFa, IL-ip, IL-10, TGFp, IL-8 [Маянский Л.Н., 2003; Yamada H. et al., 2000; Smith S. et al., 2002; Li H.T. et al., 2006]. Однако в зависимости от характера течения заболевания уровень цитокинов в сыворотке больного изменяется поразному .

Работ, которые включали бы в себя одновременно иммунологические, генетические и клинические исследования в оценке развития впервые выявленного туберкулезного процесса у детей и подростков нами не выявлено .

В связи с этим, актуально проведение комплексного исследования, направленного на изучение взаимосвязи аллелей генов естественного и приобретенного иммунитета с уровнем продуцируемых цитокинов и различными клиническими параметрами туберкулезного процесса у детей и подростков .

Цель работы: определение роли полиморфизма генов естественного и приобретенного иммунитета в течении туберкулеза у детей и подростков .

Задачи исследования:

1. Определить полиморфизм генов Nrampl, IFNy, IL-10 и сопоставить частоты аллелей и генотипов, ассоциирующихся с туберкулезом, у здоровых и больных туберкулезом детей и подростков тувинской и европейской популяций .

2. Сравнить содержание провоспалительных (IFNy, TNFa, IL-ip) и противовоспалительного (IL-10) цитокинов в сыворотке крови у больных туберкулезом тувинской и европейской популяций до начала противотуберкулезной химиотерапии .

3. Изучить динамические изменения содержания цитокинов (IFNy, TNFa, ILl-P и IL-10) на разных этапах лечения больных туберкулезом в европейской популяции и определить их роль в оценке эффективности проводимой химиотерапии .

4. Изучить корреляцию между аллелями генов IFNy, IL-10, уровнем содержания цитокинов в крови и клиническими характеристиками туберкулеза у больных европейской популяции .

Научная новизна Впервые показано, что гомозигота по аллелю С сайта INT4 гена Nrampl и гомозигота по аллелю Т сайта +874 гена IFNy достоверно чаще встречаются у здорового контингента европейской части России, по сравнению с больными ТБ детьми и подростками .

Впервые показано, что гомозигота по аллелю А сайта +874 гена IFNy достоверно чаще встречается у больных ТБ детей и подростков европейской популяции по сравнению с не болеющими ТБ. В тувинской популящ1и этот генотип имеется у большинства больных и контактирующих с больными туберкулезом детей и подростков .

Впервые показано, что у больных туберкулезом на фоне отсутствия «резистентных» генотипов (генотип С/С сайта INT4 гена Nrampl и генотип Т/Т сайта +874 гена IFNy), при генотипах А/А и А/Т сайта +874 гена IFNy уровень цитокина различен и сочетается со степенью тяжести туберкулезного процесса. Так, при генотипе А/А в группе со скудной клинической картиной уровень IFNy был достоверно ниже, по сравнению с группой с выраженной клинической картиной. Уровень IFNy в группе со скудной клинической картиной при генотипе AJA был достоверно ниже, по сравнению с генотипом А/Т .

Практическая значимость В клинической практике данные об аллельных вариантах геновкандидатов подверженности туберкулезу могут применяться для формирования групп риска по заболеванию туберкулезом .

Данные, полученные при анализе динамических изменений уровней провоспалительных и противовоспалительных цитокинов в процессе лечения, могут служить дополнительным оценочным критерием успешно проводимой химиотерапии туберкулеза .

Основные положения, выносимые на защиту:

• Дети и подростки тувинской популяции характеризуются низкой частотой встречаемости генотипа С/С сайта 1NT4 гена Nrampl и генотипа Т/Т сайта +874 гена IFNy, повышенной частотой встречаемости аллеля А сайта D543N по сравнению с европейской популяцией .

• У детей и подростков европейской части России генотип С/С сайта ШТ4 гена Nrampl и генотип Т/Т сайта +874 гена IFNy ассоциируются с «резистентностью» к туберкулезу. Б группе не болеющих туберкулезом детей и подростков тувинской национальности данные генотипы встречаются крайне редко, что может косвенно влиять на тяжелую эпидемическую ситуацию в Республике Тыва .

• Динамическое снижение уровня IFNy в процессе лечения отражает снижение активности туберкулезного процесса в ходе проведения эффективной противотуберкулезной терапии .

