WWW.LIT.I-DOCX.RU
БЕСПЛАТНАЯ  ИНТЕРНЕТ  БИБЛИОТЕКА - различные публикации
 


«ПЕТУХОВ ИВАН АЛЕКСЕЕВИЧ СИНТЕЗ И ИЗУЧЕНИЕ СВОЙСТВ ПОЛИКАТИОННЫХ ЛИПОФИЛЬНЫХ АГЕНТОВ ТРАНСФЕКЦИИ ...»

4614267

ПЕТУХОВ ИВАН АЛЕКСЕЕВИЧ

СИНТЕЗ И ИЗУЧЕНИЕ СВОЙСТВ ПОЛИКАТИОННЫХ ЛИПОФИЛЬНЫХ

АГЕНТОВ ТРАНСФЕКЦИИ

02.00.10 — Биоорганическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

2 5 ноя ?0Ю

МОСКВА —2010

Работа выполнена на кафедре химии и технологии биологически активных соединений им. НА. Преображенского Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М. В. Ломоносова

Научный руководитель:

Г.А. Серебренникова

• доктор химических наук, профессор

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, проф. А.П. Каплун Г.Е. Позмогова доктор химических наук Ведущая организация Институт биоорганической химии имени М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН Защита диссертации состоится « б » декабря 2010 г. в 16 часов на заседании Диссертационного Совета Д 212.120.01 при Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова по адресу: 119571, Москва, пр. Вернадского, С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МИТХТ им. М.В. Ломоносова по адресу: 119571, Москва, пр. Вернадского, 86. С авторефератом диссертации можно ознакомиться на сайте http://mitht.ru Автореферат разослан « 2 » ноября 2010 г .

Ученый секретарь Диссертационного Совета, кандидат химических наук, ^A^*-t^__ А. И. Лютик старшин научный сотрудник

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы Быстрое развитие технологии рекомбинантных ДНК, методов переноса плазмидных ДНК в клетку и выяснение молекулярных основ многих заболеваний привело к возникновению новой области медицины — генной терапии. Этот метод лечения наследственных и приобретенных заболеваний основан на введении терапевтических нуклеиновых кислот (НК) в клетки с целью направленного устранения генетических дефектов или придания клеткам новых функций. Важным условием успешной коррекции генетического повреждения являются эффективная доставка НК в клеткимишени, создание условий для ее длительного функционирования .

В настоящее время наиболее эффективными системами доставки НК являются вирусные векторы, однако они имеют ряд серьезных недостатков. Это стимулирует разработку альтернативных подходов, одним из которых является липофекция — метод доставки НК с помощью катионных липосом. Преимуществами катионных липосом являются неинфекционность, способность переносить НК неограниченного размера и защищать ее от действия клеточных ферментов, а также стабильность при хранении и экономическая доступность. В настоящее время катионные липосомы проходят клинические испытания для лечения ряда заболеваний. Однако, существенным недостатком известных на сегодняшний день липосомальных систем доставки является их низкая эффективность, обусловленная наличием внеклеточных и внутриклеточных биологических барьеров, которые должен преодолеть НК-липидный комплекс (липоплекс) прежде чем осуществить терапевтическое воздействие. К внеклеточным барьерам можно отнести компоненты крови и белки иммунной системы, которые дестабилизируют липоплекс и вызывают преждевременное высвобождение НК. Основными внутриклеточными барьерами, приводящими к снижению эффективности доставки, являются эндосомальная и ядерная мембраны .





Большое значение для повышения эффективности катионных липосом имеет структура формирующих их липидов. Молекула катаонного липида представляет собой комбинацию двух структурных доменов - гидрофобного и гидрофильного, - которые соединяются посредством линкеров различной природы. В качестве гидрофобного домена используют остатки длинноцепных углеводородов, стероидов и диглицеридов .

Гидрофильный домен может содержать одну (монокатионные липиды) или несколько положительно заряженных групп (поликатионные липиды). Монокатионные липиды чаще всего представляют собой третичные или четвертичные производные алифатических или гетероциклических азотистых оснований. В поликатионных липидах в качестве гидрофильного домена выступают природные или синтетические полиамины а также аминокислоты. \ Г Трансфицирующую активность катионного амфифила, а также его стабильность в биологических системах и токсичность во многом определяет тип связывания гидрофобного и гидрофильного доменов. Устойчивые липиды с простой эфирной связью более токсичны по сравнению с ацильными липидами, которые легко гидролизуются в клетке эндогенными эстеразами. Наиболее удачное сочетание стабильности и токсичности амфифила обеспечивает уретановый линкер. Создание новых положительно заряженных амфифилов липидной природы с линкерами различного типа, обладающих низкой токсичностью и высокой эффективностью высвобождения НК в клетке, является актуальным направлением биоорганической и биомедицинской химии. Кроме того, для увеличения эффективности выхода НК из эндосом в структуру катионных амфифилов вводят лабильные структурные модули, которые разрушаются под действием внутриклеточных факторов и агентов, приводя к дестабилизации липоплекса. Известно, что процесс эндоцитоза сопровождается увеличением кислотности среды от физиологического значения рН 7.4 до 5.0, поэтому включение в структуру амфифила кислотолабильных связей способствует дестабилизации липоплекса и облегчает высвобождение НК из эндосом в цитоплазму, тем самым увеличивая эффективность трансфекции. Другим примером катионных амфифилов, чувствительных к внутриклеточным агентам, служат липиды с дисульфидными связями, разрушаемые под действием восстановителей (НАДФН, глутатион, редуктазы) .

Данная работа посвящена синтезу и изучению биологических свойств новых поликатионных амфифилов на основе биогенных компонентов - холестерина и спермина для доставки НК .

Работа является частью научных исследований, проводимых на кафедре ХТБАС МИТХТ им. М В. Ломоносова по теме № 1Б-4-355 «Разработка химических и биотехнологических методов модификации биологически активных соединений с целью моделирования жизненно важных процессов в природе и создания новых лекарственных препаратов», а также в рамках ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы»

(02.512.11.2200), ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России»

(госконтракт П715), и грантов РФФИ (07-03-00632-а, 10-03-00995-а) .

Цель работы Разработка новых подходов к синтезу поликатионных амфифилов на основе биогенных компонентов - холестерина и спермина, с линкерами и спейсерами различной длины и типа и исследование их биологической активности .

Научная новизна работы В результате проведенной работы получены новые поликатионные амфифилы, содержащие в качестве гидрофобного домена остаток холестерина, а в качестве положительно заряженной группы - остаток спермина. Для увеличения эффективности высвобождения НК из эндосом связывание холестериновой и сперминовой компонент поликатионных амфифилов осуществляли с помощью ацетальных и дисульфидных связей, чувствительных к внутриклеточным агентам. Предложена и разработана универсальная схема синтеза поликатионных амфифилов на основе реакции Фукуямы, и показана ее перспективность по сравнению с методами, описанными ранее .

Биологические исследования взаимосвязи структура-активность в ряду полученных поликатионных амфифилов выявили соединения, обладающие высокой трансфицирующей активностью .

Практическая значимость работы Разработан универсальный метод синтеза катионных амфифилов на основе реакции Фукуямы, который характеризуется высокими выходами и хорошей масштабируемостью. Применение этого метода позволило получить набор поликатионных амфифилов различной структуры в количествах, достаточных для проведения исследований по установлению взаимосвязи между строением и биологической активностью. Биологические испытания in vitro позволили выявить амфифилы, обладающие высокой трансфицирующей активностью и низкой токсичностью, которые перспективны для создания липосомальных систем доставки НК в организм млекопитающих с целью лечения наследственных и приобретенных заболеваний .

Основные положения, выносимые на защиту

1. Разработка универсального метода синтеза поликатионных амфифилов на основе холестерина и биогенного амина - спермина, со сложноэфирным, уретановым или кислотолабильным ацетальным линкером .

2. Получение поликатионных амфифилов, содержащих в составе спейсера дисульфидную связь, чувствительную к действию внутриклеточных восстановителей .

3. Изучение биологической активности поликатионных амфифилов в экспериментах in vitro .

Апробация работы Основные результаты работы доложены на ХІП Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Москва, 2007), на Ш Международной конференции «Фундаментальные науки - медицине» (Новосибирск, 2007), на XV Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2008» (Москва, 2008), на V Международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития»

(Москва, 2009); на XIII Международной научно-технической конференции «Наукоемкие химические технологии - 2010» (Суздаль, 2010) .

Публикации По результатам диссертации опубликовано 10 печатных работ, в том числе 2 статьи в ведущих отечественных научных журналах .

Объем и структура работы Диссертационная работа изложена на страницах машинописного текста и состоит из введения, литературного обзора, обсуждения полученных результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы, включающего -ш источника. Работа проиллюстрирована лО рисунками и содержит схем и у таблиц .

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Для создания поликатионных липофильных агентов трансфекции в качестве основных структурных компонентов нами были выбраны природные нетоксичные соединения холестерин и спермин. Известно, что катионные амфифилы, содержащие в качестве гидрофобного остатка холестерин, обладают высокой трансфицирующей активностью, низкой токсичностью и применяются для исследования механизмов слияния искусственных мембран и структурно-функционального изучения сформированных на их основе липоплексов. Природные полиамины, в том числе спермин, способны упаковывать ДНК в тороидальные и стержневые структуры, при этом метиленовые фрагменты, разделяющие атомы азота, играют важную роль во взаимодействии полиамина с двойной спиралью ДНК .

Среди липофильных полиаминов производные спермина наиболее эффективно связывают и упаковывают ДНК и поэтому лучше переносят ее в клетки. На основе спермина были созданы коммерческие препараты для трансфекции. Спермин также является удобным синтоном для получения гемини-сурфактантов, которые характеризуются наличием двух заряженных «головок» и двух гидрофобных доменов, связанных жестким или гибким спейсером .