• У детей и подростков из европейской части России генотипы А/А и А/Т сайта +874 гена IFNy в разной степени влияют на уровень сывороточного IFNy до начала лечения. При генотипе А/А в группе со скудной клинической картиной уровень IFNy был достоверно ниже, по сравнению с группой с выраженной клинической картиной. Уровень IFNy в группе со скудной клинической картиной при генотипе А/А был достоверно ниже, по сравнению с генотипом А/Т .

Внедрение результатов работы. Результаты диссертационного исследования по уровню цитокинов внедрены в лечебный процесс и используются как дополнительный оценочный критерий успешно проводимой химиотерапии туберкулеза в дстско-подростковом отделе ЦНИИТ РАМН. Материалы диссертационного исследования вошли в лекционных курс повышения квалификации специалистов в Учебном Центре ЦНИИТ РАМН .

Апробация работы проведена 17 февраля 2011 на заседании отдела иммунологии ЦНИИ туберкулеза РАМН Материалы диссертации доложены на научно-практической конференции молодых ученых «Новые технологии в эпидемиологии, диагностике и лечении туберкулеза взрослых и детей» ЦНИИТ РАМН (Москва, 2009; Москва, 2010; Москва, 2011), на ученом совете ЦНИИТ РАМН (25.10.2010 г., Москва), на XX Национальном конгрессе по болезням органов дыхания (Москва, 2010), на «Workshop: Research opportunities in ТВ drug discovery and diagnostics» (Moscow, 2010) .

Публикации По теме диссертации опубликовано 8 работ, из них 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ .

Объем и структура диссертации Диссертационная работа изложена на 118 страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, собственных результатов и их обсуждения, заключения и выводов. Данные проиллюстрированы 4 схемами и 36 таблицами. Библиографический указатель включает 210 источников, из них 49 работ отечественных авторов .

Содержание работы Материалы и методы исследования Были обследованы образцы крови детей и подростков, больных туберкулезом и контактирующих с больными ТБ, тувинской националыюсти

- всего 118 человек. Образцы крови больных собирались в Республиканском противотуберкулезном диспансере Республики Тыва (г. Кызыл, всего 61 человек), образцы группы контактирующих с больными ТБ собирались в противотуберкулезном санатории «Балгазын» (всего 57 человек). В группе детей и подростков женского пола было 48 человек, а мужского пола 70 человек. Возраст в общей группе больных имел диапазон от 3 до 17 лет .

Из европейской популяции были обследованы больные дети и подростки, находящиеся на стационарном лечении в Центральном НИИ Туберкулеза РАМН (ЦНИИТ РАМН) (135 впервые выявленных больных туберкулезом). В группе детей и подростков женского пола было 68 человек, а мужского пола 67 человек. Возраст в общей группе больных имел диапазон от 4 до 17 лет .

Группа контроля (для генетического исследования) европейской популяции, не болеющая туберкулезом, набиралась в Российской детской клинической больнице (дермато-аллергологическое отделение), а также среди детей и подростков из Ц Ш И Т, у которых не был установлен диагноз туберкулез. Общее число детей и подростков в контрольной группе составило 51 человек. В группе детей и подростков женского пола было 22 человека, а мужского пола 29 человек. Возраст детей и подростков в группе контроля имел диапазон от 4 до 17 лет .

Для молекулярного генотипирования образцы периферической крови (3мл) больных туберкулезом и здоровых детей и подростков собирались и помещались в пробирки с EDTA. ДНК выделялась из 200 мкл крови пациентов с помощью наборов для выделения ДНК (Magna DNA Prep 200) фирмы ООО «Лаборатория Изоген» (Россия) .

Для полимеразной цепной реакции (ПЦР) использовали набор реагентов для амплификации ДНК «GenePak PCR Core» ООО «Лаборатория Изоген», содержащий ингибированную для «горячего старта» Taq ДНК полимеразу, дезоксинуклеозид трифосфаты и хлорид магния с конечными концентрациями, соответственно, lu, 200 мкМ и 2,5 т М, а также оптимизированную буферную систему для проведения ПЦР. Конечная концентрация праймеров в реакции 0,1-0,5 мкМ, объем 5 мкл, количество ДНК 50-100 иг, объем 5 мкл. Исследуемые аллельные варианты представлены в таблице А .

Таблица А. Исследуемые полиморфные сайты .

Ген Полиморфные Локализация Литература сайты в гене NRAMP1 469+14 G/C (INT4) Интрон 4 Soborg С. et al., 2002 .

D543N Экзон 15 IFN-Y +874 А/Т Интрон 1 Vidyarani M.et al., 2006 .

IL-10 -1082 A/G Промотер Hyoung Doo Shin et.al., 2005 .

Определение уровня цитокинов INFy, TNFa, IL-1|3 и IL-10 в сыворотке периферической крови проводилось методом ИФА, с помощью наборов фирмы «Вектор-Бест» (Россия). Венозную кровь набирали в чистую пластиковую пробирку. Для образования сгустка кровь оставляли на 30 мин час при комнатной температуре или помещали в термостат при 37°С .

Образовавшийся сгусток крови отделяли от стенок стеклянной палочкой .

После этого кровь центрифугировапи 10-15 мин при 1500 об/мин .

Полученную сыворотку переносили в другую чистую пробирку и замораживали при -80°С. За контроль уровня цитокинов были взяты данные условно здоровых доноров (п=68), представленные фирмой производителем наборов для ИФА .

Распределение генотипов по исследованным локусам проверялось на соответствие ожидаемым при равновесии Харди-Вайнберга. Для анализа ассоциации туберкулеза с маркерами исследуемых генов использовали критерий при сравнении групп, в которых было менее 50 человек, подсчет осуществлялся с помощью с поправкой Йетса на непрерывность, при числе степеней свободы, равном 1. Расчет всех параметров производился в программе Microsoft Excel 2007, с использованием таких элементов описательной статистики как: измерение медианы, среднего, стандартного отклонения, стандартной ошибки, внутригрупповых дисперсий, расчета доверительных интервалов, а также двухвыборочный t-тест. Также производился расчет отношения шансов и относительного риска .

Результаты исследования и обсуждение Встречаемость некоторых аллелей генов NRAMP1, INFy и IL-10 у больных туберкулезом детей и подростков и контактирующих с больными ТБ Республики Тыва и у больных и здоровых инфицированных детей и подростков из европейской части России .

Распределение частот аллелей (табл. 1) в единичных мутациях генов NRAMP1, IFNy и 1L-10 в тувинской популяции показало, что разницы между группой больных детей и подростков, и контактирующими с больными по частоте распределения аллелей не наблюдалось. При этом показатели их частоты были практически одинаковыми. В европейской популяции встречаемость тех же аллелей показала идентичную картину с тувинской популяцией. Но между собой популяции отличались по частоте встречаемости отдельных аллелей. Так, в тувинской популяции достоверно чаще встречается аялель А сайта D543N гена NRAMP1 и достоверно реже аллель Т сайта +874 IFNy, по сравнению с европейской, в которой аллель Т достоверно чаще встретился в группе здоровых инфицированных детей и подростков, в сравнении с больными туберкулезом .

Таблица 1. Распределение частот генов-кандидатов в тувинской и

–  –  –

При сравнении генотипов сайта ШТ4 гена NRAMP1, D543N гена NRAMP1, +874 гена IFNy и 1082 гена IL-10 в тувинской популяции оказалось, что разницы между больными ТБ и контактирующими с больными ТБ детьми по частоте встречаемости генотипов по каждой мутации не обнаружено. В обеих группах наблюдалась практически одинаковая частота встречаемости указанных генотипов (Рис. 1 -4) .

В европейской популяции, при сравнении тех же мутаций между группами больных и здоровых инфицированных детей и подростков (Рис. 1показано достоверное различие в следующих генотипах: генотип С/С сайта 1NT4 гена NRAMP] (Рис. 1) и два генотипа сайта +874 гена IFNy - А/А и Т/Т (Рис.3). Так генотип С/С мутация INT4 гена NRAMP] и генотип Т/Т сайта +874 гена IFNy достоверно чаще встречались в группе здоровых инфицированных детей и подростков, по сравнению с больными туберкулезом (х'=6,45, р0,05; х^=4,26, р0,05). Для генотипа С/С сайта INT4 гена NRAMP1 OR=0,088, а для генотипа Т/Т сайта +874 гена IFNy OR=0,]7 .

При этом, чем меньше значении OR по отношению к единице (0R1), тем выше протективные свойства генотипа .

Генотип А/А сайта +874 гена IFNy достоверно чаще встречался в группе больных туберкулезом детей и подростков, по сравнению со здоровыми инфицированными (х^ =5,34, р0,05), при этом OR=3,68, а RR=2,32 .