В литературе описано несколько подходов к получению поликатионных амфифилов, гидрофобная часть которых связана с полиамином посредством спейсеров различной длины. Большинство методов основано на первоначальном присоединении спейсерной группы к полиаминной матрице, после чего полученный фрагмент связывают с активированной гидрофобной составляющей .

Альтернативный подход к синтезу новых поликатионных амфифилов, предложенный нами, подразумевает первоначальное присоединение спейсерной группы к гидрофобной компоненте и последующую конденсацию с полиамином (схема 1) .

–  –  –

На первом этапе осуществляется синтез региоселективно защищенных производных спермина, поскольку полифункциональность молекулы требует избирательной модификации концевой NH2-rpyrmbi для однозначного протекания последующей конденсации с гидрофобным доменом. На втором этапе проводится получение производных холестерина, в которых спейсерная группа соединена со стероидным остовом уретановой, сложноэфирной или ацетальной связью. На последнем этапе осуществляется конденсация холестериновой и сперминовой компонент и последующее удаление защитных групп .

Для конденсации сперминовой и холестериновой компонент нами были выбраны реакции, позволяющие проводить синтез в мягких условиях с высокими выходами. В синтезе поликатионных амфифилов с алкильным спейсером использовалась реакция Фукуямы - алкилирование 2-нитробензолсульфонамидов, полученных из первичных аминов, алкилгалогенидами с последующим удалением 2-нитробензолсульфонильной группы и образованием вторичных аминов (схема 2) .

Схема 2 R'NR

–  –  –

1. Получение избирательно защищенных производных спермина Согласно выбранной стратегии синтеза на первом этапе необходимо было получить защищенные производные спермина. Для создания несимметричных поликатионных амфифилов, исходя из спермина (1), были получены производные 5а,Ь и 8 путем региоселективного введения и удаления защитных групп (схема 4) .

Выбор защитных групп был сделан с учетом условий проведения последующих реакций конденсации. Так, для синтеза амфифилов со сложноэфирной и уретановой связью, осуществляемого в основной среде, использовалась /ире/я-бутоксикарбонильная (Вое) защитная группа, стабильная в основных условиях, но легко удаляемая в кислых. Для синтеза амфифилов с кислотолабильными ацетальными связями использовали бещилоксикарбонильную (Cbz) защиту, легко удаляемую каталитическим гидрогенолизом .

Схема 4

–  –  –

7(86%) a - CF3COOEt, -70-80 °C; b - Вос20 или CbzCl/Et3N, -10 °C; с - NaOH, 25 °C;

d- 2-N02C6H4S02Cl, EtjN, 0 °C; e - BrCH2COOMe, Cs2C03,60 ° C ; / - PhSH, K2C03, 25 °C;

g - NaOH, 25 °C, 3% водный раствор НС1 .

Для получения три-Вос и три-СЬг-защищениых производных спермина 4а,Ь (схема 4) первоначально проводили региоселективное моноацилирование первичной аминогруппы в молекуле спермина (1) действием эквимолярного количества этилтрифторацетата при -70С, а через 1 ч проведения реакции осуществляли блокирование остальных свободных аминогрупп ди-т/е/й-бутилпирокарбонатом либо бензилоксикарбонилхлоридом, при этом получали полностью защищенные производные спермина За,Ь. Последующее селективное удаление трифторацетильной защиты действием водного раствора гидроксида натрия приводило к образованию соединений 4а,Ь, которые содержат свободную первичную аминогруппу, что необходимо для дальнейшего связывания с производными холестерина .

Для осуществления на последнем этапе синтеза реакции Фукуямы проводили Nсульфонилирование соединений 4а,Ь действием 1.2-кратного избытка 2нитробензолсульфонилхлорида в присутствии триэтиламина. Амиды 5а,Ь были выделены с выходами 88 и 91%, соответственно, а их структуры подтверждены данными спектроскопии ЯМР. Появление сигналов ароматических протонов в районе 7.5-8.3 м.д. свидетельствует о наличии в молекулах 5а,Ь 2-нитробензолсульфонильной группы .

Для синтеза тетракатионного дисульфидного амфифила с амидной связью между остатком спермина и спейсерной группой (схема 3), необходимо было получить карбоксильное производное спермина 8. Для этого проводили алкилирование соединения 5а метиловым эфиром бромуксусной кислоты в присутствии карбоната цезия (схема 4) .