–  –  –

-АЛ 2% 3% 0% 1%

–  –  –

67% 56% 25% 16% 16% 0% 0%

–  –  –

70% 57% 57% 51% 47% 43% 1%

–  –  –

Нам представляется, что генотип С/С сайта INT4 гена NRAMP] и генотип Т/Т сайта +874 гена IFNy, достоверно чаще встречающиеся у здоровых детей и подростков, проживающих на европейской части России, могут рассматриваться как генотипы «резистентности» к туберкулезу. Стоит учитывать, что это только генотип одной мутации, а не гаплотип всего гена .

Как ассоциируются остальные генотипы конкретного гена с туберкулезом пока еще не изучено .

В то время как по данным нашего исследования генотип Т/Т сайта +874 гена IFNy можно рассматривать как генотип «резистентности», генотип А/А сайта +874 гена IFNy можно рассматривать как генотип «чувствительности»

к туберкулезу. Так, генотип А/А сайта +874 гена IFNy достоверно чаще встречался у больных туберкулезом детей и подростков по сравнению со здоровыми инфицированными, проживающими на европейской части России, а в тувинской популяции частота генотипа А/А доминировала над генотипом А/Т в обеих группах (больные и контакты по туберкулезу) .

Связывая избыточное наличие в тувинской популяции чувствительного генотипа А/А сайта +874 гена IFNy и отсутствие резистентного генотипа С/С сайта INT4 гена NRAMP1 и генотипа Т/Т сайта +874 гена IFNy, возможно предположить, что они оказывают влияние на сложившуюся тяжелую эпидемиологическую ситуацию в Республике Тыва. При этом данные генотипы ассоциируются с заболеваемостью туберкулезом в целом, а не с какими-то отдельными его формами .

Таким образом, проанализировав полученные результаты можно говорить о том, что генотип С/С сайта INT4 гена NRAMP1 и генотип Т/Т сайта +874 гена IFNy достоверно чаще встречаются у здорового контингента (детей и подростков), проживающего на европейской части России, и могут рассматриваться как гены резистентности к туберкулезу. Отсутствие этих генотипов у детей и подростков туви11ской популяции свидетельствует в пользу возможной повышенной чувствительности к туберкулезу лиц тувинской национальности. Данные генотипы отсутствовали в исследуемой группе, однако они встречаются в тувинской популяции .

Генотип А/А сайта +874 гена IFNy достоверно чаще встречался у больных детей и подростков, проживающих на европейской части России, а в тувинской популяции частота данного генотипа доминировала в группах больных и контактах. Исходя из этих данных, можно говорить о том, что генотип А/А, возможно, играет роль в чувствительности к туберкулезу .

Исследованные мутации гена IL-10 (-1082) и гена NRAMP1 (D543N) не показали ассоциаций с туберкулезом. Аллель А сайта D543N гена NRAMPI чаще встречался у детей и подростков из Республики Тыва, по сравнению с детьми проживающими на европейской территории России. Тем самым он может являться специфическим маркером популяции, но при этом никак не влияющим на чувствительность или резистентность к туберкулезу .

Уровень содержания цитокинов IFNy, TNFa, IL-ip и IL-10 и их динамические изменения в процессе химиотерапии в зависимости от клинических параметров у детей и подростков из Республики Тыва и европейской части России .

Уровень цитокинов определялся до начала лечения у детей и подростков, больных туберкулезом из Республики Тыва и проживающих на европейской части России. Также определяли уровень цитокинов в процессе лечения у детей и подростков европейской части России (для детей и подростков из Республики Тыва измерение уровня цитокинов в динамике не проводилось) .

Уровень цитокинов (IFNy, TNFa, IL-ip и IL-10) в тувинской популяции, до начала лечения, показал достоверное различие только по одному цитокину IL-ip - между группами контактов и больных туберкулезом детей и подростков, р0,05 (табл. 2). По остальным цитокинам разницы между этими двумя группами не было обнаружено. В ходе исследования при сравнении взаимосвязи уровней цитокинов сыворотки крови и клинических параметров были получены неоднозначные, хотя и достоверные по ряду параметров, данные, но они не всегда совпадали с характером клинической картины заболевания. Это, скорее всего, связано с наличием паразитарных и дерматологических заболеваний, часто встречающихся у детей и подростков тувинской национальности. Данные заболевания могут кардинально изменить цитокиновый фон пациентов .

–  –  –

В связи с тем, что в группе контроля детей и подростков европейской популяции имелись различные соматические и остро-бронхиальные заболевания, за контроль уровня цитокинов были взяты данные условно здоровых доноров (п=68), представленные фирмой производителем наборов для ИФА. Контрольную группу из числа здоровых детей и подростков не набирали из этических соображений .

Уровень IFNy, TNFa, IL-ip и IL-10 в целом в группе больных туберкулезом европейской части России до начала лечения многократно превышал контрольные значения содержания цитокинов в сыворотке, указанные фирмой производителем тест-систем. Уровень IFNy и IL-10 достоверно снижался к 6-му месяцу пребывания в стационаре вследствие успешной противотуберкулезной химиотерапии, IL-ip не претерпевал существенных изменений, а уровень TNFa достоверно возрастал (табл. 3) .

Среди изученных цитокинов (IFNy, TNFa, IL-ip и IL-10) динамические изменения IFNy у детей и подростков оказались наиболее показательными. В общей группе больных ТБ, при группировке по типу начала заболевания были выделены следующие типы: бессимптомное, подострое и острое. При этом уровень IFNy был наиболее высоким до лечения при остром типе начала заболевания и достоверно снижался в процессе успешного лечения во всех трех группах (табл. 4), что повторяет тенденцию изменения IFNy в группе больных в целом .

–  –  –

Таким образом, мы исследовали уровень сывороточных цитокинов IFNy, IL-l, IL-10 и TNFa у больных различными формами туберкулеза детей и подростков европейской части России в динамике (при поступлении и через 3 и 6 месяцев пребывания в стационаре) и у больных и группы контактирующих с больными туберкулезом детей и подростков республики Тыва .

Уровень указанных цитокинов в целом в группе больных туберкулезом европейской части России до начала лечения многократно превышал контрольные значения содержания цитокинов в сыворотке, указанные фирмой производителем тест-систем. Уровень IFNy и LL-10 достоверно снижался к 6-му месяцу пребывания в стационаре вследствие успешной противотуберкулезной химиотерапии, IL-I не претерпевал существенных изменений, а уровень TNFa достоверно возрастал. При группировании больных по типам начала заболевания (бессимптомное, подострое и острое) или формам легочного туберкулеза (ИТ, ОТ, ТВГЛУ и «другие формы ТБ») и фазам процесса (инфильтрация, кальцинация и уплотнение) тенденции в изменении содержания IFNy, IL-10 и TNFa соответствовали таковым в группе больных в целом. Уровень IL-l достоверно снижался при успешном лечении туберкулеза с острым началом заболевания и при лечении таких форм как ИТ, ОТ, и «другие формы ТБ». При лечении ТВГЛУ уровень IL-l не изменялся. При анализе уровня цитокинов в зависимости от наличия МБТ выяснилось, что до начала лечения уровень всех цитокинов у больных с наличием МБТ в мокроте не имел различий с больными, у которых нет МБТ выделения .

Уровень IFNy и IL-10 у больных МБТ+ и МБТ- достоверно снижался в процессе лечения, уровень TNFa достоверно повышался к шестому месяцу химиотерапии лишь у больных МБТ-, а уровень IL-ip оставался неизменным. Влияние фактора наличия распада легочной ткани не отразилось на уровне содержания цитокинов. При изучении влияния фактора туберкулиновой реакции на уровень цитокинов (дети с умеренной реакцией, дети с выраженной реакцией и дети с гиперпробой) выяснилось, что достоверной разницы между уровнем всех цитокинов в трех группах не было. Тенденция изменения уровня цитокинов соответствовала обшей группе больных ТБ .

Дети и подростки из Тывы, больные различными формами туберкулеза и контактирующие с больными были обследованы однократно. Уровень всех изученных цитокинов был выше нормы. Отмечено, что уровень IL-ip достоверно выше у больных ТБ по сравнению с контактирующими с больными ТБ, уровни остальных цитокинов не различались .

Сопоставление генетических вариантов мутаций, показателей цитокинов (IFNy, IL-IO) и клинических параметров у детей и подростков с впервые выявленным туберкулезом .