Удаление метальной и 2-нитробензолсульфонилъной защитных групп в соединении б осуществлялось в различной последовательности. В первом варианте сначала удаляли 2нитробензолсульфонильную группу действием тиофенола в ДМФА, образующийся при этом вторичный амин 7 был выделен с выходом 86%. Последующее омыление метилового эфира раствором гидроксида натрия давало соединение 8 с количественным выходом и не требовало дополнительной очистки. Во втором варианте сначала осуществляли омыление метилового эфира, а затем удаление 2-нитробензолсульфонильной группы. В этом случае целевой продукт 8 был загрязнен дифенилсульфидом, а высокая полярность соединения 8 затрудняет его хроматографическое выделение. В связи с этим в дальнейшем предпочтение было отдано первому варианту .

Для синтеза поликатионных амфифилов, относящихся к классу гемини-сурфактантов, необходимо было получить симметричное производное спермина 12 (схема 5) .

–  –  –

а - CF3COOEt, О °С; b - Вос20,0 °С; с - NaOH, 25 "С; d - 2-N02C6H4S02Cl, Et3N, О °С .

Спермин (1) обрабатывали 2-кратным избытком этилтрифторацетата для защиты первичных аминогрупп, после чего блокировали оставшиеся аминогруппы действием дитлрет-бутшширокарбоната, получая полностью защищенное производное спермина 10 .

После удаления трифторацетильных групп получили частично защищенный полиамин 11, содержащий две свободные первичные аминогруппы. Далее проводили У-сульфонилирование производного 11 2-нитробензолсульфонидхлоридом с образованием соединения 12 с выходом 78% .

Таким образом, нами были получены симметрично и несимметрично защищенные производные спермина 5а,Ь, 8 и 12 для дальнейшего синтеза целевых поликатионных амфифилов .

2. Получение пронзводпых холестерина с различными линкерными группами Для синтеза поликатионных амфифилов со сложноэфирным, уретановым и ацетальным линкерами нами была выбрана реакция Фукуямы - взаимодействие 2нитробензолсульфонамццных производных спермина с галогенпроизводными холестерина (схема 2). В соответствии с заложенной стратегией синтеза, на втором этапе необходимо было ввести в молекулу холестерина галогенсодержащую спейсерную группу путем создания между ними сложноэфирной, уретановой или ацетальной связи. Для получения поликатионных амфифилов с дисульфидной связью (схема 3) требовалось синтезировать производные холестерина, содержащие на конце спейсера амино- и карбоксильную группу .

–  –  –

- Х ^ а - Вг(СН2)4СОС1, Ру, О °С; 6 - CDI, Et3N, 40 °С; с - НО(СН2)„Ш2, n = 4, 6,40 °С;

rf-CBr4,Ph,P, 25 °С .

Для создания соединений с уретановой связью на первой стадии холестерин (13) обрабатывали 1.1-кратным избытком 1,Г-карбониддиимидазола (CDI), получая имидазолид 15, дальнейшее взаимодействие которого с 4-аминобутанолом или 6-аминогексанолом давало гидроксипроизводные 16а,Ь. Нуклеофильное замещение гидроксильнои группы на атом брома действием избытка тетрабромметана в присутствии трифенилфосфина приводило к бромидам 17а,Ь с высокими выходами. Структура полученных соединений была подтверждена данными элементного анализа и спектроскопии ЯМР. Так, в спектре ЯМР соединения 17а наблюдалось смещение сигналов ядер СН2Х-группы (СШОН 8Н =

3.59 м.д., 8с = 62.10 м.д.) в сильное поле (СН2Вг 5н = 3.34 м.д., 8с = 33.43 м.д.) .

–  –  –

дициклогексилкарбодиимида (DCC), а в качестве катализатора - N,Nдиметиламинопиридина (DMAP) позволило синтезировать производные холестерина со сложноэфирной связью между стероидным остатком и спейсером (схема 8). Варьирование соотношений реагентов показало, что использование 2-кратного избытка дикарбоновых кислот 21а,Ь и 0.5 экв. DMAP приводит к образованию соединений 22а,Ь с наилучшими выходами (67 и 45 %, соответственно). Использование других конденсирующих агентов (Вор1, CDI, Вос20) не привело к увеличению выхода ( 10%) .

Для создания амфифила 23 с уретановым линкером использовали тот же подход, что и при синтезе бромпроизводных холестерина 17а,Ь, а именно взаимодействие имидазолида холестерина 15 с избытком цистамина (схема 8) .

Таким образом, на данном этапе работы были получены производные холестерина, в которых к стероидному остатку посредством сложноэфирного (14, 22а,Ь), уретанового (17а,Ь, 23) или кислотолабильного ацетального линкера (20а-с) присоединены спейсерные группы, отличающиеся количеством метиленовых звеньев и наличием дисульфидной связи .

3. Конденсация холестериновой и спермшювоіі компонент. Получение целевых поликатионных амфифнлов .

Завершающий этап синтеза заключался в конденсации холестериновой и сперминовой компонент и последующим удалении защитных групп .

–  –  –

Bop - гексафторфосфат бензотриазол-1-илокси-трис-(диметиламино)фосфония a - Cs2CO,, DMF, 60 °C; b - PhSH, K2C03, 25 °C; с - 4н HC1 в диоксане, 25 °С .