При сопоставлении клинического параметра «объем поражения легочной ткани», изучаемого локуса и уровня цитокина показано, что группа с малой формой и мутацией +874 гена IFNy с генотипом А/Т имеет более высокий уровень JFNy до начала лечения, по сравнению с генотипом А/А той же мутации и эта разница статистически достоверна ( р=0,05) (табл.6). Для группы с ограниченной и распространенной формой туберкулеза такого различия не было обнаружено .

При изучении уровня IFNy у больных европейской части России в зависимости от фазы туберкулезного процесса было показано его снижение к 6-му месяцу пребывания в стационаре (табл. 5). Изучение влияния генотипа с А/А мутацией +874 гена IFNy на его концентрацию в крови показало, что до лечения он наиболее высокий в фазе инфильтрации и достоверно ниже в фазе уплотнения, и снижается в процессе лечения. При генотипе А/Т уровень IFNy, наоборот, до лечения наиболее высокий в фазе уплотнения и достоверно ниже, чем в фазе инфильтрации и кальцинации (р=0,04). Кроме того, при генотипе А/Т уровень IFNy у больных с процессом в фазе уплотнения достоверно выше, чем с генотипом А/А мутацией +874 гена IFNy (табл. 7) .

–  –  –

- достоверные различия уровня IFNy в группе уплотнение, р0,05 .

П р и г р у п п и р о в к е б о л ь н ы х по типу н а ч а л а з а б о л е в а н и я ( б е с с и м п т о м н о е, п о д о с т р о е и острое) и и з у ч е н и и у н и х у р о в н я IFNy б ы л о п о к а з а н о его наиболее высокое значение при остром типе начала заболевания и достоверное снижение в п р о ц е с с е у с п е ш н о г о л е ч е н и я во всех т р е х г р у п п а х (табл. 4). Н а л о ж е н и е на эти ф а к т о р ы г е н о т и п а сайта + 8 7 4 гена IFNy показало отсутствие какого-либо в л и я н и я г е н о т и п а на у р о в е н ь IFNy п р и р а з л и ч н о м т и п е н а ч а л а заболевания .

Мы выделили две группы больных, имеющих диаметрально противоположные клинические проявления туберкулеза, с целью сравнения генотипов сайта +874 гена IFNy и -1082 гена IL-JO, уровня IFNy и 1L-10 в сыворотке крови и клинической картины заболевания. Первая группа из 10 больных туберкулезом детей и подростков имела следующие характеристики туберкулезного процесса: острое начагю заболевания, наличие фазы инфильтрации, распада, выделение МБТ. Основной формой туберкулеза в этой группе являлся ИТ - 60%, также присутствовали кавернозный и фиброзно-кавернозный туберкулез. Во второй группе заболевание имело бессимптомное начало, процесс находился в фазе уплотнения, отсутствовал распад легочной ткани, МБТ не выделялись (8 человек). Основной формой туберкулеза в этой группе являлся ОТ - 75%, больные с туберкулемой - 25% .

Несмотря на то, что у больных второй группы заболевание выявлено на этапе обратного развития туберкулезного процесса (фаза уплотнения), активность туберкулезной инфекции подтверждалась результатами клинпколабораторного обследования. Из представленного материала видно, что в первой группе с выраженной клинической картиной (табл. 8) уровень IFNy при генотипе А/Т сайта +874 гена IFNy на момент поступления в клинику был на 10% выше, по сравнению с уровнем IFNy при генотипе А/А, однако малое число наблюдений не позволило показать достоверность указанной тенденции в уровне IFNy. Доля генотипа А/А сайта +874 гена IFNy составила 80% и по 10% пришлось на генотипы А/Т и Т/Т. Генотип А/А и A/G сайта

–  –  –

' - достоверное различие в уровне IFNy до лечения при генотипе А/А между двумя группами (см. табл.11), р=0,005 +874 гена IL-W не оказывал влияния на уровень IL-10 в сыворотке и не прослеживалось взаимного регулирования в уровне сывороточного IFNy и IL-10 .

Во второй группе больных с более благоприятной клинической картиной (табл. 9) уровень IFNy при генотипе А/Т сайта +874 гена IFNy на момент поступления в клинику был в 1,75 раза (р=0,023) выше, по сравнению с уровнем IFNy при генотипе А/А. Доля генотипов А/А и А/Т сайта +874 гена IFNy составила по 50%. Влияния генотипа А/А и A/G, сайта +874 гена IL-IQ на уровень IL-10 в сыворотке не прослеживалось .

–  –  –

группами (см. табл. 10), р=0,005 достоверная разница, р=0,023 Сравнение первой и второй групп больных, имеющих генотип А/Т сайта +874 гена IFNy, не дало достоверных различий в уровне сывороточного IFNy, хотя тенденция этого процесса наметилась. Для генотипа А/А разница между двумя сравниваемыми группами была статистически достоверной (р=0,005). Так, у больных первой группы, с выраженной клинической картиной, уровень IFNy был выше в 1,4 раза, по сравнению со второй группой, имеющей слабую выраженность клинической картины .

Сопоставив между собой группу больных с острым началом заболевания, фазой инфильтрации, наличием распада легочной ткани и МБТ(+) и группу с бессимптомным началом заболевания в фазе уплотнения, без распада и МБТ(-), мы установили, что без учета конкретного полиморфизма обе эти группы по изменению уровня цитокинов повторяют данные по каждому отдельному клиническому параметру Таким образом, с учетом генотипов уровень IFNy до начала лечения не имел достоверных различий между генотипом А/А сайта +874 гена IFNy и генотипом А/Т и Т/Т в группе с выраженной клинической картиной. Иная картина наблюдалась при меньшей степени выраженности клинической картины, там уровень IFNy был достоверно выше при генотипе А/Т сайта +874 гена IFNy и ниже при генотипе А/А этой же мутации, р=0,023. Между собой генотипы в двух группах также отличались. Достоверную разницу (р=0,005) наблюдали между генотипом А/А в двух группах с диаметрально противоположными клиническими характеристиками до лечения. Для генотипа А/Т разница в уровне цитокина IFNy составила менее 5% и не была достоверной из-за малого числа наблюдений. По нашим данным, генотип А/А ассоциируется с туберкулезом, и в группе с более тяжело протекающими процессами он был представлен в 80% случаев, что в 1,6 раз чаще, чем в группе больных, имеющих скудную клиническую симптоматику (50%). Это косвенно может указывать на то, что генотип А/А на начальных этапах заболевания слабее проявляет свои свойства, по сравнению с генотипом А/Т, позволяя инфекции проявить выраженньп"! характер. В то же время нельзя игнорировать другие локусы гена IFNy, которые также могут влиять как на уровень IFNy, так и на ассоциацию с туберкулезом, т.к. один полиморфизм не может играть единоличную роль в этих процессах .

После начала химиотерапии показатели уровня IFNy между группами и между генотипами в этих группах достоверных отличий не имели, это свидетельствует о том, что на инфекцию в первую очередь влияют химиопрепараты, а иммунный ответ на инфекционное начало отходит на второй план. Установлено, что основная разница в уровне цитокина наблюдалась при естественном развитии инфекции еще до начала лечения .

Динамические измерения уровня 1L-10 при генотипах А/А и A/G сайта +874 гена IL-10 в группах сравнения показали изменения в уровне цитокина, сходные с общей группой больных. Уровень IL-10 достоверно снижался к шестому месяцу лечения. Влияния данного генотипа на уровень IL-10 не выявлено .

Выводы

1. Генотип С/С сайта INT4 гена NRAMP1 и генотип Т/Т сайта +874 гена IFNy достоверно чаще встречаются у здорового контингента европейской части России (8% и 8%, соответственно) по сравнению с больными туберкулезом детьми и подростками (1% и 1%, соответственно). Эти генотипы являются маркерами резистентности в отнощении туберкулезной инфекции. Отсутствие выявленных генотипов в тувинской популяции возможно определяет повыщенную заболеваемость туберкулезом коренного населения Республики Тыва .

2. Генотип А/А сайта +874 гена IFNy является маркером предрасположенности к заболеванию туберкулезом в обследованной группе детей и подростков европейской популяции. Наличие этого генотипа у большинства обследованных здоровых детей и подростков в тувинской популяции (84%) может способствовать повышенной заболеваемости туберкулезом коренной национальности. При этом, данный генотип ассоциируется с заболеванием туберкулезом в целом, а не с отдельными его формами .

3. Сравнение уровня цитокинов (IFNy, TNFa, IL-ip, IL-10) у больных европейской и Тувинской популяций до начала противотуберкулезной химиотерапии показало, что только уровень IFNy у больных тувинской популяции до начала лечения был достоверно ниже (р=0,0005), чем у больных европейской популяции .