Реакция проходила гладко за 2 часа, и после хроматографической очистки выходы соединений 24а-с составили 86-94%. Соединения 24а-с охарактеризованы данными массспектрометрии, а также данными 'Н- и 13С-спектроскопии ЯМР. Масс-спектры содержат сигналы молекулярных ионов со значениями масс, соответствующими ожидаемым. Спектры ЯМР представляют собой совокупность сигналов ядер полиаминнои и холестериновой компонент .

При удалении защитных групп сначала проводили десульфонилирование соединений 24а-с действием тиофенола в ДМФА, а затем удаляли Вос-защитные группы в соединениях 25а-с 4н раствором НС1 в диоксане. Целевые амфифилы 26а-с получены с выходами 82-96% на 2 стадии .

Для синтеза амфифилов 29а-с, относящихся к классу гемини-сурфактантов, осуществляли конденсацию бромидов 14,17а,Ь с полиаминным производным 12 (схема 10) в тех же условиях, как и для соединений 24а-с .

Схема 10

–  –  –

a - Cs2C03, DMF, 60 °C; b - PhSH, K2C03, 25 °C; с - 4н HC1 в диоксане, 25 °С .

Для деблокирования аминогрупп в полученных соединениях 27а-с, как и в случае синтеза амфифилов 26а-с сначала удаляли 2-нитробензолсульфонильную группу, а затем Вос-защиту. Гемини-сурфактанты 29а-с получены с выходами 49-76% на 2 стадии .

3.2. Синтез поликатионных амфифилов с ацетильным линкером Для синтеза амфифилов с кислотолабильной ацетальной связью галогенпроизводные холестерина 20а-с вводили во взаимодействие с региоселективно защищенным спермином 5Ь (схема 11) .

Алкилирование защищенного спермина 5Ь бромидом 20а проходило легко и после хроматографической очистки выход соединения 30а составил 94%. В случае хлорпроизводных 20Ь,с из-за их меньшей реакщюнной способности взаимодействие протекало в более жестких условиях (85 °С, 20 ч) и требовало присутствия катализатора тетрабутиламмонийиодида, при этом выходы соединений 30Ь,с составили около 50% .

Удаление 2-нитробензолсульфонилъной группы привело к соединениям 31а-с с выходами от 74 до 97% .

Схема 11

–  –  –

a - Cs2C03, Bu4NtI" в случае соединения 20b,c, DMF, 60-85 °C; b - PhSH, K2C03, 25 °C;

c-10%Pd/C,H 2,25°C .

Для удаления Cbz-защиты нами было опробовано несколько реагентов (триметилсилилиодид, 40% КОН, Na/ЫНз), но только каталитическое восстановление водородом на 5 и 10 % Pd/C приводило к целевым амфифилам 32а-с .

3.3. Получение поликатионных амфифилов с дисулъфидной связью Использованная нами стратегия синтеза поликатионных амфифилов с дисульфидной группой в структуре спейсера основана на образовании амидной связи между производными спермина 4а или 8, с одной стороны и производными холестерина 22а,Ь и 23, с другой .

–  –  –

36(81%) а - TBTU, DffiA, DMF, 25 °C; b - 4н HC1 в диоксане, 25 °C .

Таким образом, в результате проделанной работы нами синтезированы новые амфифилы на основе холестерина и спермина, отличающиеся способом присоединения спермина к гидрофобному домену (сложноэфирная, уретановая, ацетальная, амидная, дисульфидная связь), длиной спейсерного участка, а также количеством катионных аммонийных групп (трпкатионные и тетракатионные амфифилы) и гидрофобных доменов .

4. Биологические исследования поликатионных амфифилов1 Для синтезированных поликатионных амфифилов 26а-с, 29а-с, 34а,Ь, 36 была исследована цитотоксичность и способность переносить нуклеиновые кислоты в эукариотические клетки. Изучение свойств данного ряда соединений позволяет выявить влияние структуры катионных амфифилов на токсичность и трансфицирующую активность .

Были получены липосомальные композиции, состоящие из поликатионных амфифилов и нейтрального лигодда диолеоилфосфатидилэтаноламина (DOPE) в соотношении 1:1 (мольн.) .

Для приготовления липосом использовался метод гидратации липидной пленки с последующей обработкой мультиламеллярной эмульсии в ультразвуковой бане в течение 10-15 мин .

Исследования выполнены в лаборатории биохимии нуклеиновых кислот ИХБФМ СО РАН под руководством д.б.н., проф. М.А. Зенковой

34a: n=1 b:n*2

Результаты исследования на цитотоксичность (МТТ-тест) показали, что вс поликатионные амфифилы в комплексе с DOPE нетоксичны для клеток линий HeLa НЕК293 вплоть до концентрации 40 мкМ, а для клеток ВНК - до 5-10 мкМ. Наличи дисульфидной связи в соединениях 34а,Ь, 36 не влияет на токсичность амфифилов .