4. Успешная противотуберкулезная химиотерапия приводила к достоверному снижению уровня IFNy и IL-10 к 6-му месях^у пребывания в стационаре, уровень IL-ip не изменялся, а уровень TNFa достоверно возрастал. Наиболее значимым для оценки тяжести туберкулезного процесса и эффективности проводимой терапии оказался IFNy, уровень которого у больных туберкулезом детей и подростков достоверно снижался на 20% в процессе химиотерапии .

5. У больных со скудной клинической картиной уровень сывороточного IFNy при генотипе А/Т сайта +874 гена IFNy в 1,75 раза (р=0,023) выше, по сравнению с уровнем IFNy при генотипе А/А до начала лечения. При сравнении групп больных со скудной и выраженной клинической симптоматикой получены достоверные различия (р=0,005) по уровню IFNy при генотипе А/А сайта +874 гена IFNy: уровень IFNy был в 1,4 раза выше при выраженной клинической симптоматике .

Список работ, опубликованных по теме диссертации .

1. Поспелов А.Л., Кордичева СЛО. Влияние некоторых локусов гена NRAMP1 у детей и подростков на предрасположенность к туберкулезу. Сборник тезисов научно-практической конференции молодых ученых «Новые технологии в эпидемиологии, диагностике и лечении туберкулеза взрослых и детей» / Москва, 2009. - С. 75-77 .

2. Поспелов А.Л. Влияние некоторых локусов гена NRAMP1 и IFNy у детей и подростков на предрасположенность к туберкулезу. Сборник тезисов научнопрактической конференции молодых ученых «Новые технологии в эпидемиологии, диагностике и лечении туберкулеза взрослых и детей» / Москва, 2 0 1 0. - С. 107-109 .

3. Поспелов А.Л., Кордичева С.Ю., Сороко-Новицкая А.Н., Поспелов Л.Е., Чистякова Н.И., Матракшии А.Г., Хайжок В.П., Ставицкая Н.В., Гсргерт В.Я., Авербах М.М. Полиморфизм локуса INT4 гена NRAMP1 у детей и подростков с локальным туберкулезом и поствакцинальными осложнениями // Туберкулез и болезни легких. - 2010. - №7. - С. 63-65 .

4. Поспелов А.Л., Матракшин А.Г., Чистякова Н.И., Поспелов Л.Е. Влияние полиморфизма генов IFNG и IL-10 на восприимчивость к туберкулезу в различных популяциях / Сб. трудов XX Национального конгресса по болезням органов дыхания / Москва, 2010, Дуайн Пресс, с.141-142 .

5. Pospelov L., Pospelov А., Kordicheva S. Peculiarities of inherited susceptibility to lung tuberculosis in Tuva republic / Workshop: Research opportunities in ТВ drug discovery and diagnostics / Moscow, 2010. p42 .

6. Поспелов А.Л. Корреляция мутации гена IFNy с уровнем IFNy при различных клинических параметрах у больных туберкулезом / Сборник тезисов научнопрактической конференции молодых ученых «Новые технологии в эпидемиологии, диагностике и лечении туберкулеза взрослых и детей» / Москва, 2 0 1 1. - С. 66-68 .

7. Поспелов А.Л., Авербах М.М., Губкина М.Ф., Поспелов Л.Е. Влияние полиморфизма геиов IFNy и IL-10 иа синтез цитокинов при туберкулезе легких у детей и подростков// Туберкулез и болезни легких. - 2011. - №3 .

- С.52-57 .

8. Поспелов А.Л., Авербах М.М., Губкина М.Ф. Уровень синтеза IFNy, TNFa, IL-ip и IL-10 на разных этапах лечения туберкулеза у детей и подростков// Туберкулез и болезни легких. - 2011. - №8. - С.36-40 .

Список сокращений

NRAMP - Макрофагальный белок, ассоциируемый с естественной резистентностью IFNy - интерферон гамма IFN-yR - рецептор интерферона гамма IL-10 - интерлейкин 10 IL-ip-интерлейкин 1 бета TNFa - фактор некроза опухолей альфа HLA - главный комплекс гистосовместимости человека ТБ - Туберкулез МБТ - Mycobacterium tuberculosis ИТ - инфильтратиБный туберкулез ОТ - очаговый туберкулез ПТК - первичный туберкулезный комплекс ТВГЛУ - туберкулез внутригрудных лимфатических узлов