В качестве объектов для доставки НК в эукариотические клетки были выбрань короткий 25-звенный меченный флуоресцеином дезоксирибонуклеотид (FITC-ODN) плазмидная ДНК, кодирующая зеленый флуоресцентный белок (pEGFP). Доставку НК клетки регистрировали с помощью проточной цитофлуориметрии. Эксперименты п доставке проводили при варьировании соотношения P/N (количествешюе соотношени отрицательно заряженных фосфатных групп нуклеиновой кислоты к положительн заряженным группам амфифила), поскольку известно, что это соотношение влияет н эффективность трансфекции. Эффективность доставки в клетки оценивали по количеству трансфицированных клеток и по средней интенсивности флуоресценции на клетку популяции .

Эксперименты проводили как в присутствии 10% сыворотки в ростовой среде, так и ее отсутствии, поскольку известно, что наличие сыворотки в среде может влиять н стабильность частиц, образованных амфифилами и на их взаимодействие с клетками .

Эффективность доставки НК в клетки сравнивали с коммерческим препаратом Липофектамин, который является «золотым стандартом» среди липосомальных систем доставки НК .

Для липосомальных композиций, состоящих из соединений 26а-с и геминисурфактантов 29а-с были определены оптимальные соотношения P/N в присутствии и в отсутствие сыворотки крови. Показано, что в отсутствие сыворотки при изменении соотношения P/N количество трансфицированных клеток изменяется незначительно от 75 до 90% (рис. 1А, 2А). Лучшую эффективность среди амфифилов 26а-с показали липосомы на основе соединения с уретановым линкером 26Ь при соотношении P/N = 1 : 1.25 (рис. 1В) .

Приэтом Лилофектамин был менее эффективен, чем липосомы с амфифилами 26а-с .

Lipofeclaraine 26a-DOPE 26b-DOPE 26c-DOPE Lipotectamine 26a-DOPE 26b-DOPE 26c-OOPE Рис. 1. Результаты трансфекции клеток НЕК293 комплексами, состоящими из FITC-ODN и катионпых липосом 26a-c-DOPE в отсутствии сыворотки крови (А,В) .

Результаты, полученные для липосом с гемини-сурфактантами 29а-с, показали, что число трансфицированных клеток в два раза превышает количество клеток, трансфицированных с помощью Липофектамина (рис. 2А). Значения средней интенсивности флуоресценции возрастали с увеличением соотношения P/N (рис. 2В). Максимальные интенсивности флуоресценции были зафиксированы при P/N = 1:4 для амфифилов 29а и P/N = 1:3 для 29с с сложноэфирной и уретановой связью и длиной спейсера 4 и 6 метиленовых звеньев, соответственно. Гемини-сурфактант 29Ь обладал небольшой способностью доставлять FITC-ODN в клетки (рис. 2В) .

–  –  –

Lipofectamine 2Sa-D0PE 29b-DOPE 29c-DOPE Lipofectamine 29a-DOPE 29b-DOPE 29c-DOPE Рис. 2. Результаты трансфгкции клеток НЕК293 комплексами, состоящими из FlTC-ODN\ и катионных липосом 29a-c-DOPE в отсутствие (А,В) и в присутствии 10% сыворотки (CD) .

Введение в ростовую среду 10% сыворотки крови снижало эффективность доставки олнгонуклеотида а 2-7 раз в случае соединений 26а-с (данные не представлены) .

Наибольшее значение интенсивности флуоресценции на клетку наблюдалось для липосом I 26b-DOPE при соотношении P/N = 1 : 2. Количество трансфицированных клеток снижалось I при высоких соотношениях P/N в случае гемини-амфифилов 29Ь,с и не изменялось для амфифила 29а (кроме P/N = 1 : 1 ) (рис. 2С). Однако значения средней интенсивности флуоресценции на клетку (то есть количества переносимого в клетки FITC-ODN) существенно уменьшалось для соединения со сложноэфирным линкером 29а (рис. 2D), что говорит об ингибирующем действии сыворотки на трансфицирующую активность этого амфифила, Таким образом, наличие в структуре амфифила уретанового линкера желательно для проведения трансфекции в условиях, приближающихся к in vivo .

г Для изучения влияния структуры амфифила на доставку в клетки плазмидной ДНК были выбраны поликатионные соединения с уретановым линкером и разным количеством гидрофобных доменов 26Ь и 29с, показавшие наибольшую эффективность транспорта FITCODN, а также дисульфидные поликатионные амфифилы 34а,Ь и 36. Результаты трансфекции клеток НЕК293 в отсутствие сыворотки показали, что дисульфидные трикатионные амфифилы со сложноэфирной связью 34а,Ь неэффективно доставляют ДНК в клетки (рис. ЗА,В). Для тетракатионных амфифилов с уретановым линкером 26Ь и 36 наблюдали увеличение эффективности доставки ДНК с увеличением количества катионного амфифила в НК-липидном комплексе. Наибольшее количество трансфицированных клеток было зафиксировано для гемини-сурфактанта 29с при P/N = 1 : 4, а дальнейшее увеличение количества гемини-сурфактанта приводило к снижению эффективности доставки .

Проведение трансфекции в присутствии сыворотки крови вызывало уменьшение количества трансфицированных клеток, при этом максимальные значения наблюдались при соотношении P/N = 1 : 6 (рис. ЗС). Гемини-сурфактант 29с трансфицировал наибольшее количество клеток (рис. ЗС), а максимальное значение средней интенсивности флуоресценции наблюдали в случае соединения 26Ь (рис. 3D) .

–  –  –

,i«wmine 7St. 0 OPE 2 a,.DOPE ^OOPEya-DOPEjAb-DOPE upotedamtaejgc-DOPEjei-COPE 36.OOPEya.DOPEjtb.DOPE Рис. 3. Результаты трансфекции клеток НЕК293 комплексами, включающими pDNA катионные композиции из липидов 26Ь, 29с, 34а,Ь, 36 и DOPE в отсутствие (А,В) и присутствии 10% сыворотки (C,D) .

По сравнению с соединениями 26Ь и 29с дисульфидный амфифил 36 трансфициров меньшее количество клеток (рис. ЗС), но среднее значение интенсивности флуоресценци зеленого флуоресцентного белка при использовании соединения 36 (рис. 3D) было сравним или превышало интенсивность флуоресценции, наблюдаемую для комплексов на осно соединений 26Ь и 29с. Следовательно, при худшем проникновении комплекса наблюдаете повышенная экспрессия зеленого флуоресцентного белка, что вероятно обусловлен разрушением дисульфидных связей в молекулах амфифила 36 под действиевнутриклеточных восстановителей и более эффективным высвобождением ДНК .

Таким образом, в результате проведенных биологических испытаний было показан что для эффективной трансфекции в структуре катиоішого амфифила желательно имет линкер уретанового типа и тетракатионную полярную группировку. Гемини-сурфактант 29 является наиболее активным трансфектантом. Наличие дисульфидной связи в молекул амфифила приводит к увеличению доставки плазмидной ДНК в эукариотические клетки .

Выводы:

1. Разработана новая универсальная схема синтеза поликатионных амфифилов, н основе холестерина и спермина, предназначенных для доставки генетического материала эукариотические клетки .

2. Синтезирован ряд поликатионных амфифилов, отличающихся линкеров (сложноэфирный, уретановый), длиной спейсера и количеством гидрофобных доменов .

3. Синтезированы кислотолабильные поликатионные амфифилы ацетального типа н основе холестерина и спермина .

4. Впервые получены дисульфидные поликатионные липиды на основе холестерина спермина, чувствительные к действию внутриклеточных восстановителей .

5. Биологические испытания показали, что липосомальные композиции на основ амфифилов с уретановым линкером 26Ь и 29с обладают высокой эффективностью доставк коротких и протяженных НК в клетки млекопитающих, как в присутствии, так и отсутствие сыворотки в ростовой среде, что позволяет рассматривать их в качеств перспективных коммерческих агентов трансфекции .

6. Показано, что включение в состав амфифилов дисульфидной связи ведет увеличению эффективности трансфекции .

Основные результаты работы изложены в следующих публикациях:

1. Петухов И.А., Маслов М.А., Морозова Н.Г., Серебренникова Г.А. / Синтез поликатионных липидов на основе холестерина и спермина // Известия АН. Сер .

Химическая, 2010, Т. 1, С. 254-261 .

2. Petukhov I.A., Maslov M.A., Morozova N.G. and Serebrennikova G.A. / Convenient synthesis of polycationic amphiphiles by the Fukuyama reaction // Mendeleev Commun., 2009, V .

19, P. 250-252

3. Петухов И.А., Маслов М.А., Морозова Н.Г., Серебренникова Г.А. / Оптимизация синтеза поликатионных липоидов с ацетальными связями // Тезисы докладов ХШ Международной научно-технической конференции «Наукоемкие химические технологии Суздаль, 2010, С. 190 .

4. Петухов И.А., Маслов М.А. / Создание липидных медиаторов трансфекции на основе биогенной полиаминной матрицы // Тезисы докладов Пятого международного конфесса «Биотехнология: состояние и перспективы развития», Москва, 2009, С. 187-188 .

5. Петухов И.А., Маслов М.А., Морозова Н.Г., Серебренникова Г.А. / Синтез холестеринсодержащих поликатионных липидов с ацетальными связями // Тезисы докладов Ш молодежной научно-технической конференции «Наукоемкие химические технологииМосква, 2009, С. 46 .

6. Петухов И.А., Маслов М.А., Морозова Н.Г., Серебренникова Г.А. / Синтез и изучение свойств липофильных поликатионных агентов трансфекции // Тезисы докладов XV Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2008», Москва, 2008, С. 286 .

7. Петухов И.А., Маслов М.А., Морозова Н.Г., Серебренникова Г.А. / Лшіофильные производные спермина для трансфекции эукариотических клеток // Тезисы докладов XDC зимней молодежной научной школы «Перспективыные направления физико-химической биологии и биотехнологии», Москва, 2007, С. 17 .

8. Петухов И.А., Маслов М.А., Морозова Н.Г., Серебренникова Г.А. / Новые коньюгаты спермина и холестерина для переноса ДНК в эукариотические клетки // Тезисы докладов ХШ Менделеевского съезда по общей и прикладной химии, Москва, 2007, С. 2164 .

9. Маслов М.А., Петухов И.А., Морозова Н.Г., Серебренникова Г.А. / Липофильные полиамины для доставки генетического материала // Тезисы докладов 3 Международной конференция «Фундаментальные науки - медицине», Новосибирск, 2007, С. 149 .

10. Петухов И.А., Маслов М.А., Морозова Н.Г., Серебренникова Г.А. / Синтез холестеринсодержащих амфифилов для транспорта олигонуклеотидов в клетки эукариот // Тезисы докладов II молодежной научно-технической конференций «Наукоемкие химические технологии», Москва, 2007, С. 52 .






Похожие работы:

«Ископаемые водоросли УДК 551.77:561.26(265.2) В.С. ПУШКАРЬ1,3, М.В. ЧЕРЕПАНОВА2, О.Ю. ЛИХАЧЕВА1 Дальневосточный геологический ин-т ДВО РАН, пр. 100-летия Владивостока, 159, Владивосток 69...»

«z R \m ?ппп Ha правах рукоппси ВЯТКШ! Александр Иванович РОД К Р А С О Д Н Е В (HE.MEROCALLIS L, BCtJEIlPH 03 00.05 -"Ботаника" АВТОРЕФЕРАТ диссертации, на соискание ученой степени кандидата биологических наук Q \J Новосибирск 2000 Работа выполнена в Центральном сибирском ботаническом саду СО РАН. Научный руковод...»

«СУХОВА Инна Витальевна I БИОХИМИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ В СПЕРМЕ I ЧЕЛОВЕКА ПОД ВЛИЯНИЕМ ЭЛЕКТРОМАГНИТНОГО ИЗЛУЧЕНИЯ МИЛЛИМЕТРОВОГО ДИАПАЗОНА 03.00.04 биохимия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва 2005 Работа выполне...»

«ШОРИНА Марина  Владимировна АККУМУЛЯЦИЯ КАДАВЕРИНА И ЕГО ФИЗИОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ ПРИ ДЕЙСТВИИ СОЛЕВОГО СТРЕССА 03.00.12 - "физиология и биохимия растений" АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соиск...»

«УДК 595.726 ХУДЯКОВА Надежда Ефремовна ПРЯМОКРЫЛЫЕ НАСЕКОМЫЕ (ORTHOPTERA) СЕВЕРНОГО АЛТАЯ (ФАУНА, СЕЗОННАЯ ДИНАМИКА И ХАРАКТЕР РАСПРЕДЕЛЕНИЯ СООБЩЕСТВ) 03.00.09 Энтомология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата био...»

«ЧТЕНИЯ ПАМЯТИ ВЛАДИМИРА ЯКОВЛЕВИЧА ЛЕВАНИДОВА Vladimir Ya. Levanidov's Biennial Memorial Meetings 2003 Вып. 2 ЛИЧИНКИ ПАЛЕАРКТИЧЕСКИХ ВИДОВ РОДА HAPLOPERLA NAVAS (PLECOPTERA, CHLOROPERLIDAE). В.А.Тесленко1, Л.А.Жильцова2 Биолого-почвенный институт ДВО РАН, пр. 100 лет Владивостоку, 159, Влад...»

«Экосистемы. 2016. Вып. 8. С. 59–62 УДК 502.75 ДИНАМИКА ВОЗРАСТНОЙ СТРУКТУРЫ ПРОСТРЕЛА ЛУГОВОГО (PULSATILLA PRATENSIS MILL.) В БАЛАШОВСКОМ РАЙОНЕ САРАТОВСКОЙ ОБЛАСТИ Шаповалова А. А. Балашовский институт Саратовского национального государственного исследовательского университета, Балашов, kupena07@rambler.ru В 2013–2016 гг. поведено изуч...»

«На  равах  укописи п р БЛГИРОВ Вугар Алинияз оглы БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ  АСПЕКТЫ  СОХРАНЕНИЯ ГЕНЕТИЧЕСКИХ РЕСУРСОВ ЖИВОТНЫХ 03.00.23 - Биотехнология 03.00.13 - Физиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Дубровицы - 2004 Работа  выполнена  в  отделе  биотехнолог...»







 
2018 www.lit.i-docx.ru - «Бесплатная электронная библиотека - различные публикации»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.